Name: extracellular glucose depletion as an indirect measure of glucose uptake in cells and tissues ex vivo
Uploaded: 2022-04-06T14:20:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Extracellular Glucose Depletion as an Indirect Measure of Glucose Uptake in Cells and Tissues Ex Vivo at JoVE.com

Das Projekt wurde vom Ralph and Marian Falk Medical Research Catalyst Award und dem Kathleen Kelly Award unterstützt. Weitere Unterstützungen waren das National Center for Research Resources UL1RR025755 und NCI P30CA16058 (OSUCCC), die NIH Roadmap for Medical Research. Der Inhalt liegt ausschließlich in der Verantwortung der Autoren und stellt nicht die offiziellen Ansichten des National Center for Research Resources oder des NIH dar.

Tierversuche wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee der Ohio State University (OSU, Protokoll 2007A0262-R4) genehmigt.
HINWEIS: Alle Verfahren müssen in einer Biosicherheitskabine der Klasse II mit eingeschaltetem Gebläse und ausgeschaltetem Licht durchgeführt werden.
1. Vorbereitung der Materialien
HINWEIS: Alle Materialien sind in der Materialtabelle aufgeführt.
<ol><li>Herstellung...

<ol>
	<li>Kyrtata, N., Emsley, H. C. A., Sparasci, O., Parkes, L. M., Dickie, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+systematic+review+of+glucose+transport+alterations+in+Alzheimer's+disease.">A systematic review of glucose transport alterations in Alzheimer's disease.</a> Frontiers in Neuroscience. 15, 568 (2021).</li><li>Garcia-Carbonell, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Critical+role+of+glucose+metabolism+in+rheumatoid+arthritis+fibroblast-like+synoviocytes.">Critical role of glucose metabolism in rheumatoid arthritis fibroblast-like synoviocytes.</a> Arthritis Rheumatology. 68 (7), 1614-1626 (2016).</li><li>Kumar, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Is+diabetes+mellitus+associated+with+mortality+and+severity+of+COVID-19?+A+meta-analysis.">Is diabetes mellitus associated with mortality and severity of COVID-19? A meta-analysis.</a> Diabetes &amp; Metabolic Syndrome: Clinical Research &amp; Review. 14 (4), 535-545 (2020).</li><li>Lee, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Different+prognostic+impact+of+glucose+uptake+in+visceral+adipose+tissue+according+to+sex+in+patients+with+colorectal+cancer.">Different prognostic impact of glucose uptake in visceral adipose tissue according to sex in patients with colorectal cancer.</a> Scientific Reports. 11 (1), 21556 (2021).</li><li>Miner, M. W. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of:+(2S,4R)-4-[(18)F]Fluoroglutamine,+[(11)C]Methionine,+and+2-Deoxy-2-[(18)F]Fluoro-D-Glucose+and+two+small-animal+PET/CT+systems+imaging+rat+gliomas.">Comparison of: (2S,4R)-4-[(18)F]Fluoroglutamine, [(11)C]Methionine, and 2-Deoxy-2-[(18)F]Fluoro-D-Glucose and two small-animal PET/CT systems imaging rat gliomas.</a> Frontiers in Oncology. 11 (18), 730358 (2021).</li><li>Gumbiner, B., Thorburn, A. W., Ditzler, T. M., Bulacan, F., Henry, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+impaired+intracellular+glucose+metabolism+in+the+insulin+resistance+of+aging.">Role of impaired intracellular glucose metabolism in the insulin resistance of aging.</a> Metabolism. 41 (10), 1115-1121 (1992).</li><li>Ebrahimi, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beta+cell+identity+changes+with+mild+hyperglycemia:+Implications+for+function,+growth,+and+vulnerability.">Beta cell identity changes with mild hyperglycemia: Implications for function, growth, and vulnerability.</a> Molecular Metabolism. 35, 100959 (2020).</li><li>Ruberto, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=KLF10+integrates+circadian+timing+and+sugar+signaling+to+coordinate+hepatic+metabolism.">KLF10 integrates circadian timing and sugar signaling to coordinate hepatic metabolism.</a> Elife. 10, 65574 (2021).</li><li>Stocks, B., Zierath, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Post-translational+modifications:+The+signals+at+the+intersection+of+exercise,+glucose+uptake,+and+insulin+sensitivity.">Post-translational modifications: The signals at the intersection of exercise, glucose uptake, and insulin sensitivity.</a> Endocrinology Reviews. , (2021).</li><li>World Health Organization. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+report+on+diabetes.">Global report on diabetes.</a> World Health Organization. , (2016).</li><li>Kolb, H., Martin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Environmental/lifestyle+factors+in+the+pathogenesis+and+prevention+of+type+2+diabetes.">Environmental/lifestyle factors in the pathogenesis and prevention of type 2 diabetes.