Name: extracellular glucose depletion as an indirect measure of glucose uptake in cells and tissues ex vivo
Uploaded: 2022-04-06T14:20:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Extracellular Glucose Depletion as an Indirect Measure of Glucose Uptake in Cells and Tissues Ex Vivo at JoVE.com

Projektet blev støttet af Ralph og Marian Falk Medical Research Catalyst Award og Kathleen Kelly Award. Andre støtter omfattede National Center for Research Resources UL1RR025755 og NCI P30CA16058 (OSUCCC), NIH Roadmap for Medical Research. Indholdet er udelukkende forfatternes ansvar og repræsenterer ikke de officielle synspunkter fra National Center for Research Resources eller NIH.

Dyreforsøg blev godkendt af Institutional Animal Care and Use Committee ved Ohio State University (OSU, protokol 2007A0262-R4).
BEMÆRK: Alle procedurer skal udføres i et klasse II biosikkerhedsskab med blæseren tændt og lyset slukket.
1. Forberedelse af materialer
BEMÆRK: Alle materialer er angivet i materialetabellen.
<ol><li>Der fremstilles medium 1, centrifugeringsmedium 2 og opbevarings- og ar...

<ol>
	<li>Kyrtata, N., Emsley, H. C. A., Sparasci, O., Parkes, L. M., Dickie, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+systematic+review+of+glucose+transport+alterations+in+Alzheimer's+disease.">A systematic review of glucose transport alterations in Alzheimer's disease.</a> Frontiers in Neuroscience. 15, 568 (2021).</li><li>Garcia-Carbonell, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Critical+role+of+glucose+metabolism+in+rheumatoid+arthritis+fibroblast-like+synoviocytes.">Critical role of glucose metabolism in rheumatoid arthritis fibroblast-like synoviocytes.</a> Arthritis Rheumatology. 68 (7), 1614-1626 (2016).</li><li>Kumar, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Is+diabetes+mellitus+associated+with+mortality+and+severity+of+COVID-19?+A+meta-analysis.">Is diabetes mellitus associated with mortality and severity of COVID-19? A meta-analysis.</a> Diabetes &amp; Metabolic Syndrome: Clinical Research &amp; Review. 14 (4), 535-545 (2020).</li><li>Lee, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Different+prognostic+impact+of+glucose+uptake+in+visceral+adipose+tissue+according+to+sex+in+patients+with+colorectal+cancer.">Different prognostic impact of glucose uptake in visceral adipose tissue according to sex in patients with colorectal cancer.</a> Scientific Reports. 11 (1), 21556 (2021).</li><li>Miner, M. W. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of:+(2S,4R)-4-[(18)F]Fluoroglutamine,+[(11)C]Methionine,+and+2-Deoxy-2-[(18)F]Fluoro-D-Glucose+and+two+small-animal+PET/CT+systems+imaging+rat+gliomas.">Comparison of: (2S,4R)-4-[(18)F]Fluoroglutamine, [(11)C]Methionine, and 2-Deoxy-2-[(18)F]Fluoro-D-Glucose and two small-animal PET/CT systems imaging rat gliomas.</a> Frontiers in Oncology. 11 (18), 730358 (2021).</li><li>Gumbiner, B., Thorburn, A. W., Ditzler, T. M., Bulacan, F., Henry, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+impaired+intracellular+glucose+metabolism+in+the+insulin+resistance+of+aging.">Role of impaired intracellular glucose metabolism in the insulin resistance of aging.</a> Metabolism. 41 (10), 1115-1121 (1992).</li><li>Ebrahimi, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beta+cell+identity+changes+with+mild+hyperglycemia:+Implications+for+function,+growth,+and+vulnerability.">Beta cell identity changes with mild hyperglycemia: Implications for function, growth, and vulnerability.</a> Molecular Metabolism. 35, 100959 (2020).</li><li>Ruberto, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=KLF10+integrates+circadian+timing+and+sugar+signaling+to+coordinate+hepatic+metabolism.">KLF10 integrates circadian timing and sugar signaling to coordinate hepatic metabolism.</a> Elife. 10, 65574 (2021).</li><li>Stocks, B., Zierath, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Post-translational+modifications:+The+signals+at+the+intersection+of+exercise,+glucose+uptake,+and+insulin+sensitivity.">Post-translational modifications: The signals at the intersection of exercise, glucose uptake, and insulin sensitivity.</a> Endocrinology Reviews. , (2021).</li><li>World Health Organization. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+report+on+diabetes.">Global report on diabetes.</a> World Health Organization. , (2016).</li><li>Kolb, H., Martin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Environmental/lifestyle+factors+in+the+pathogenesis+and+prevention+of+type+2+diabetes.">Environmental/lifestyle factors in the pathogenesis and prevention of type 2 diabetes.