Name: extracellular glucose depletion as an indirect measure of glucose uptake in cells and tissues ex vivo
Uploaded: 2022-04-06T14:20:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Extracellular Glucose Depletion as an Indirect Measure of Glucose Uptake in Cells and Tissues Ex Vivo at JoVE.com

Het project werd ondersteund door Ralph en Marian Falk Medical Research Catalyst Award en Kathleen Kelly Award. Andere ondersteuningen waren het National Center for Research Resources UL1RR025755 en NCI P30CA16058 (OSUCCC), de NIH Roadmap for Medical Research. De inhoud is uitsluitend de verantwoordelijkheid van de auteurs en vertegenwoordigt niet de officiële standpunten van het National Center for Research Resources of de NIH.

Dierstudies werden goedgekeurd door de Institutional Animal Care and Use Committee van de Ohio State University (OSU, protocol 2007A0262-R4).
OPMERKING: Alle procedures moeten worden uitgevoerd in een bioveiligheidskast van klasse II met de blower aan en de lichten uit.
1. Voorbereiding van materialen
OPMERKING: Alle materialen staan vermeld in de materiaaltabel.
<ol><li>Bereid Medium 1, centrifugatie M...

<ol>
	<li>Kyrtata, N., Emsley, H. C. A., Sparasci, O., Parkes, L. M., Dickie, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+systematic+review+of+glucose+transport+alterations+in+Alzheimer's+disease.">A systematic review of glucose transport alterations in Alzheimer's disease.</a> Frontiers in Neuroscience. 15, 568 (2021).</li><li>Garcia-Carbonell, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Critical+role+of+glucose+metabolism+in+rheumatoid+arthritis+fibroblast-like+synoviocytes.">Critical role of glucose metabolism in rheumatoid arthritis fibroblast-like synoviocytes.</a> Arthritis Rheumatology. 68 (7), 1614-1626 (2016).</li><li>Kumar, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Is+diabetes+mellitus+associated+with+mortality+and+severity+of+COVID-19?+A+meta-analysis.">Is diabetes mellitus associated with mortality and severity of COVID-19? A meta-analysis.</a> Diabetes &amp; Metabolic Syndrome: Clinical Research &amp; Review. 14 (4), 535-545 (2020).</li><li>Lee, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Different+prognostic+impact+of+glucose+uptake+in+visceral+adipose+tissue+according+to+sex+in+patients+with+colorectal+cancer.">Different prognostic impact of glucose uptake in visceral adipose tissue according to sex in patients with colorectal cancer.</a> Scientific Reports. 11 (1), 21556 (2021).</li><li>Miner, M. W. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of:+(2S,4R)-4-[(18)F]Fluoroglutamine,+[(11)C]Methionine,+and+2-Deoxy-2-[(18)F]Fluoro-D-Glucose+and+two+small-animal+PET/CT+systems+imaging+rat+gliomas.">Comparison of: (2S,4R)-4-[(18)F]Fluoroglutamine, [(11)C]Methionine, and 2-Deoxy-2-[(18)F]Fluoro-D-Glucose and two small-animal PET/CT systems imaging rat gliomas.</a> Frontiers in Oncology. 11 (18), 730358 (2021).</li><li>Gumbiner, B., Thorburn, A. W., Ditzler, T. M., Bulacan, F., Henry, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+impaired+intracellular+glucose+metabolism+in+the+insulin+resistance+of+aging.">Role of impaired intracellular glucose metabolism in the insulin resistance of aging.</a> Metabolism. 41 (10), 1115-1121 (1992).</li><li>Ebrahimi, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beta+cell+identity+changes+with+mild+hyperglycemia:+Implications+for+function,+growth,+and+vulnerability.">Beta cell identity changes with mild hyperglycemia: Implications for function, growth, and vulnerability.</a> Molecular Metabolism. 35, 100959 (2020).</li><li>Ruberto, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=KLF10+integrates+circadian+timing+and+sugar+signaling+to+coordinate+hepatic+metabolism.">KLF10 integrates circadian timing and sugar signaling to coordinate hepatic metabolism.</a> Elife. 10, 65574 (2021).</li><li>Stocks, B., Zierath, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Post-translational+modifications:+The+signals+at+the+intersection+of+exercise,+glucose+uptake,+and+insulin+sensitivity.">Post-translational modifications: The signals at the intersection of exercise, glucose uptake, and insulin sensitivity.</a> Endocrinology Reviews. , (2021).</li><li>World Health Organization. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+report+on+diabetes.">Global report on diabetes.</a> World Health Organization. , (2016).</li><li>Kolb, H., Martin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Environmental/lifestyle+factors+in+the+pathogenesis+and+prevention+of+type+2+diabetes.">Environmental/lifestyle factors in the pathogenesis and prevention of type 2 diabetes.