</a> BMC Medicine. 15 (1), 131 (2017).</li><li>Galicia-Garcia, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathophysiology+of+type+2+diabetes+mellitus.">Pathophysiology of type 2 diabetes mellitus.</a> International Journal of Molecular Science. 21 (17), 6275 (2020).</li><li>Petrov, M. S., Basina, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DIAGNOSIS+OF+ENDOCRINE+DISEASE:+Diagnosing+and+classifying+diabetes+in+diseases+of+the+exocrine+pancreas.">DIAGNOSIS OF ENDOCRINE DISEASE: Diagnosing and classifying diabetes in diseases of the exocrine pancreas.</a> European Journal of Endocrinology. 184 (4), 151-163 (2021).</li><li>Sirdah, M. M., Reading, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+predisposition+in+type+2+diabetes:+A+promising+approach+toward+a+personalized+management+of+diabetes.">Genetic predisposition in type 2 diabetes: A promising approach toward a personalized management of diabetes.</a> Clinical Genetics. 98 (6), 525-547 (2020).</li><li>Ramos-Lopez, O., Milagro, F. I., Riezu-Boj, J. I., Martinez, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetic+signatures+underlying+inflammation:+an+interplay+of+nutrition,+physical+activity,+metabolic+diseases,+and+environmental+factors+for+personalized+nutrition.">Epigenetic signatures underlying inflammation: an interplay of nutrition, physical activity, metabolic diseases, and environmental factors for personalized nutrition.</a> Inflammation Research. 70 (1), 29-49 (2021).</li><li>Yamamoto, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+glucose+uptake+in+cultured+cells.">Measurement of glucose uptake in cultured cells.</a> Current Protocols in Pharmacology. 71 (1), 12-14 (2015).</li><li>Yang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+sensitive+and+simple+HPLC-FLD-based+method+for+the+measurement+of+intracellular+glucose+uptake.">A sensitive and simple HPLC-FLD-based method for the measurement of intracellular glucose uptake.</a> Food Chemistry. 372, 131218 (2021).</li><li>Lee, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amino+acid-based+compound+activates+atypical+PKC+and+leptin+receptor+pathways+to+improve+glycemia+and+anxiety+like+behavior+in+diabetic+mice.">Amino acid-based compound activates atypical PKC and leptin receptor pathways to improve glycemia and anxiety like behavior in diabetic mice.</a> Biomaterials. 239, 119839 (2020).</li><li>Shukla, S. K., Mulder, S. E., Singh, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypoxia-mediated+in+vivo+tumor+glucose+uptake+measurement+and+analysis.">Hypoxia-mediated in vivo tumor glucose uptake measurement and analysis.</a> Methods in Molecular Biology. 1742, 107-113 (2018).</li><li>Jakson, I., Ujvari, D., Brusell Gidlof, S., Linden Hirschberg, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insulin+regulation+of+solute+carrier+family+2+member+1+(glucose+transporter+1)+expression+and+glucose+uptake+in+decidualizing+human+endometrial+stromal+cells:+an+in+vitro+study.">Insulin regulation of solute carrier family 2 member 1 (glucose transporter 1) expression and glucose uptake in decidualizing human endometrial stromal cells: an in vitro study.</a> Reproductive Biology and Endocrinology. 18 (1), 117 (2020).</li><li>Saparbaev, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+quantification+of+any+isoforms+of+carbohydrates+by+2D+UV-MS+fingerprinting+of+cold+ions.">Identification and quantification of any isoforms of carbohydrates by 2D UV-MS fingerprinting of cold ions.</a> Analytical Chemistry. 92 (21), 14624-14632 (2020).</li><li>Schulz, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+metabolomics+of+pellicle+and+saliva+in+children+with+different+caries+activity.">Targeted metabolomics of pellicle and saliva in children with different caries activity.</a> Scientific Reports. 10 (1), 697 (2020).</li><li>Shulman, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+magnetic+resonance+studies+of+glucose+metabolism+in+non-insulin-dependent+diabetes+mellitus+subjects.">Nuclear magnetic resonance studies of glucose metabolism in non-insulin-dependent diabetes mellitus subjects.</a> Molecular Medicine. 2 (5), 533-540 (1996).</li><li>Cochran, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+PET+imaging+with+[(18)F]FDG+to+explain+improved+glucose+uptake+in+an+apolipoprotein+A-I+treated+mouse+model+of+diabetes.">In vivo PET imaging with [(18)F]FDG to explain improved glucose uptake in an apolipoprotein A-I treated mouse model of diabetes.</a> Diabetologia. 59 (18), 1977-1984 (2016).