</a> BMC Medicine. 15 (1), 131 (2017).</li><li>Galicia-Garcia, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathophysiology+of+type+2+diabetes+mellitus.">Pathophysiology of type 2 diabetes mellitus.</a> International Journal of Molecular Science. 21 (17), 6275 (2020).</li><li>Petrov, M. S., Basina, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DIAGNOSIS+OF+ENDOCRINE+DISEASE:+Diagnosing+and+classifying+diabetes+in+diseases+of+the+exocrine+pancreas.">DIAGNOSIS OF ENDOCRINE DISEASE: Diagnosing and classifying diabetes in diseases of the exocrine pancreas.</a> European Journal of Endocrinology. 184 (4), 151-163 (2021).</li><li>Sirdah, M. M., Reading, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+predisposition+in+type+2+diabetes:+A+promising+approach+toward+a+personalized+management+of+diabetes.">Genetic predisposition in type 2 diabetes: A promising approach toward a personalized management of diabetes.</a> Clinical Genetics. 98 (6), 525-547 (2020).</li><li>Ramos-Lopez, O., Milagro, F. I., Riezu-Boj, J. I., Martinez, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetic+signatures+underlying+inflammation:+an+interplay+of+nutrition,+physical+activity,+metabolic+diseases,+and+environmental+factors+for+personalized+nutrition.">Epigenetic signatures underlying inflammation: an interplay of nutrition, physical activity, metabolic diseases, and environmental factors for personalized nutrition.</a> Inflammation Research. 70 (1), 29-49 (2021).</li><li>Yamamoto, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+glucose+uptake+in+cultured+cells.">Measurement of glucose uptake in cultured cells.</a> Current Protocols in Pharmacology. 71 (1), 12-14 (2015).</li><li>Yang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+sensitive+and+simple+HPLC-FLD-based+method+for+the+measurement+of+intracellular+glucose+uptake.">A sensitive and simple HPLC-FLD-based method for the measurement of intracellular glucose uptake.</a> Food Chemistry. 372, 131218 (2021).</li><li>Lee, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amino+acid-based+compound+activates+atypical+PKC+and+leptin+receptor+pathways+to+improve+glycemia+and+anxiety+like+behavior+in+diabetic+mice.">Amino acid-based compound activates atypical PKC and leptin receptor pathways to improve glycemia and anxiety like behavior in diabetic mice.</a> Biomaterials. 239, 119839 (2020).</li><li>Shukla, S. K., Mulder, S. E., Singh, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypoxia-mediated+in+vivo+tumor+glucose+uptake+measurement+and+analysis.">Hypoxia-mediated in vivo tumor glucose uptake measurement and analysis.</a> Methods in Molecular Biology. 1742, 107-113 (2018).</li><li>Jakson, I., Ujvari, D., Brusell Gidlof, S., Linden Hirschberg, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insulin+regulation+of+solute+carrier+family+2+member+1+(glucose+transporter+1)+expression+and+glucose+uptake+in+decidualizing+human+endometrial+stromal+cells:+an+in+vitro+study.">Insulin regulation of solute carrier family 2 member 1 (glucose transporter 1) expression and glucose uptake in decidualizing human endometrial stromal cells: an in vitro study.</a> Reproductive Biology and Endocrinology. 18 (1), 117 (2020).</li><li>Saparbaev, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+quantification+of+any+isoforms+of+carbohydrates+by+2D+UV-MS+fingerprinting+of+cold+ions.">Identification and quantification of any isoforms of carbohydrates by 2D UV-MS fingerprinting of cold ions.</a> Analytical Chemistry. 92 (21), 14624-14632 (2020).</li><li>Schulz, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+metabolomics+of+pellicle+and+saliva+in+children+with+different+caries+activity.">Targeted metabolomics of pellicle and saliva in children with different caries activity.</a> Scientific Reports. 10 (1), 697 (2020).</li><li>Shulman, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+magnetic+resonance+studies+of+glucose+metabolism+in+non-insulin-dependent+diabetes+mellitus+subjects.">Nuclear magnetic resonance studies of glucose metabolism in non-insulin-dependent diabetes mellitus subjects.</a> Molecular Medicine. 2 (5), 533-540 (1996).</li><li>Cochran, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+PET+imaging+with+[(18)F]FDG+to+explain+improved+glucose+uptake+in+an+apolipoprotein+A-I+treated+mouse+model+of+diabetes.">In vivo PET imaging with [(18)F]FDG to explain improved glucose uptake in an apolipoprotein A-I treated mouse model of diabetes.</a> Diabetologia. 59 (18), 1977-1984 (2016).