</a> BMC Medicine. 15 (1), 131 (2017).</li><li>Galicia-Garcia, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathophysiology+of+type+2+diabetes+mellitus.">Pathophysiology of type 2 diabetes mellitus.</a> International Journal of Molecular Science. 21 (17), 6275 (2020).</li><li>Petrov, M. S., Basina, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DIAGNOSIS+OF+ENDOCRINE+DISEASE:+Diagnosing+and+classifying+diabetes+in+diseases+of+the+exocrine+pancreas.">DIAGNOSIS OF ENDOCRINE DISEASE: Diagnosing and classifying diabetes in diseases of the exocrine pancreas.</a> European Journal of Endocrinology. 184 (4), 151-163 (2021).</li><li>Sirdah, M. M., Reading, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+predisposition+in+type+2+diabetes:+A+promising+approach+toward+a+personalized+management+of+diabetes.">Genetic predisposition in type 2 diabetes: A promising approach toward a personalized management of diabetes.</a> Clinical Genetics. 98 (6), 525-547 (2020).</li><li>Ramos-Lopez, O., Milagro, F. I., Riezu-Boj, J. I., Martinez, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetic+signatures+underlying+inflammation:+an+interplay+of+nutrition,+physical+activity,+metabolic+diseases,+and+environmental+factors+for+personalized+nutrition.">Epigenetic signatures underlying inflammation: an interplay of nutrition, physical activity, metabolic diseases, and environmental factors for personalized nutrition.</a> Inflammation Research. 70 (1), 29-49 (2021).</li><li>Yamamoto, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+glucose+uptake+in+cultured+cells.">Measurement of glucose uptake in cultured cells.</a> Current Protocols in Pharmacology. 71 (1), 12-14 (2015).</li><li>Yang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+sensitive+and+simple+HPLC-FLD-based+method+for+the+measurement+of+intracellular+glucose+uptake.">A sensitive and simple HPLC-FLD-based method for the measurement of intracellular glucose uptake.</a> Food Chemistry. 372, 131218 (2021).</li><li>Lee, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amino+acid-based+compound+activates+atypical+PKC+and+leptin+receptor+pathways+to+improve+glycemia+and+anxiety+like+behavior+in+diabetic+mice.">Amino acid-based compound activates atypical PKC and leptin receptor pathways to improve glycemia and anxiety like behavior in diabetic mice.</a> Biomaterials. 239, 119839 (2020).</li><li>Shukla, S. K., Mulder, S. E., Singh, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypoxia-mediated+in+vivo+tumor+glucose+uptake+measurement+and+analysis.">Hypoxia-mediated in vivo tumor glucose uptake measurement and analysis.</a> Methods in Molecular Biology. 1742, 107-113 (2018).</li><li>Jakson, I., Ujvari, D., Brusell Gidlof, S., Linden Hirschberg, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insulin+regulation+of+solute+carrier+family+2+member+1+(glucose+transporter+1)+expression+and+glucose+uptake+in+decidualizing+human+endometrial+stromal+cells:+an+in+vitro+study.">Insulin regulation of solute carrier family 2 member 1 (glucose transporter 1) expression and glucose uptake in decidualizing human endometrial stromal cells: an in vitro study.</a> Reproductive Biology and Endocrinology. 18 (1), 117 (2020).</li><li>Saparbaev, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+quantification+of+any+isoforms+of+carbohydrates+by+2D+UV-MS+fingerprinting+of+cold+ions.">Identification and quantification of any isoforms of carbohydrates by 2D UV-MS fingerprinting of cold ions.</a> Analytical Chemistry. 92 (21), 14624-14632 (2020).</li><li>Schulz, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+metabolomics+of+pellicle+and+saliva+in+children+with+different+caries+activity.">Targeted metabolomics of pellicle and saliva in children with different caries activity.</a> Scientific Reports. 10 (1), 697 (2020).</li><li>Shulman, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+magnetic+resonance+studies+of+glucose+metabolism+in+non-insulin-dependent+diabetes+mellitus+subjects.">Nuclear magnetic resonance studies of glucose metabolism in non-insulin-dependent diabetes mellitus subjects.</a> Molecular Medicine. 2 (5), 533-540 (1996).</li><li>Cochran, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+PET+imaging+with+[(18)F]FDG+to+explain+improved+glucose+uptake+in+an+apolipoprotein+A-I+treated+mouse+model+of+diabetes.">In vivo PET imaging with [(18)F]FDG to explain improved glucose uptake in an apolipoprotein A-I treated mouse model of diabetes.</a> Diabetologia. 59 (18), 1977-1984 (2016).