</li><li>Lloyd, P. G., Hardin, C. D., Sturek, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Examining+glucose+transport+in+single+vascular+smooth+muscle+cells+with+a+fluorescent+glucose+analog.">Examining glucose transport in single vascular smooth muscle cells with a fluorescent glucose analog.</a> Physiological Research. 48 (6), 401-410 (1999).</li><li>Beeton, C., Garcia, A., Chandy, K. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drawing+blood+from+rats+through+the+saphenous+vein+and+by+cardiac+puncture.">Drawing blood from rats through the saphenous vein and by cardiac puncture.</a> Journal of Visualized Experiments. (7), e266 (2007).</li><li>DiSilvestro, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leptin+production+by+encapsulated+adipocytes+increases+brown+fat,+decreases+resistin,+and+improves+glucose+intolerance+in+obese+mice.">Leptin production by encapsulated adipocytes increases brown fat, decreases resistin, and improves glucose intolerance in obese mice.</a> PLoS One. 11 (4), 0153198 (2016).</li><li>Friedman, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leptin+and+the+endocrine+control+of+energy+balance.">Leptin and the endocrine control of energy balance.</a> Nature Metabolism. 1 (8), 754-764 (2019).</li><li>Guillam, M. T., Burcelin, R., Thorens, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Normal+hepatic+glucose+production+in+the+absence+of+GLUT2+reveals+an+alternative+pathway+for+glucose+release+from+hepatocytes.">Normal hepatic glucose production in the absence of GLUT2 reveals an alternative pathway for glucose release from hepatocytes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 95 (21), 12317-12321 (1998).</li><li>Guillam, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+diabetes+and+abnormal+postnatal+pancreatic+islet+development+in+mice+lacking+Glut-2.">Early diabetes and abnormal postnatal pancreatic islet development in mice lacking Glut-2.</a> Nature Genetics. 17 (3), 327-330 (1997).</li><li>Barros, L. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetic+validation+of+6-NBDG+as+a+probe+for+the+glucose+transporter+GLUT1+in+astrocytes.">Kinetic validation of 6-NBDG as a probe for the glucose transporter GLUT1 in astrocytes.</a> Journal of Neurochemistry. 109, 94-100 (2009).</li><li>Sprinz, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+blood+glucose+level+on+18F-FDG+uptake+for+PET/CT+in+normal+organs:+A+systematic+review.">Effects of blood glucose level on 18F-FDG uptake for PET/CT in normal organs: A systematic review.</a> PLoS One. 13 (2), 0193140 (2018).</li><li>Johnson, T. V., Martin, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+characterization+of+an+adult+retinal+explant+organotypic+tissue+culture+system+as+an+in+vitro+intraocular+stem+cell+transplantation+model.">Development and characterization of an adult retinal explant organotypic tissue culture system as an in vitro intraocular stem cell transplantation model.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 49 (8), 3503-3512 (2008).</li><li>de Urquiza, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Docosahexaenoic+acid,+a+ligand+for+the+retinoid+X+receptor+in+mouse+brain.">Docosahexaenoic acid, a ligand for the retinoid X receptor in mouse brain.</a> Science. 290 (5499), 2140-2144 (2000).</li><li>Olson, A. L., Pessin, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure,+function,+and+regulation+of+the+mammalian+facilitative+glucose+transporter+gene+family.">Structure, function, and regulation of the mammalian facilitative glucose transporter gene family.</a> Annual Review of Nutrition. 16 (1), 235-256 (1996).</li><li>Muhanna, D., Arnipalli, S. R., Kumar, S. B., Ziouzenkova, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osmotic+adaptation+by+Na(+)-dependent+transporters+and+ACE2:+correlation+with+hemostatic+crisis+in+COVID-19.">Osmotic adaptation by Na(+)-dependent transporters and ACE2: correlation with hemostatic crisis in COVID-19.</a> Biomedicines. 8 (11), 460 (2020).</li><li>Ligasova, A., Koberna, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+dyes-highly+sensitive+reporters+of+cell+quantification:+comparison+with+other+cell+quantification+methods.">DNA dyes-highly sensitive reporters of cell quantification: comparison with other cell quantification methods.</a> Molecules. 26 (18), 5515 (2021).</li><li>DeFronzo, R. A., Tobin, J. D., Andres, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glucose+clamp+technique:+a+method+for+quantifying+insulin+secretion+and+resistance.">Glucose clamp technique: a method for quantifying insulin secretion and resistance.</a> American Journal of Physiology. 237 (3), 214-223 (1979).</li></ol>