</li><li>Lloyd, P. G., Hardin, C. D., Sturek, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Examining+glucose+transport+in+single+vascular+smooth+muscle+cells+with+a+fluorescent+glucose+analog.">Examining glucose transport in single vascular smooth muscle cells with a fluorescent glucose analog.</a> Physiological Research. 48 (6), 401-410 (1999).</li><li>Beeton, C., Garcia, A., Chandy, K. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drawing+blood+from+rats+through+the+saphenous+vein+and+by+cardiac+puncture.">Drawing blood from rats through the saphenous vein and by cardiac puncture.</a> Journal of Visualized Experiments. (7), e266 (2007).</li><li>DiSilvestro, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leptin+production+by+encapsulated+adipocytes+increases+brown+fat,+decreases+resistin,+and+improves+glucose+intolerance+in+obese+mice.">Leptin production by encapsulated adipocytes increases brown fat, decreases resistin, and improves glucose intolerance in obese mice.</a> PLoS One. 11 (4), 0153198 (2016).</li><li>Friedman, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leptin+and+the+endocrine+control+of+energy+balance.">Leptin and the endocrine control of energy balance.</a> Nature Metabolism. 1 (8), 754-764 (2019).</li><li>Guillam, M. T., Burcelin, R., Thorens, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Normal+hepatic+glucose+production+in+the+absence+of+GLUT2+reveals+an+alternative+pathway+for+glucose+release+from+hepatocytes.">Normal hepatic glucose production in the absence of GLUT2 reveals an alternative pathway for glucose release from hepatocytes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 95 (21), 12317-12321 (1998).</li><li>Guillam, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+diabetes+and+abnormal+postnatal+pancreatic+islet+development+in+mice+lacking+Glut-2.">Early diabetes and abnormal postnatal pancreatic islet development in mice lacking Glut-2.</a> Nature Genetics. 17 (3), 327-330 (1997).</li><li>Barros, L. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetic+validation+of+6-NBDG+as+a+probe+for+the+glucose+transporter+GLUT1+in+astrocytes.">Kinetic validation of 6-NBDG as a probe for the glucose transporter GLUT1 in astrocytes.</a> Journal of Neurochemistry. 109, 94-100 (2009).</li><li>Sprinz, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+blood+glucose+level+on+18F-FDG+uptake+for+PET/CT+in+normal+organs:+A+systematic+review.">Effects of blood glucose level on 18F-FDG uptake for PET/CT in normal organs: A systematic review.</a> PLoS One. 13 (2), 0193140 (2018).</li><li>Johnson, T. V., Martin, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+characterization+of+an+adult+retinal+explant+organotypic+tissue+culture+system+as+an+in+vitro+intraocular+stem+cell+transplantation+model.">Development and characterization of an adult retinal explant organotypic tissue culture system as an in vitro intraocular stem cell transplantation model.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 49 (8), 3503-3512 (2008).</li><li>de Urquiza, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Docosahexaenoic+acid,+a+ligand+for+the+retinoid+X+receptor+in+mouse+brain.">Docosahexaenoic acid, a ligand for the retinoid X receptor in mouse brain.</a> Science. 290 (5499), 2140-2144 (2000).</li><li>Olson, A. L., Pessin, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure,+function,+and+regulation+of+the+mammalian+facilitative+glucose+transporter+gene+family.">Structure, function, and regulation of the mammalian facilitative glucose transporter gene family.</a> Annual Review of Nutrition. 16 (1), 235-256 (1996).</li><li>Muhanna, D., Arnipalli, S. R., Kumar, S. B., Ziouzenkova, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osmotic+adaptation+by+Na(+)-dependent+transporters+and+ACE2:+correlation+with+hemostatic+crisis+in+COVID-19.">Osmotic adaptation by Na(+)-dependent transporters and ACE2: correlation with hemostatic crisis in COVID-19.</a> Biomedicines. 8 (11), 460 (2020).</li><li>Ligasova, A., Koberna, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+dyes-highly+sensitive+reporters+of+cell+quantification:+comparison+with+other+cell+quantification+methods.">DNA dyes-highly sensitive reporters of cell quantification: comparison with other cell quantification methods.</a> Molecules. 26 (18), 5515 (2021).</li><li>DeFronzo, R. A., Tobin, J. D., Andres, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glucose+clamp+technique:+a+method+for+quantifying+insulin+secretion+and+resistance.">Glucose clamp technique: a method for quantifying insulin secretion and resistance.</a> American Journal of Physiology. 237 (3), 214-223 (1979).</li></ol>