</li><li>Lloyd, P. G., Hardin, C. D., Sturek, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Examining+glucose+transport+in+single+vascular+smooth+muscle+cells+with+a+fluorescent+glucose+analog.">Examining glucose transport in single vascular smooth muscle cells with a fluorescent glucose analog.</a> Physiological Research. 48 (6), 401-410 (1999).</li><li>Beeton, C., Garcia, A., Chandy, K. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drawing+blood+from+rats+through+the+saphenous+vein+and+by+cardiac+puncture.">Drawing blood from rats through the saphenous vein and by cardiac puncture.</a> Journal of Visualized Experiments. (7), e266 (2007).</li><li>DiSilvestro, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leptin+production+by+encapsulated+adipocytes+increases+brown+fat,+decreases+resistin,+and+improves+glucose+intolerance+in+obese+mice.">Leptin production by encapsulated adipocytes increases brown fat, decreases resistin, and improves glucose intolerance in obese mice.</a> PLoS One. 11 (4), 0153198 (2016).</li><li>Friedman, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leptin+and+the+endocrine+control+of+energy+balance.">Leptin and the endocrine control of energy balance.</a> Nature Metabolism. 1 (8), 754-764 (2019).</li><li>Guillam, M. T., Burcelin, R., Thorens, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Normal+hepatic+glucose+production+in+the+absence+of+GLUT2+reveals+an+alternative+pathway+for+glucose+release+from+hepatocytes.">Normal hepatic glucose production in the absence of GLUT2 reveals an alternative pathway for glucose release from hepatocytes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 95 (21), 12317-12321 (1998).</li><li>Guillam, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+diabetes+and+abnormal+postnatal+pancreatic+islet+development+in+mice+lacking+Glut-2.">Early diabetes and abnormal postnatal pancreatic islet development in mice lacking Glut-2.</a> Nature Genetics. 17 (3), 327-330 (1997).</li><li>Barros, L. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetic+validation+of+6-NBDG+as+a+probe+for+the+glucose+transporter+GLUT1+in+astrocytes.">Kinetic validation of 6-NBDG as a probe for the glucose transporter GLUT1 in astrocytes.</a> Journal of Neurochemistry. 109, 94-100 (2009).</li><li>Sprinz, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+blood+glucose+level+on+18F-FDG+uptake+for+PET/CT+in+normal+organs:+A+systematic+review.">Effects of blood glucose level on 18F-FDG uptake for PET/CT in normal organs: A systematic review.</a> PLoS One. 13 (2), 0193140 (2018).</li><li>Johnson, T. V., Martin, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+characterization+of+an+adult+retinal+explant+organotypic+tissue+culture+system+as+an+in+vitro+intraocular+stem+cell+transplantation+model.">Development and characterization of an adult retinal explant organotypic tissue culture system as an in vitro intraocular stem cell transplantation model.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 49 (8), 3503-3512 (2008).</li><li>de Urquiza, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Docosahexaenoic+acid,+a+ligand+for+the+retinoid+X+receptor+in+mouse+brain.">Docosahexaenoic acid, a ligand for the retinoid X receptor in mouse brain.</a> Science. 290 (5499), 2140-2144 (2000).</li><li>Olson, A. L., Pessin, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure,+function,+and+regulation+of+the+mammalian+facilitative+glucose+transporter+gene+family.">Structure, function, and regulation of the mammalian facilitative glucose transporter gene family.</a> Annual Review of Nutrition. 16 (1), 235-256 (1996).</li><li>Muhanna, D., Arnipalli, S. R., Kumar, S. B., Ziouzenkova, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osmotic+adaptation+by+Na(+)-dependent+transporters+and+ACE2:+correlation+with+hemostatic+crisis+in+COVID-19.">Osmotic adaptation by Na(+)-dependent transporters and ACE2: correlation with hemostatic crisis in COVID-19.</a> Biomedicines. 8 (11), 460 (2020).</li><li>Ligasova, A., Koberna, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+dyes-highly+sensitive+reporters+of+cell+quantification:+comparison+with+other+cell+quantification+methods.">DNA dyes-highly sensitive reporters of cell quantification: comparison with other cell quantification methods.</a> Molecules. 26 (18), 5515 (2021).</li><li>DeFronzo, R. A., Tobin, J. D., Andres, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glucose+clamp+technique:+a+method+for+quantifying+insulin+secretion+and+resistance.">Glucose clamp technique: a method for quantifying insulin secretion and resistance.</a> American Journal of Physiology. 237 (3), 214-223 (1979).</li></ol>