Der direkte Vergleich der extrazellulären FD-Glukose-Depletion mit der normalisierten intrazellulären Glukoseaufnahme in der Zellkultur zeigte eine hohe Korrelation, was darauf hindeutet, dass der extrazelluläre Glukosemangel eine Ersatzmessung für die Beurteilung der Glukoseaufnahme sein könnte. Die Messung von extrazellulärer FD-Glukose kann einen breiten Bereich von FD-Glukosekonzentrationen verwenden, auch 0,5-2,5 μg FD-Glukose / ml scheinen den optimalen Bereich zu liefern. Extrazelluläre FD-Glukose erforder...

Die Nachfrage nach der Messung der Glukoseaufnahme steigt zusammen mit der dringenden Notwendigkeit, einen epidemischen Anstieg einer Vielzahl von Krankheiten, die vom Glukosestoffwechsel abhängen, anzugehen. Zugrunde liegende Mechanismen von degenerativen Stoffwechselerkrankungen, neurologischen und kognitiven Störungen1, entzündlichen 2 und Infektionskrankheiten3, Krebs4,5 sowie Alterung6, hängen vom Glukosestoffwechsel für Energie und deren Speicherung, anabole Prozesse, Protein- und Genmodifikation, Signalisierung, Regulation von Genen und Nukleinsäuresynthese und Replikation ab 7,8,9 . Diabetes mellitus (DM) steht in direktem Zusammenhang mit einer Fehlfunktion der Regulation der Glukoseaufnahme. DM ist ein Spektrum chronischer Krankheiten wie Typ-1-, -2- und -3-Diabetes mellitus, Schwangerschaftsdiabetes, Altersdiabetes der Jungen und andere Arten dieser Krankheit, die durch Umwelt- und / oder genetische Faktoren induziert werden. Im Jahr 2016 zeigte der erste globale Bericht der WHO über Diabetes, dass sich die Zahl der Erwachsenen, die mit der am weitesten verbreiteten DM leben, seit 1980 auf 422 Millionen Erwachsene fast vervierfachthat 10, und diese Zahl der DM-Patienten ist in den letzten Jahrzehnten exponentiell gestiegen. Allein im Jahr 2019 wurden schätzungsweise1,5 Millionen Todesfälle direkt durch 10 DM verursacht. Dieser dramatische Aufschwung ist auf den Anstieg der Typ-2-DM und die Bedingungen zurückzuführen, die sie antreiben, einschließlich Übergewicht und Fettleibigkeit10. Die COVID-19-Pandemie zeigte einen zweifachen Anstieg der Mortalität bei Patienten mit DM im Vergleich zur Allgemeinbevölkerung, was auf die tiefgreifende, aber wenig verstandene Rolle des Glukosestoffwechsels bei der Immunabwehrhindeutet 3. Prävention, Früherkennung und Behandlung von DM, Fettleibigkeit und anderen Krankheiten erfordern die Optimierung von Messungen der Glukoseaufnahme durch verschiedene Gewebe und die Identifizierung von Umweltfaktoren 11, Ernährung 12, endokrine13, genetische14 und epigenetische 15, die die Glukoseaufnahme beeinflussen.
In der Forschung wird die intrazelluläre und/oder Gewebeaufnahme von Glukose üblicherweise durch fluoreszenzmarkierte Glukose (FD-Glukose) in vitro 16,17,18 und in vivo 19 gemessen. FD-Glucose wurde zu einer bevorzugten Methode im Vergleich zu präziseren Methoden mit radioaktiv markierter Glukose 20, analytischer Massenspektroskopieanalyse 21, Metabolomik 22, Kernspinresonanzmethoden 23 und Positronenemissionstomographie/Computertomographie (PET/CT)5,24. Im Gegensatz zur Aufnahme von FD-Glukose können analytische Methoden, die mehr biologisches Material erfordern, eine mehrstufige Probenvorbereitung, teure Instrumente und komplexe Datenanalysen umfassen. Effektive und kostengünstige Messungen der FD-Glukoseaufnahme in Zellkulturen wurden in Proof-of-Concept-Experimenten verwendet und erfordern möglicherweise eine Validierung durch andere Methoden.
Die Grundlage der FD-Glukoseanwendung für Glukoseaufnahmestudien ist der reduzierte Metabolismus von FD-Glukose im Vergleich zu endogener Glukose25. Nichtsdestotrotz sind sowohl endogene Glukose als auch FD-Glukose dynamisch auf alle zellulären Kompartimente verteilt, um sie in anabolen, katabolen und Signalprozessen einzusetzen. Die Kompartimentierung und zeitabhängige Verarbeitung25 von FD-Glucose stören die Fluoreszenzmessungen und stellen die wichtigsten limitierenden Faktoren für die Verwendung dieses Assays in Hochdurchsatz-Screening-Experimenten, kinetischen Analysen, 3D-Zellkulturen, Co-Kulturen und Gewebeexplantationsexperimenten dar. Hier liefern wir Daten, die eine hohe Korrelation zwischen dem extrazellulären Abbau von FD-Glukose und seiner intrazellulären Aufnahme zeigen, was auf den extrazellulären Abbau von FD-Glucose als Ersatzmessung für die intrazelluläre Glukoseaufnahme hindeutet. Die Messung des extrazellulären Erschöpfungs von Glukose wurde angewendet, um gewebespezifische Unterschiede in der Glukoseaufnahme bei Mäusen, die mit Insulin behandelt wurden, und einem experimentellen Medikament18 zu validieren, um einen Proof-of-Principle dieser Methode zu liefern.
Das aktuelle Protokoll beschreibt intrazelluläre und extrazelluläre (Abbildung 1) Messungen der FD-Glukoseaufnahme in 3T3-L1-Zellen. Protokollabschnitte 1-7 erklären die Kultur und das Wachstum von Zellen für 48 h; Zellhunger, Stimulation und extrazelluläre Basismessungen; und Poststimulationsmessungen von extrazellulärer FD-Glucose und intrazellulären Messungen von FD-Glucose und Protein. Protokollabschnitt 8 beschreibt die Ex-vivo-Messung der extrazellulären Aufnahme von FD-Glucose in Geweben, die von ob /ob-Mäusen in Gegenwart und Abwesenheit von Insulin und Aminosäureverbindung 2 (AAC2) seziert wurden, wie an anderer Stelle18 beschrieben.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>3T3-L1 mouse fibroblasts</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CL-173</td>
			<td>Cell line</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plates</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353227</td>
			<td>Plastic ware</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B6.V-Lepob/J male mice</td>
			<td>Jackson Laboratory</td>
			<td>stock number 000632</td>
			<td>Mice</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BioTek Synergy H1 modular multimode microplate reader (Fisher Scientific, US)</td>
			<td>Fisher Scientific, US</td>
			<td>&#160;B-SHT</td>
			<td>Device</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum</td>
			<td>Gibco/ThermoFisher</td>
			<td>161790-060</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calf serum</td>
			<td>Gibco/ThermoFisher</td>
			<td>26010-066</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell incubator</td>
			<td>Forma</td>
			<td>Series II Water Jacket</td>
			<td>Device</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diet (mouse/rat diet, irradiated)</td>
			<td>Envigo</td>
			<td>Teklad LM-485</td>
			<td>Diet</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethylsulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Sigma LifeScience</td>
			<td>D2650-100mL</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium</td>
			<td>Gibco/ThermoFisher</td>
			<td>&#160;11965-092</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>E7023-500mL</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent 2-deoxy-2-[(7-nitro-2,1,3-benzoxadiazol-4-yl) amino]-D-glucose)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>72987-1MG</td>
			<td>Assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose-free and phenol red-free DMEM</td>
			<td>Gibco/ThermoFisher</td>
			<td>A14430-01</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human insulin 10 mg/mL</td>
			<td>MilliporeSigma, Cat N 91077C</td>
			<td>Cat N 91077C</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane, 5%</td>
			<td>Henry Schein</td>
			<td>NDC 11695-6776-2</td>
			<td>Anestaetic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/streptomycin (P/S)</td>
			<td>Gibco/ThermoFisher</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>DA537-500 mL</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce bicinchoninic acid (BCA) protein assay</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>Cat N23225</td>
			<td>Assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Radioimmunoprecipitation assay lysis buffer</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-24948</td>
			<td>Assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0.05%)</td>
			<td>Gibco/ThermoFisher</td>
			<td>&#160;25300-054</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