Den direkte sammenligning af ekstracellulær FD-glucose udtømning med normaliseret intracellulær glukoseoptagelse i cellekultur viste en høj korrelation, hvilket tyder på, at ekstracellulær glukoseudtømning kunne være en surrogatmåling til vurdering af glukoseoptagelse. Målingen af ekstracellulær FD-glucose kan anvende en bred vifte af FD-glucosekoncentrationer, også 0,5-2,5 μg FD-glucose / ml synes at give det optimale interval. Ekstracellulær FD-glucose kræver ikke normalisering til celleantal eller prote...

Efterspørgslen efter måling af glukoseoptagelse stiger sammen med det kritiske behov for at tackle en epidemisk stigning i en lang række sygdomme, der er afhængige af glukosemetabolisme. Underliggende mekanismer for degenerative metaboliske sygdomme, neurologiske og kognitive lidelser1,inflammatoriske 2 og infektionssygdomme3, kræft 4,5 samt aldring6 afhænger af glukosemetabolisme til energi og dens opbevaring, anabolske processer, protein og genmodifikation, signalering, regulering af gener og nukleinsyresyntese og replikation 7,8,9 . Diabetes mellitus (DM) er direkte relateret til funktionsfejl i glukoseoptagelsesregulering. DM er et spektrum af kroniske sygdomme som type-1, -2 og -3 diabetes mellitus, svangerskabsdiabetes, modenhedsdiabetes hos de unge og andre typer af denne sygdom induceret af miljømæssige og / eller genetiske faktorer. I 2016 viste den første WHO Global-rapport om diabetes, at antallet af voksne, der lever med den mest udbredte DM, næsten er firedoblet siden 1980 til 422 millioner voksne10, og dette antal DM-patienter er steget eksponentielt i de sidste par årtier. Alene i 2019 var et skøn på 1,5 millioner dødsfald direkte forårsaget af DM10. Denne dramatiske stigning skyldes stigningen i type-2 DM og de forhold, der driver den, herunder overvægt og fedme10. COVID-19-pandemien afslørede en dobbelt stigning i dødeligheden hos patienter med DM sammenlignet med den generelle befolkning, hvilket tyder på den dybe, men dårligt forståede rolle, som glukosemetabolisme spiller i immunforsvaret3. Forebyggelse, tidlig diagnose og behandling af DM, fedme og andre sygdomme kræver optimering af målinger af glukoseoptagelse af forskellige væv og identifikation af miljømæssige11, ernæringsmæssige12, endokrine13, genetiske14 og epigenetiske15 faktorer, der påvirker glukoseoptagelsen.
I forskning måles intracellulær og / eller vævsoptagelse af glucose almindeligvis ved fluorescerende mærket glucose (FD-glucose) in vitro 16,17,18 og in vivo19. FD-glucose blev en foretrukken metode sammenlignet med mere præcise metoder ved anvendelse af radioaktivt mærket glucose20, analytisk massespektroskopianalyse21, metabolomics22, nukleare magnetiske resonansmetoder23 og positronemissionstomografi / computertomografi (PET / CT) 5,24. I modsætning til FD-glukoseoptagelse kan analytiske metoder, der kræver mere biologisk materiale, involvere en flertrins prøveforberedelse, dyre instrumenter og kompleks dataanalyse. Effektive og billige målinger af FD-glukoseoptagelse i cellekulturer er blevet anvendt i proof-of-concept eksperimenter og kan kræve validering ved andre metoder.
Grundlaget for FD-glucoseapplikation til glukoseoptagelsesundersøgelser er den reducerede metabolisme af FD-glucose sammenlignet med endogen glucose25. Ikke desto mindre er både endogen glucose og FD-glucose dynamisk fordelt mellem alle cellulære rum til brug i anabolske, kataboliske og signalprocesser. Compartmentalisering og tidsafhængig behandling25 af FD-glucose interfererer med fluorescensmålingerne og repræsenterer de vigtigste begrænsende faktorer for brugen af dette assay i screeningseksperimenter med høj kapacitet, kinetisk analyse, 3D-cellekultur, co-kulturer og vævseksplosive eksperimenter. Her leverer vi data, der viser en høj korrelation mellem den ekstracellulære udtømning af FD-glucose og dens intracellulære optagelse, hvilket tyder på den ekstracellulære udtømning af FD-glucose som en surrogatmåling for intracellulær glukoseoptagelse. Målingen af ekstracellulær udtømning af glucose blev anvendt til at validere vævsspecifikke forskelle i glukoseoptagelse hos mus behandlet med insulin og et eksperimentelt lægemiddel18 for at tilvejebringe et proof-of-principle for denne metode.
Den nuværende protokol beskriver intracellulære og ekstracellulære (figur 1) målinger af FD-glucoseoptagelse i 3T3-L1-celler. Protokolafsnit 1-7 forklarer dyrkning og vækst af celler i 48 timer; celle sult, stimulering og baseline ekstracellulære målinger; og poststimuleringsmålinger af ekstracellulær FD-glucose og intracellulære målinger af FD-glucose og protein. Protokolafsnit 8 beskriver ex vivo-målingen af ekstracellulær optagelse af FD-glucose i væv dissekeret fra ob/ob-mus i nærvær og fravær af insulin og aminosyreforbindelse 2 (AAC2) beskrevet andetsteds18.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>3T3-L1 mouse fibroblasts</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CL-173</td>
			<td>Cell line</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plates</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353227</td>
			<td>Plastic ware</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B6.V-Lepob/J male mice</td>
			<td>Jackson Laboratory</td>
			<td>stock number 000632</td>
			<td>Mice</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BioTek Synergy H1 modular multimode microplate reader (Fisher Scientific, US)</td>
			<td>Fisher Scientific, US</td>
			<td>&#160;B-SHT</td>
			<td>Device</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum</td>
			<td>Gibco/ThermoFisher</td>
			<td>161790-060</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calf serum</td>
			<td>Gibco/ThermoFisher</td>
			<td>26010-066</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell incubator</td>
			<td>Forma</td>
			<td>Series II Water Jacket</td>
			<td>Device</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diet (mouse/rat diet, irradiated)</td>
			<td>Envigo</td>
			<td>Teklad LM-485</td>
			<td>Diet</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethylsulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Sigma LifeScience</td>
			<td>D2650-100mL</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium</td>
			<td>Gibco/ThermoFisher</td>
			<td>&#160;11965-092</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>E7023-500mL</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent 2-deoxy-2-[(7-nitro-2,1,3-benzoxadiazol-4-yl) amino]-D-glucose)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>72987-1MG</td>
			<td>Assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose-free and phenol red-free DMEM</td>
			<td>Gibco/ThermoFisher</td>
			<td>A14430-01</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human insulin 10 mg/mL</td>
			<td>MilliporeSigma, Cat N 91077C</td>
			<td>Cat N 91077C</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane, 5%</td>
			<td>Henry Schein</td>
			<td>NDC 11695-6776-2</td>
			<td>Anestaetic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/streptomycin (P/S)</td>
			<td>Gibco/ThermoFisher</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>DA537-500 mL</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce bicinchoninic acid (BCA) protein assay</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>Cat N23225</td>
			<td>Assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Radioimmunoprecipitation assay lysis buffer</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-24948</td>
			<td>Assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0.05%)</td>
			<td>Gibco/ThermoFisher</td>
			<td>&#160;25300-054</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