De directe vergelijking van extracellulaire FD-glucosedepletie met genormaliseerde intracellulaire glucoseopname in celkweek toonde een hoge correlatie, wat suggereert dat extracellulaire glucosedepletie een surrogaatmeting zou kunnen zijn voor de beoordeling van de glucoseopname. De meting van extracellulaire FD-glucose kan een breed scala aan FD-glucoseconcentraties gebruiken, ook 0,5-2,5 μg FD-glucose / ml lijkt het optimale bereik te bieden. Extracellulaire FD-glucose vereist geen normalisatie naar celaantal of eiwi...

De vraag naar het meten van glucoseopname stijgt samen met de kritieke noodzaak om een epidemische toename van een groot aantal ziekten aan te pakken die afhankelijk zijn van het glucosemetabolisme. Onderliggende mechanismen van degeneratieve metabole ziekten, neurologische en cognitieveaandoeningen 1, ontsteking2 en infectieziekten3, kanker 4,5, evenals veroudering6, zijn afhankelijk van glucosemetabolisme voor energie en de opslag ervan, anabole processen, eiwit- en genmodificatie, signalering, regulatie van genen en nucleïnezuren synthese en replicatie 7,8,9 . Diabetes mellitus (DM) is direct gerelateerd aan een storing in de glucose-opnameregulatie. DM is een spectrum van chronische ziekten zoals type-1, -2 en -3 diabetes mellitus, zwangerschapsdiabetes, volwassenheidsdiabetes van jongeren en andere soorten van deze ziekte veroorzaakt door omgevings- en / of genetische factoren. In 2016 toonde het eerste who global report on diabetes aan dat het aantal volwassenen met de meest wijdverspreide DM sinds 1980 bijna is verviervoudigd tot 422 miljoen volwassenen10, en dit aantal DM-patiënten is de afgelopen decennia exponentieel gestegen. Alleen al in 2019 werd een schatting van 1,5 miljoen sterfgevallen direct veroorzaakt door DM10. Deze dramatische stijging is te wijten aan de toename van type-2 DM en de omstandigheden die het veroorzaken, waaronder overgewicht en obesitas10. De COVID-19-pandemie onthulde een tweevoudige toename van de mortaliteit bij patiënten met DM in vergelijking met de algemene bevolking, wat de diepgaande maar slecht begrepen rol van glucosemetabolisme in de immuunafweer suggereert3. Preventie, vroege diagnose en behandeling van DM, obesitas en andere ziekten vereisen optimalisatie van metingen van glucoseopname door verschillende weefsels en identificatie vanomgevingsfactoren 11, voeding12, endocriene13, genetische 14 en epigenetische15 factoren die de glucoseopname beïnvloeden.
In onderzoek wordt intracellulaire en/of weefselopname van glucose gewoonlijk gemeten door fluorescerend gelabelde glucose (FD-glucose) in vitro 16,17,18 en in vivo19. FD-glucose werd een voorkeursmethode in vergelijking met nauwkeurigere methoden met behulp van radioactief gelabelde glucose20, analytische massaspectroscopieanalyse21, metabolomica22, nucleaire magnetische resonantiemethoden23 en positronemissietomografie / computertomografie (PET / CT) 5,24. In tegenstelling tot de opname van FD-glucose, kunnen analytische methoden die meer biologisch materiaal vereisen, een monstervoorbereiding in meerdere stappen, dure instrumenten en complexe gegevensanalyse omvatten. Effectieve en goedkope metingen van FD-glucoseopname in celculturen zijn gebruikt in proof-of-concept-experimenten en vereisen mogelijk validatie door andere methoden.
De basis van FD-glucosetoepassing voor glucoseopnamestudies is het verminderde metabolisme van FD-glucose in vergelijking met endogene glucose25. Niettemin zijn zowel endogene glucose als FD-glucose dynamisch verdeeld over alle cellulaire compartimenten voor gebruik in anabole, katabole en signaleringsprocessen. De compartimentering en tijdsafhankelijke verwerking25 van FD-glucose interfereren met de fluorescentiemetingen en vertegenwoordigen de belangrijkste beperkende factoren voor het gebruik van deze test in screeningexperimenten met hoge doorvoer, kinetische analyse, 3D-celkweek, coculturen en weefselexplantexplantexperimenten. Hier bieden we gegevens die een hoge correlatie aantonen tussen de extracellulaire depletie van FD-glucose en de intracellulaire opname ervan, wat de extracellulaire uitputting van FD-glucose suggereert als een surrogaatmeting voor intracellulaire glucoseopname. De meting van extracellulaire depletie van glucose werd toegepast om weefselspecifieke verschillen in glucoseopname te valideren bij muizen behandeld met insuline en een experimenteel medicijn18 om een proof-of-principle van deze methode te bieden.
Het huidige protocol beschrijft intracellulaire en extracellulaire (figuur 1) metingen van FD-glucoseopname in 3T3-L1-cellen. Protocol secties 1-7 verklaren de cultuur en groei van cellen gedurende 48 uur; celuithongering, stimulatie en baseline extracellulaire metingen; en poststimulatiemetingen van extracellulaire FD-glucose en intracellulaire metingen van FD-glucose en eiwit. Protocol sectie 8 beschrijft de ex vivo meting van extracellulaire opname van FD-glucose in weefsels ontleed van ob/ob muizen in de aan- en afwezigheid van insuline en aminozuurverbinding 2 (AAC2) elders beschreven18.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>3T3-L1 mouse fibroblasts</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CL-173</td>
			<td>Cell line</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plates</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353227</td>
			<td>Plastic ware</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B6.V-Lepob/J male mice</td>
			<td>Jackson Laboratory</td>
			<td>stock number 000632</td>
			<td>Mice</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BioTek Synergy H1 modular multimode microplate reader (Fisher Scientific, US)</td>
			<td>Fisher Scientific, US</td>
			<td>&#160;B-SHT</td>
			<td>Device</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum</td>
			<td>Gibco/ThermoFisher</td>
			<td>161790-060</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calf serum</td>
			<td>Gibco/ThermoFisher</td>
			<td>26010-066</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell incubator</td>
			<td>Forma</td>
			<td>Series II Water Jacket</td>
			<td>Device</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diet (mouse/rat diet, irradiated)</td>
			<td>Envigo</td>
			<td>Teklad LM-485</td>
			<td>Diet</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethylsulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Sigma LifeScience</td>
			<td>D2650-100mL</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium</td>
			<td>Gibco/ThermoFisher</td>
			<td>&#160;11965-092</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>E7023-500mL</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent 2-deoxy-2-[(7-nitro-2,1,3-benzoxadiazol-4-yl) amino]-D-glucose)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>72987-1MG</td>
			<td>Assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose-free and phenol red-free DMEM</td>
			<td>Gibco/ThermoFisher</td>
			<td>A14430-01</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human insulin 10 mg/mL</td>
			<td>MilliporeSigma, Cat N 91077C</td>
			<td>Cat N 91077C</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane, 5%</td>
			<td>Henry Schein</td>
			<td>NDC 11695-6776-2</td>
			<td>Anestaetic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/streptomycin (P/S)</td>
			<td>Gibco/ThermoFisher</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>DA537-500 mL</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce bicinchoninic acid (BCA) protein assay</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>Cat N23225</td>
			<td>Assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Radioimmunoprecipitation assay lysis buffer</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-24948</td>
			<td>Assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0.05%)</td>
			<td>Gibco/ThermoFisher</td>
			<td>&#160;25300-054</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