extracellular glucose depletion as an indirect measure of glucose uptake in cells and tissues ex vivo

Die anhaltende weltweite Diabetes-Epidemie erhöht die Nachfrage nach der Identifizierung von umweltbedingten, ernährungsphysiologischen, endokrinen, genetischen und epigenetischen Faktoren, die die Glukoseaufnahme beeinflussen. Die Messung der intrazellulären Fluoreszenz ist eine weit verbreitete Methode, um die Aufnahme von fluoreszenzmarkierter Glukose (FD-Glukose) in Zellen in vitro zu testen oder um glukoseverbrauchende Gewebe in vivo abzubilden. Dieser Assay bewertet die Glukoseaufnahme zu einem ausgewählten Zeitpunkt. Die intrazelluläre Analyse geht davon aus, dass der Stoffwechsel von FD-Glukose langsamer ist als der von endogener Glukose, die an katabolen und anabolen Reaktionen und Signalen beteiligt ist. Der dynamische Glukosestoffwechsel verändert jedoch auch die Aufnahmemechanismen, was kinetische Messungen der Glukoseaufnahme als Reaktion auf verschiedene Faktoren erfordern würde. Dieser Artikel beschreibt eine Methode zur Messung des extrazellulären FD-Glukose-Abbaus und validiert ihre Korrelation mit der intrazellulären FD-Glukose-Aufnahme in Zellen und Geweben ex vivo. Der extrazelluläre Glukosemangel kann potenziell für kinetische und dosisabhängige Hochdurchsatzstudien sowie für die Identifizierung von Verbindungen mit glykämischer Aktivität und ihren gewebespezifischen Wirkungen geeignet sein.