extracellular glucose depletion as an indirect measure of glucose uptake in cells and tissues ex vivo

Den igangværende verdensomspændende epidemi af diabetes øger efterspørgslen efter identifikation af miljømæssige, ernæringsmæssige, endokrine, genetiske og epigenetiske faktorer, der påvirker glukoseoptagelsen. Måling af intracellulær fluorescens er en meget anvendt metode til at teste optagelsen af fluorescerende mærket glucose (FD-glucose) i celler in vitro eller til billeddannelse af glukoseforbrugende væv in vivo. Dette assay vurderer glukoseoptagelsen på et valgt tidspunkt. Den intracellulære analyse antager, at metabolismen af FD-glucose er langsommere end for endogen glucose, som deltager i kataboliske og anabolske reaktioner og signalering. Dynamisk glukosemetabolisme ændrer imidlertid også optagelsesmekanismer, hvilket ville kræve kinetiske målinger af glukoseoptagelse som reaktion på forskellige faktorer. Denne artikel beskriver en metode til måling af ekstracellulær FD-glucoseudtømning og validerer dens korrelation med intracellulær FD-glucoseoptagelse i celler og væv ex vivo. Ekstracellulær glucoseudtømning kan potentielt anvendes til kinetiske og dosisafhængige undersøgelser med høj kapacitet samt identifikation af forbindelser med glykæmisk aktivitet og deres vævsspecifikke virkninger.

Intracellulært indtag og ekstracellulær glucoseudtømning blev målt i 3T3-L1 præadipocytter som reaktion på forskellige koncentrationer af FD-glucose (figur 2) med og uden insulinstimulering. Figur 2A viser en dosisafhængig stigning i den intracellulære optagelse af FD-glucose, som blev signifikant øget i nærvær af insulin. Det samtidige fald i ekstracellulær FD-glucose i de samme celler er vist i figur 2B, hvor insulinst...