extracellular glucose depletion as an indirect measure of glucose uptake in cells and tissues ex vivo

De aanhoudende wereldwijde epidemie van diabetes verhoogt de vraag naar de identificatie van omgevings-, voedings-, endocriene, genetische en epigenetische factoren die de opname van glucose beïnvloeden. De meting van intracellulaire fluorescentie is een veelgebruikte methode om de opname van fluorescerend gelabelde glucose (FD-glucose) in cellen in vitro te testen, of voor het in vivo in beeld brengen van glucose-consumerende weefsels. Deze test beoordeelt de opname van glucose op een gekozen tijdstip. De intracellulaire analyse gaat ervan uit dat het metabolisme van FD-glucose langzamer is dan dat van endogene glucose, dat deelneemt aan katabole en anabole reacties en signalering. Dynamisch glucosemetabolisme verandert echter ook opnamemechanismen, die kinetische metingen van glucoseopname vereisen als reactie op verschillende factoren. Dit artikel beschrijft een methode voor het meten van extracellulaire FD-glucosedepletie en valideert de correlatie met intracellulaire FD-glucoseopname in cellen en weefsels ex vivo. Extracellulaire glucosedepletie kan mogelijk toepasbaar zijn voor kinetische en dosisafhankelijke studies met hoge doorvoer, evenals het identificeren van verbindingen met glycemische activiteit en hun weefselspecifieke effecten.

Intracellulaire inname en extracellulaire glucosedepletie werden gemeten in 3T3-L1 preadipocyten, als reactie op verschillende concentraties FD-glucose (figuur 2) met en zonder insulinestimulatie. Figuur 2A toont een dosisafhankelijke toename van de intracellulaire opname van FD-glucose, die significant verhoogd was in aanwezigheid van insuline. De gelijktijdige afname van extracellulaire FD-glucose in dezelfde cellen wordt weergegeven in fi...