Die intrazelluläre Aufnahme und der extrazelluläre Glukosemangel wurden in 3T3-L1-Präadipozyten als Reaktion auf unterschiedliche Konzentrationen von FD-Glucose (Abbildung 2) mit und ohne Insulinstimulation gemessen. Abbildung 2A zeigt eine dosisabhängige Erhöhung der intrazellulären Aufnahme von FD-Glukose, die in Gegenwart von Insulin signifikant erhöht war. Die gleichzeitige Abnahme der extrazellulären FD-Glukose in denselben Zellen ist in <strong cla...

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Extracellular Glucose Depletion as an Indirect Measure of Glucose Uptake in Cells and Tissues Ex Vivo

Die extrazelluläre Erschöpfung von fluoreszenzmarkierter Glukose korreliert mit der Glukoseaufnahme und könnte für das Hochdurchsatz-Screening der Glukoseaufnahme in ausgeschnittenen Organen und Zellkulturen verwendet werden.

Extrazellulärer Glukosemangel als indirektes Maß für die Glukoseaufnahme in Zellen und Geweben ex vivo

The ongoing worldwide epidemic of diabetes increases the demand for the identification of environmental, nutritional, endocrine, genetic, and epigenetic ...

Die Glukoseaufnahme ist der Schlüssel zum Verständnis von Gesundheit und Krankheit. Denn Glukose spielt eine entscheidende Rolle bei metabolischen und strukturellen Anforderungen im menschlichen Körper sowie eine wichtige Rolle bei der Regulierung. Die extrazelluläre Messung von Glukose ermöglicht die Entwicklung von Hochdurchsatz-Assays für die Kinetik der Glukoseaufnahme in Zellen, Geweben und Organen unterschiedlicher genetischer Herkunft als Reaktion auf Nährstoffe oder Medikamente.Dieser Assay wäre ein wertvolles Werkzeug für die Entdeckung von Therapeutika und Ernährung für Diabetes, Krebs, degenerative Erkrankungen des zentralen Nervensystems, Fettleibigkeit und alle Erkrankungen der Glukose und des Stoffwechsels. Der Assay benötigt eine Anpassung der Zeit für Hunger und Stimulation, die auf metabolischen Besonderheiten für verschiedene Gewebe und Zellkulturen basieren sollte. Kultur von 3T3-L1-Mausfibroblasten durch Plattieren von 10 bis 6 Zellen, verdünnt in 20 Milliliter Medium 1 in 296 Well-Platten.Platte 100 Mikroliter Zellsuspension pro Vertiefung, um die Homogenität dieser Suspension durch Mischen zu erhalten. Züchten Sie Zellen für 48 Stunden in einem 37-Grad-Inkubator ohne Medienwechsel bis etwa 70 bis 80% Konfluenz. Halten Sie die Zellen konfluent und nüchtern, indem Sie sie 48 Stunden lang im selben Medium kultivieren.Variieren Sie die Inkubationszeit von 24 bis 72 Stunden, abhängig vom gewünschten katabolen Fastenzustand. Dekantieren Sie Medien aus Zellen in den 96 Well-Platten. Nehmen Sie die restliche Flüssigkeit mit sterilen Papiertüchern auf.Spülen Sie die 96-Well-Platte mit 100 Mikrolitern PBS pro Vertiefung ab und nehmen Sie die restliche Flüssigkeit mit sterilen Papiertüchern auf. Fügen Sie 100 Mikroliter glukosefreies DMEM pro Vertiefung hinzu und inkubieren Sie für 40 Minuten. Passen Sie die Inkubationszeit in Abhängigkeit von den Reizen des Zelltyps und dem gewünschten Fastenniveau an.Verwenden Sie acht Replikate für jede Simulationsbedingung. Bereiten Sie daher für jede Simulationsbedingung einen Milliliter vor. Verwenden Sie sieben Simulationsbedingungen ohne Insulin.FD-Glukose von 2,5 Mikrogramm pro Milliliter, 1 Mikrogramm pro Milliliter, 0,5 Mikrogramm pro Milliliter, 0,2 Mikrogramm pro Milliliter, 0,1 Mikrogramm pro Milliliter, 0,05 Mikrogramm pro Milliliter und 0 Milligramm pro Milliliter in 196-Well-Platte. Verwenden Sie sieben Stimulationsbedingungen mit Insulin. FD-Glucose von 2,5 Mikrogramm pro Milliliter, 1 Mikrogramm pro Milliliter, 0,5 Mikrogramm pro Milliliter, 0,2 Mikrogramm pro Milliliter, 0,1 Mikrogramm pro Milliliter, 0,05 Mikrogramm pro Milliliter und 0 Mikrogramm pro Milliliter in einer weiteren 96-Well-Platte.Um die Stimulationsbedingungen vorzubereiten, verdünnen Sie einen Mikroliter von fünf Milligramm pro Milliliter FD-Glucose-Arbeitslösung und 999 Mikroliter glukosefreies DMEM, um einen Milliliter Arbeitsstammlösung zu erhalten. Unter Verwendung dieser Arbeitsmateriallösung werden 1 bis 2000, 1 bis 5.000, 1 bis 10.000, 1 bis 25.000, 1 bis 50.000 und 1 bis 100.000 Wahnvorstellungen von FD-Glucose hergestellt, um 2,5 Mikrogramm pro Milliliter, 1 Mikrogramm pro Milliliter, 0,5 Mikrogramm pro Milliliter, 0,2 Mikrogramm pro Milliliter, 0,1 Mikrogramm pro Milliliter zu erhalten, 0,05 Mikrogramm pro Milliliter in zwei Milliliterröhrchen unmittelbar vor Experimenten in einer Biosicherheitswerkbank ohne Licht. Fügen Sie zu jeder dieser Bedingungen einen Mikroliter Insulin hinzu.Nach 40 Minuten Inkubation dekantieren Sie das glukosefreie DMEM aus jeder Vertiefung in 96 Well-Platten und absorbieren Sie die restliche Flüssigkeit mit sterilen Papiertüchern. Fügen Sie jeweils 100 Mikroliter aus den verschiedenen zuvor beschriebenen Behandlungsbedingungen in Vertiefungen entlang einer Säule hinzu. Und 100 Mikroliter aus dem gleichen Behandlungszustand zu den Vertiefungen entlang der Reihe