Watch this Scientific Journal Video about Extracellular Glucose Depletion as an Indirect Measure of Glucose Uptake in Cells and Tissues Ex Vivo at JoVE.com

Extracellular Glucose Depletion as an Indirect Measure of Glucose Uptake in Cells and Tissues Ex Vivo

Ekstracellulær udtømning af fluorescerende mærket glucose korrelerer med glukoseoptagelse og kan bruges til screening med høj kapacitet af glukoseoptagelse i udskårne organer og cellekulturer.

Ekstracellulær glukoseudtømning som et indirekte mål for glukoseoptagelse i celler og væv Ex Vivo

The ongoing worldwide epidemic of diabetes increases the demand for the identification of environmental, nutritional, endocrine, genetic, and epigenetic ...

Glukoseoptagelse er nøglen til at forstå sundhed og sygdom. Da glukose spiller en afgørende rolle i metaboliske og strukturelle krav i menneskekroppen, samt spiller en afgørende rolle i reguleringen. Den ekstracellulære måling af glukose muliggør udvikling af assays med høj kapacitet til kinetik af glukoseoptagelse i celler, væv og organer med forskellig genetisk baggrund som reaktion på næringsstoffer eller lægemidler.Denne analyse ville være et værdifuldt redskab til opdagelse af terapi og ernæring til diabetes, kræft, degenerative sygdomme i centralnervesystemet, fedme og alle sygdomme i glukose og metabolisme. Analysen har brug for en justering af tiden for sult og stimulering, der skal baseres på metaboliske specifikationer for forskellige væv og cellekulturer. Kultur 3T3-L1 musefibroblaster ved at plettere 10 til de 6 celler, fortyndet i 20 ml medium 1 i 296 brøndplader.Plade 100 mikroliter cellesuspension pr. brønd, hvilket sikrer at opretholde homogeniteten af denne suspension ved blanding. Dyrk celler i 48 timer i en 37 grader Celsius inkubator uden at skifte medie indtil ca. 70 til 80% sammenløb. Vedligehold celler sammenflydende og faste ved at dyrke dem i samme medium i 48 timer.Varier inkubationstiden fra 24 til 72 timer afhængigt af den ønskede fastende kataboliske tilstand. Dekanterede medier fra celler i de 96 brøndplader. Absorber den resterende væske ved hjælp af sterile papirhåndklæder.Skyl 96-brøndpladen med 100 mikroliter PBS pr. Brønd, og absorber den resterende væske med sterile papirhåndklæder. Tilsæt 100 mikroliter glukosefri DMEM pr. Brønd, og inkuber i 40 minutter. Juster inkubationstiden afhængigt af celletypestimuli og ønsket fasteniveau.Brug otte replikater for hver simuleringsbetingelse. Forbered derfor en milliliter for hver simuleringstilstand. Brug syv simuleringsbetingelser uden insulin.FD glukose på 2,5 mikrogram per milliliter, 1 mikrogram per milliliter, 0,5 mikrogram per milliliter, 0,2 mikrogram per milliliter, 0,1 mikrogram per milliliter, 0,05 mikrogram per milliliter, og 0 milligram per milliliter i 196 brønd plade. Brug syv stimuleringsbetingelser med insulin. FD-glukose på 2,5 mikrogram pr. milliliter, 1 mikrogram pr. milliliter, 0,5 mikrogram pr. milliliter, 0,2 mikrogram pr. milliliter, 0,1 mikrogram pr. milliliter, 0,05 mikrogram pr. milliliter og 0 mikrogram pr. milliliter i en anden 96 brøndplade.For at forberede stimuleringsbetingelser fortyndes en mikroliter fem milligram pr. milliliter FD-glukosearbejdsopløsning og 999 mikroliter glukosefri DMEM for at opnå en milliliter arbejdslageropløsning. Brug denne arbejdslageropløsning til at forberede 1 til 2000, 1 til 5.000, 1 til 10.000, 1 til 25.000, 1 til 50.000 og 1 til 100.000 vrangforestillinger af FD-glucose for at opnå 2, 5 mikrogram pr. milliliter, 1 mikrogram pr. milliliter, 0, 5 mikrogram pr. milliliter, 0, 2 mikrogram pr. milliliter, 0, 1 mikrogram pr. milliliter, 0,05 mikrogram pr. milliliter i to milliliter rør umiddelbart før forsøg i et biosikkerhedsskab uden lys. Tilsæt en mikroliter insulin til hver af disse betingelser.Efter 40 minutters inkubation dekanteres den glukosefri DMEM fra hver brønd i 96 brøndplader og absorberes den resterende væske med sterile papirhåndklæder. Tilsæt 100 mikroliter hver fra de forskellige behandlingsbetingelser, der er beskrevet før, til brønde langs en kolonne. Og 100 mikroliter fra samme behandlingstilstand til brøndene langs rækken i begge 96 vægplader.Mærk de plader, der udnyttede betingelserne, med og uden insulin. Tilsæt glukosefri DMEM alene til kontrolhullerne. Inkuber pladen i 40 minutter i cellekulturinkubatoren i mørket.Efter at