Watch this Scientific Journal Video about Extracellular Glucose Depletion as an Indirect Measure of Glucose Uptake in Cells and Tissues Ex Vivo at JoVE.com

Extracellular Glucose Depletion as an Indirect Measure of Glucose Uptake in Cells and Tissues Ex Vivo

Extracellulaire depletie van fluorescerend gelabelde glucose correleert met glucoseopname en kan worden gebruikt voor high-throughput screening van glucoseopname in weggesneden organen en celculturen.

Extracellulaire glucosedepletie als een indirecte maat voor glucoseopname in cellen en weefsels Ex Vivo

The ongoing worldwide epidemic of diabetes increases the demand for the identification of environmental, nutritional, endocrine, genetic, and epigenetic ...

Glucose opname is de sleutel tot het begrijpen van gezondheid en ziekte. Omdat glucose een cruciale rol speelt in metabole en structurele eisen in het menselijk lichaam, en een vitale rol speelt bij de regulatie. De extracellulaire meting van glucose maakt de ontwikkeling mogelijk van high throughput assays voor kinetiek van glucoseopname in cellen, weefsels en organen met verschillende genetische achtergronden als reactie op voedingsstoffen of geneesmiddelen.Deze test zou een waardevol hulpmiddel zijn voor de ontdekking van therapeutica en voeding voor diabetes, kanker, degeneratieve ziekten van het centrale zenuwstelsel, obesitas en alle ziekten van glucose en metabolisme. De test heeft een aanpassing van de tijd nodig voor uithongering en stimulatie die gebaseerd moet zijn op metabole details voor verschillende weefsels en celculturen. Kweek 3T3-L1 muis fibroblasten door 10 tot de 6 cellen te platen, verdund in 20 milliliter medium 1 in 296 putplaten.Plaat 100 microliter celsuspensie per put, die ervoor zorgt dat de homogeniteit van deze suspensie behouden blijft door te mengen. Kweek cellen gedurende 48 uur in een incubator van 37 graden Celsius zonder media te veranderen tot ongeveer 70 tot 80% samenvloeiing. Houd cellen samenvloeiend en vastend door ze gedurende 48 uur in hetzelfde medium te kweken.Varieer de incubatietijd van 24 tot 72 uur, afhankelijk van de gewenste nuchtere katabole toestand. Decanteer media uit cellen in de 96 putplaten. Absorbeer de resterende vloeistof met steriele papieren handdoeken.Spoel de 96 putplaat af met 100 microliter PBS per put en absorbeer de resterende vloeistof met steriele papieren handdoeken. Voeg 100 microliter glucosevrije DMEM per put toe en incubeer gedurende 40 minuten. Pas de incubatietijd aan, afhankelijk van de stimuli van het celtype en het gewenste niveau van vasten.Gebruik acht replicaties voor elke simulatievoorwaarde. Bereid daarom één milliliter voor elke simulatieconditie. Gebruik zeven simulatiecondities zonder insuline.FD-glucose van 2,5 microgram per milliliter, 1 microgram per milliliter, 0,5 microgram per milliliter, 0,2 microgram per milliliter, 0,1 microgram per milliliter, 0,05 microgram per milliliter en 0 milligram per milliliter in 196 putplaat. Gebruik zeven stimulatievoorwaarden met insuline. FD-glucose van 2,5 microgram per milliliter, 1 microgram per milliliter, 0,5 microgram per milliliter, 0,2 microgram per milliliter, 0,1 microgram per milliliter, 0,05 microgram per milliliter en 0 microgram per milliliter in een andere 96 putplaat.Om stimulatieomstandigheden voor te bereiden, verdunt u één microliter van vijf milligram per milliliter FD-glucosewerkoplossing en 999 microliter glucosevrije DMEM om één milliliter werkvoorraadoplossing te verkrijgen. Bereid met deze werkvoorraadoplossing 1 tot 2000, 1 tot 5. 000, 1 tot 10, 000, 1 tot 25, 000, 1 tot 50, 000 en 1 tot 100. 000 waanideeën FD-glucose om 2,5 microgram per milliliter, 1 microgram per milliliter, 0,5 microgram per milliliter, 0,2 microgram per milliliter, 0,1 microgram per milliliter te verkrijgen, 0,05 microgram per milliliter in twee milliliterbuizen vlak voor experimenten in een bioveiligheidskast zonder verlichting. Voeg een microliter insuline toe aan elk van deze aandoeningen.Decanteer na 40 minuten incubatie de glucosevrije DMEM uit elke put in 96 putplaten en absorbeer de resterende vloeistof met steriele papieren handdoeken. Voeg elk 100 microliter van de verschillende behandelingsomstandigheden toe aan putten langs één kolom. En 100 microliter van dezelfde behandelingsconditie naar de putten langs de rij in beide 96 wandplaten.Label de platen die de omstandigheden gebruikten, met en zonder insuline. Voeg alleen glucosevrije DMEM toe aan de controleputten. Incubeer de plaat gedurende 40 minuten in de celkweekincubator in