in beiden 96 Wandplatten.Beschriften Sie die Platten, die die Bedingungen verwendeten, mit und ohne Insulin. Fügen Sie glukosefreies DMEM allein in die Kontrollmulden hinzu. Inkubieren Sie die Platte für 40 Minuten im Zellkulturinkubator im Dunkeln.Nachdem die Zellen für 40 Minuten stimuliert wurden. Übertragen Sie die Stimulationsmedien von beiden Platten in neue 96-Well-Platten unter Beibehaltung des gleichen experimentellen Layouts. Waschen Sie die Zellen mit PBS.Entfernen Sie PBS und dekantieren Sie die restliche Lösung auf sterilen Papiertüchern. Fügen Sie dem Radioimmunpräzipitations-Assay-Puffer einen Proteaseinhibitor hinzu, um Proteine zu schützen. Legen Sie Platten mit Radioimmunpräzipitationstest für 30 Minuten in einen Shaker.Messen Sie mit einem Mikrotiterplatten-Reader die Fluoreszenz bei Anregungs- und Emissionswellenlängen bei 485 bzw. 535 Nanometern. Zuerst in dem Medium, das extrazelluläre FD-Glukose enthält, und dann die Platte mit Radioimmunpräzipitationstest lisierte Zellen am Ende der 30-minütigen Inkubation. Führen Sie den BCA-Proteintest gemäß den Anweisungen des Herstellers durch.Quantifizierung der Proteinkonzentrationen in jeder Vertiefung, die Radioimmunpräzipitationstests enthält. Verwenden Sie 10 Mikroliter des Radio-Immunpräzipitationsassays Homogenat und messen Sie Proteinkonzentrationen und verdreifachen Sie, um die Genauigkeit der Messungen in 96 Well-Platten zu erhöhen. Quantifizieren Sie das Protein basierend auf Proteinstandards, die zusammen mit Proben auf jeder 96-Well-Platte analysiert werden.Inkubieren Sie das entnommene Gewebe oder die Organe eine Minute lang in einer Platte mit sechs Vertiefungen, die PBS enthält. Behandeln Sie jedes Gewebe oder Organ in einem separaten Brunnen. Nach einer Minute legen Sie jedes Taschentuch auf ein steriles Papiertuch, um PBS zu absorbieren.Übertragen Sie Gewebe oder Organe in eine separate sechswandige Platte mit 4.000 Mikrolitern glukosefreiem DMEM und inkubieren Sie zwei Minuten lang. Nach zwei Minuten das Gewebe entfernen und in Vertiefungen einer Sechs-Well-Platte mit 0,29 Millimolar FD-Glukose-Arbeitslösung überführen. Inkubieren Sie die sechs Well-Platten, die Gewebe enthalten, in FD-Glukose-Arbeitslösung bei 37 Grad Celsius.Sammeln Sie 100 Mikroliter FD-Glukose-Arbeitslösung aus jeder Vertiefung nach 0, 10, 20, 30, 40, 60, 90 und 120 Minuten Inkubation und übertragen Sie gesammelte 100 Mikroliter FD-Glukose-Arbeitslösung in 96 Well-Platten, um die Kinetik der extrazellulären FD-Glukoseverarmung zu analysieren. Vor und nach der Sammlung schütteln. Messen Sie die Fluoreszenz bei Anregung in Emissionswellenlängen bei 485 bzw. 535 Nanometer mit einem Mikroplattenleser.Die Dosisabhängigkeit bei der intrazellulären Aufnahme von FD-Glukose war in Gegenwart von Insulin signifikant erhöht. Die Insulinstimulation führte zu signifikant verringerten extrazellulären FD-Glukosespiegeln im Vergleich zu den Proben ohne Insulinstimulation. Die extrazelluläre Erschöpfung von FD-Glukose kann eine Änderung der Glukoseaufnahme mit vergleichbarer Genauigkeit messen wie die intrazelluläre FD-Glukoseaufnahme.Die extrazelluläre FD-Glukose war während der 120-minütigen Inkubation nicht in nicht stimuliertem viszeralem Kontrollfett erschöpft. Im Gegensatz dazu führte die Vorbehandlung von Mäusen mit Insulin oder AAC2 vor der Dissektion zu einer signifikanten Erschöpfung der extrazellulären FD-Glukose innerhalb eines Zeitintervalls von 30 Minuten bzw. 60 Minuten. Extrazelluläre FD-Glukose war in insulinstimulierten Leberexplantaten im Vergleich zu nicht stimulierten Leberexplantaten nicht erschöpft.Extrazelluläre FD-Glukose war zeitabhängig signifikant erniedrigt, und Leberexplantate, die mit AAC2,22% vorbehandelt wurden, wurde im extrazellulären Medium, das das nicht behandelte Gehirn enthielt, nach 60 Minuten Inkubation beobachtet. Das Medium, das mit Gehirnen von insulinbehandelten Mäusen inkubiert wurde, zeigte eine lineare Abnahme der FD-Glukose um 5%. AAC2-stimulierte Gehirne führten zu einem tiefgreifenden schnellen Abfall auf 67,4% der extrazellulären FD-Glukose während der ersten 20 Minuten.Substanzen, die gewaschen werden, sind besonders wichtig, um Spuren von Glukose, Blut oder Serum im Medium und/oder in Organen zu entfernen, da sie die Fluoreszenzmessung dieser Medien stören können. Nach Hochdurchsatz konnten Verbindungen von Metaboliten in Genen mit glykämischen Eigenschaften sowie die optimalen Bedingungen für ihre Wirkung in vivo Experimente mit markierter FD-Glukose und PET-Scanning validiert werden, um die Glukoseakkumulation in bestimmten Organen zu bestätigen. Diese Technik zur Entdeckung der glykämischen Wirkung ist sowohl vorteilhaft bei der Deletion zahlreicher Metaboliten, Therapeutika oder deren Kombinationen als auch bei der Hervorhebung ihrer Wirkungen in verschiedenen Organen.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Extracellular Glucose Depletion as an Indirect Measure of Glucose Uptake in Cells and Tissues Ex Vivo