cellerne er blevet stimuleret i 40 minutter. Overfør stimuleringsmediet fra begge plader til nye 96 brøndplader, og oprethold det samme eksperimentelle layout. Vask cellerne med PBS.Fjern PBS, og dekantér eventuel resterende opløsning på sterilt køkkenrulle. Tilsæt en proteasehæmmer til radioimmunoprecipitationsassaybufferen for at beskytte proteiner. Anbring plader indeholdende radioimmunoprecipitationsassay i en ryster i 30 minutter.Ved hjælp af en mikropladelæser måles fluorescens ved excitations- og emissionsbølgelængder ved henholdsvis 485 og 535 nanometer. Først i mediet indeholdende ekstracellulær FD-glucose, og derefter pladen med radioimmunoprecipitation assay lized celler i slutningen af 30 minutters inkubation. Udfør BCA-proteinanalyse i henhold til producentens anvisninger.Kvantificer proteinkoncentrationerne i hver brønd, der indeholder radioimmunoprecipitationsassayliserede celler. Brug 10 mikroliter af radioimmunoprecipitationsassayhomogenatet, og mål proteinkoncentrationer, og tredoble for at øge nøjagtigheden af målinger i 96 brøndplader. Kvantificer protein baseret på proteinstandarder analyseret sammen med prøver på hver 96 brøndplade.Inkuber det høstede væv eller organer i en seks brøndplade indeholdende PBS i et minut. Håndter hvert væv eller organ i en separat brønd. Efter et minut placeres hvert væv på et sterilt papirhåndklæde for at absorbere PBS.Overfør væv eller organer i en separat seks vægplade indeholdende 4.000 mikroliter glukosefri DMEM, og inkuber i to minutter. Efter to minutter fjernes og overføres vævene til brønde i en seks brøndplade indeholdende 0,29 millimolar FD glucose arbejdsløsning. Inkuber de seks brøndplader, der indeholder væv i FD-glukosearbejdsopløsning, ved 37 grader Celsius.Saml 100 mikroliter FD-glukosearbejdsopløsning fra hver brønd efter 0, 10, 20, 30, 40, 60, 90 og 120 minutters inkubation, og overfør opsamlet 100 mikroliter FD-glukosearbejdsopløsning til 96 brøndplader for at analysere kinetikken af ekstracellulær FD-glukoseudtømning. Ryst før og efter indsamling. Mål fluorescensen ved excitation i emissionsbølgelængder ved henholdsvis 485 og 535 nanometer ved hjælp af en mikropladelæser.Dosisafhængighed i den intracellulære optagelse af FD-glucose blev signifikant øget i nærvær af insulin. Insulinstimuleringen førte til signifikant reducerede ekstracellulære FD-glukoseniveauer sammenlignet med prøverne uden insulinstimulering. Ekstracellulær udtømning af FD-glukose kan måle en ændring i glukoseoptagelse med sammenlignelig nøjagtighed som intracellulær FD-glukoseoptagelse.Den ekstracellulære FD-glukose blev ikke udtømt i ikke-stimuleret kontrolvisceralt fedt i løbet af 120 minutters inkubation. I modsætning hertil førte forbehandling af mus med insulin eller AAC2 før dissektionen til signifikant udtømning af ekstracellulær FD-glukose inden for et tidsinterval på henholdsvis 30 minutter og 60 minutter. Ekstracellulær FD-glukose blev ikke udtømt i insulinstimulerede levereksplanter sammenlignet med ikke-stimulerede levereksplanter.Ekstracellulær FD-glukose blev signifikant reduceret på den tidsafhængige måde, og levereksplanter, der var forbehandlet med AAC2.22%, udtømning af glukose blev observeret i det ekstracellulære medium indeholdende den ikke-behandlede hjerne efter 60 minutters inkubation. Mediet inkuberet med hjerner fra insulinbehandlede mus har vist et 5% lineært fald i FD-glukose. AAC2-stimulerede hjerner førte til et dybtgående hurtigt fald til 67,4% af den ekstracellulære FD-glukose i løbet af de første 20 minutter.Stof, der involverer vask, er især vigtigt for at fjerne spor af glukose, blod eller serum i medium og eller organer, da det kan forstyrre fluorescensaflæsningen af disse medier. Efter identifikation af forbindelser af metabolitter med høj gennemstrømning i gener med glykæmiske egenskaber samt de optimale betingelser for deres virkning in vivo-eksperimenter kunne valideres med mærket FD-glukose og PET-scanning for at bekræfte glukoseakkumulering i specifikke organer. Denne teknik til opdagelse af glykæmisk virkning er både gavnlig ved sletning af adskillige metabolitter, terapi eller deres kombinationer og fremhæver deres handlinger i forskellige organer.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Extracellular Glucose Depletion as an Indirect Measure of Glucose Uptake in Cells and Tissues Ex Vivo