het donker.Nadat de cellen gedurende 40 minuten zijn gestimuleerd. Breng de stimulatiemedia van beide platen over naar nieuwe 96 putplaten, met behoud van dezelfde experimentele lay-out. Was de cellen met PBS.Verwijder PBS en decanteer de resterende oplossing op steriele papieren handdoeken. Voeg een proteaseremmer toe aan de radio-immunoprecipitatietestbuffer om eiwitten te beschermen. Plaats platen met radio-immunoprecipitatietest gedurende 30 minuten in een shaker.Meet met behulp van een microplaatlezer fluorescentie op excitatie- en emissiegolflengten op respectievelijk 485 en 535 nanometer. Eerst in het medium dat extracellulaire FD-glucose bevat en vervolgens de plaat met radioimmunoprecipitatie geteste cellen aan het einde van 30 minuten incubatie. Voer de BCA-eiwittest uit volgens de instructies van de fabrikant.Kwantificeer de eiwitconcentraties in elke put die radio-immunoprecipitatietest lized cellen bevat. Gebruik 10 microliter van de radio-immunoprecipitatietest homogenaat, en meet eiwitconcentraties en triplicaat om de nauwkeurigheid van metingen in 96 putplaten te verhogen. Kwantificeer eiwit op basis van eiwitstandaarden die samen met monsters op elke 96 putplaat worden geanalyseerd.Incubeer de geoogste weefsels of organen gedurende één minuut in een plaat met zes putten met PBS. Behandel elk weefsel of orgaan in een aparte put. Leg na een minuut elk zakje op een steriel keukenpapier om PBS te absorberen.Breng weefsels of organen over in een aparte zeswandige plaat met 4.000 microliter glucosevrije DMEM en incubeer gedurende twee minuten. Verwijder na twee minuten de weefsels en breng ze over in putten van een plaat met zes putten met 0,29 millimolaire FD glucose-werkoplossing. Incubeer de zes putplaten met weefsels in FD glucose werkoplossing bij 37 graden Celsius.Verzamel 100 microliter FD-glucosewerkoplossing uit elke put na 0, 10, 20, 30, 40, 60, 90 en 120 minuten incubatie en breng verzamelde 100 microliter FD-glucosewerkoplossing over in 96 putplaten om de kinetiek van extracellulaire FD-glucosedepletie te analyseren. Schud voor en na het verzamelen. Meet de fluorescentie bij excitatie in emissiegolflengten op respectievelijk 485 en 535 nanometer met behulp van een microplaatlezer.Dosisafhankelijkheid in de intracellulaire opname van FD glucose was significant verhoogd in aanwezigheid van insuline. De insulinestimulatie leidde tot significant verlaagde extracellulaire FD-glucosespiegels in vergelijking met de monsters zonder insulinestimulatie. Extracellulaire depletie van FD-glucose kan een verandering in glucoseopname met vergelijkbare nauwkeurigheid meten als intracellulaire FD-glucoseopname.De extracellulaire FD-glucose was niet uitgeput in niet-gestimuleerd controlevisceraal vet gedurende 120 minuten incubatie. Daarentegen leidde voorbehandeling van muizen met insuline of AAC2 vóór de dissectie tot een significante uitputting van extracellulaire FD-glucose binnen een tijdsinterval van respectievelijk 30 minuten en 60 minuten. Extracellulaire FD-glucose was niet uitgeput in insuline gestimuleerde leverexplantaten, vergeleken met niet-gestimuleerde leverexplantaten.Extracellulaire FD-glucose was significant afgenomen op de tijdsafhankelijke manier en leverexplantaten voorbehandeld met AAC2,22% uitputting van glucose werd waargenomen in het extracellulaire medium dat de niet-behandelde hersenen bevat na 60 minuten incubatie. Het medium geïncubeerd met hersenen van met insuline behandelde muizen heeft een lineaire afname van 5% in FD-glucose laten zien. AAC2 gestimuleerde hersenen leidden tot een diepgaande snelle afname tot 67,4% van de extracellulaire FD-glucose gedurende de eerste 20 minuten.Stoffen waarbij wassen betrokken is, zijn vooral belangrijk voor het verwijderen van sporen van glucose, bloed of serum in het medium en of organen, omdat het de fluorescentiemeting van deze media kan verstoren. Na identificatie met hoge doorvoer van verbindingen van metabolieten in genen met glycemische eigenschappen, evenals de optimale omstandigheden voor hun werking in vivo experimenten, kon worden gevalideerd met gelabelde FD-glucose- en PET-scanning om glucoseaccumulatie in specifieke organen te bevestigen. Deze techniek voor de ontdekking van glycemische werking is zowel gunstig bij de deletie van talrijke metabolieten, therapeutica of hun combinaties, als benadrukt hun acties in verschillende organen.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Extracellular Glucose Depletion as an Indirect Measure of Glucose Uptake in Cells and Tissues Ex Vivo