A Method for Measuring RNA N6-methyladenosine Modifications in Cells and Tissues

A Method for Measuring RNA N6-methyladenosine Modifications in Cells and Tissues

En metode til måling af RNA<em&gt; N</em<sup&gt; 6</sup&gt; -methyladenosine Ændringer i celler og væv

N6-Methyladenosine (m6A) modifications of RNA are diverse and ubiquitous amongst eukaryotes. They occur in mRNA, rRNA, tRNA, and microRNA. Recent studies ...

Brain Membrane Fractionation: An Ex Vivo Approach to Assess Subsynaptic Protein Localization

Brain Membrane Fractionation: An Ex Vivo Approach to Assess Subsynaptic Protein Localization

Hjernemembran Fraktionering: An<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Tilnærmelse til vurdering af subsynaptisk protein lokalisering

Assessing the synaptic protein composition and function constitutes an important challenge in neuroscience. However, it is not easy to evaluate ...

Dissipative Microgravimetry to Study the Binding Dynamics of the Phospholipid Binding Protein Annexin A2 to Solid-supported Lipid Bilayers Using a Quartz Resonator

Antistatiske Microgravimetry at studere bindende dynamikken i Phospholipid bindende Protein Annexin A2 til fast-understøttet Lipid dobbeltlag ved hjælp af et Quartz Resonator

The dissipative quartz crystal microbalance technique is a simple and label-free approach to measure simultaneously the mass uptake and viscoelastic ...

Analysis of Endocytic Uptake and Retrograde Transport to the Trans-Golgi Network Using Functionalized Nanobodies in Cultured Cells

Analyse af Endocytic optagelse og retrograd Transport til Trans-Golgi netværket ved hjælp af Functionalized Nanobodies i kulturperler celler

Transport of proteins and membranes from the cell surface to the Golgi and beyond is essential for homeostasis, organelle identity and physiology. To ...

Atomic Absorbance Spectroscopy to Measure Intracellular Zinc Pools in Mammalian Cells

Atomabsorptionsspektroskopi til måling af intracellulære zink puljer i pattedyrsceller

Transition metals are essential micronutrients for organisms but can be toxic to cells at high concentrations by competing with physiological metals in ...

Quantification of Coenzyme A in Cells and Tissues

Kvantificering af coenzym A i celler og væv

Emerging research has revealed that the cellular coenzyme A (CoA) supply can become limiting with a detrimental impact on growth, metabolism and survival. ...

An Integrated Raman Spectroscopy and Mass Spectrometry Platform to Study Single-Cell Drug Uptake, Metabolism, and Effects

En integreret Raman spektroskopi og massespektrometri platform til at studere enkelt-celle stof optagelse, metabolisme, og effekter

Cells are known to be inherently heterogeneous in their responses to drugs. Therefore, it is essential that single-cell heterogeneity is accounted for in ...

Using an Extracellular Flux Analyzer to Measure Changes in Glycolysis and Oxidative Phosphorylation during Mouse Sperm Capacitation

Brug af en ekstracellulær flux analysator til at måle ændringer i Glycolyse og oxidativ fosforylering under mus Sædcapacitation

Mammalian sperm acquire fertilization capacity in the female reproductive tract in a process known as capacitation. Capacitation-associated processes ...

Ex Vivo Hepatic Perfusion Through the Portal Vein in Mouse

Ex Vivo Hepatic Perfusion Through the Portal Vein in Mouse

Ex Vivo Leverperfusion gennem portalvenen i musen

Metabolic diseases such as diabetes, pre-diabetes, non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD), and nonalcoholic steatohepatitis (NASH) are becoming ...

Stable Isotope Tracing & LC-MS Analysis to Measure DHODH and SDH Activities

Oxygen-Independent Assays to Measure Mitochondrial Function in Mammals

Oxygen-Independent Assays to Measure Mitochondrial Function in Mammals (Video) | JoVE 

Oxygenuafhængige assays til måling af mitokondriefunktion hos pattedyr

The flow of electrons in the mitochondrial electron transport chain (ETC) supports multifaceted biosynthetic, bioenergetic, and signaling functions in ...