A Method for Measuring RNA N6-methyladenosine Modifications in Cells and Tissues

A Method for Measuring RNA N6-methyladenosine Modifications in Cells and Tissues

Een methode voor het meten van RNA<em&gt; N</em<sup&gt; 6</sup&gt; -methyladenosine Wijzigingen in cellen en weefsels

N6-Methyladenosine (m6A) modifications of RNA are diverse and ubiquitous amongst eukaryotes. They occur in mRNA, rRNA, tRNA, and microRNA. Recent studies ...

Brain Membrane Fractionation: An Ex Vivo Approach to Assess Subsynaptic Protein Localization

Brain Membrane Fractionation: An Ex Vivo Approach to Assess Subsynaptic Protein Localization

Breinmembraanfractie: An<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Aanpak om de subsynaptische eiwit lokalisatie te beoordelen

Assessing the synaptic protein composition and function constitutes an important challenge in neuroscience. However, it is not easy to evaluate ...

Dissipative Microgravimetry to Study the Binding Dynamics of the Phospholipid Binding Protein Annexin A2 to Solid-supported Lipid Bilayers Using a Quartz Resonator

Dissipatief Microgravimetry te bestuderen van de dynamiek van de Binding van de fosfolipide bindend proteïne Annexine A2 aan lipide Solid-ondersteund Bilayers met behulp van een Resonator Quartz

The dissipative quartz crystal microbalance technique is a simple and label-free approach to measure simultaneously the mass uptake and viscoelastic ...

Analysis of Endocytic Uptake and Retrograde Transport to the Trans-Golgi Network Using Functionalized Nanobodies in Cultured Cells

Analyse van endocytotische opname en Retrograde Transport naar het netwerk van de Trans-Golgi matiemaatschappij Nanobodies, waarbij in gekweekte cellen

Transport of proteins and membranes from the cell surface to the Golgi and beyond is essential for homeostasis, organelle identity and physiology. To ...

Atomic Absorbance Spectroscopy to Measure Intracellular Zinc Pools in Mammalian Cells

Atomaire absorptiespectroscopie om intracellulaire zink zwembaden in zoogdiercellen te meten

Transition metals are essential micronutrients for organisms but can be toxic to cells at high concentrations by competing with physiological metals in ...

Quantification of Coenzyme A in Cells and Tissues

Kwantificering van co-enzym A in cellen en weefsels

Emerging research has revealed that the cellular coenzyme A (CoA) supply can become limiting with a detrimental impact on growth, metabolism and survival. ...

An Integrated Raman Spectroscopy and Mass Spectrometry Platform to Study Single-Cell Drug Uptake, Metabolism, and Effects

Een geïntegreerde Raman-spectroscopie en massaspectrometrie platform voor het bestuderen van de opname van één cel drug, metabolisme, en effecten

Cells are known to be inherently heterogeneous in their responses to drugs. Therefore, it is essential that single-cell heterogeneity is accounted for in ...

Using an Extracellular Flux Analyzer to Measure Changes in Glycolysis and Oxidative Phosphorylation during Mouse Sperm Capacitation

Met behulp van een extracellulaire flux Analyzer om veranderingen in glycolyse en oxidatieve fosforylering te meten tijdens het gebruik van muis sperma

Mammalian sperm acquire fertilization capacity in the female reproductive tract in a process known as capacitation. Capacitation-associated processes ...

Ex Vivo Hepatic Perfusion Through the Portal Vein in Mouse

Ex Vivo Hepatic Perfusion Through the Portal Vein in Mouse

Ex Vivo Leverperfusie door de poortader in muis

Metabolic diseases such as diabetes, pre-diabetes, non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD), and nonalcoholic steatohepatitis (NASH) are becoming ...

Stable Isotope Tracing & LC-MS Analysis to Measure DHODH and SDH Activities

Oxygen-Independent Assays to Measure Mitochondrial Function in Mammals

Oxygen-Independent Assays to Measure Mitochondrial Function in Mammals (Video) | JoVE 

Zuurstofonafhankelijke assays om de mitochondriale functie bij zoogdieren te meten

The flow of electrons in the mitochondrial electron transport chain (ETC) supports multifaceted biosynthetic, bioenergetic, and signaling functions in ...