A Method for Measuring RNA N6-methyladenosine Modifications in Cells and Tissues

A Method for Measuring RNA N6-methyladenosine Modifications in Cells and Tissues

Verfahren zum Messen von RNA<em&gt; N</em<sup&gt; 6</sup&gt; -methyladenosine Änderungen in Zellen und Geweben

N6-Methyladenosine (m6A) modifications of RNA are diverse and ubiquitous amongst eukaryotes. They occur in mRNA, rRNA, tRNA, and microRNA. Recent studies ...

Forschung

Biochemie

Brain Membrane Fractionation: An Ex Vivo Approach to Assess Subsynaptic Protein Localization

Brain Membrane Fractionation: An Ex Vivo Approach to Assess Subsynaptic Protein Localization

Gehirn Membran Fraktionierung: An<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Ansatz zur Bewertung der Subsynaptischen Protein-Lokalisierung

Assessing the synaptic protein composition and function constitutes an important challenge in neuroscience. However, it is not easy to evaluate ...

Dissipative Microgravimetry to Study the Binding Dynamics of the Phospholipid Binding Protein Annexin A2 to Solid-supported Lipid Bilayers Using a Quartz Resonator

Dissipative Microgravimetry die Bindung Dynamik der Phospholipid-bindende Protein Annexin A2, solide unterstützt Lipid Bilayer mit einem Quarz-Resonator zu studieren

The dissipative quartz crystal microbalance technique is a simple and label-free approach to measure simultaneously the mass uptake and viscoelastic ...

Analysis of Endocytic Uptake and Retrograde Transport to the Trans-Golgi Network Using Functionalized Nanobodies in Cultured Cells

Analyse der Endocytic Aufnahme und retrograder Transport mit funktionalisierten Nanobodies in kultivierten Zellen mit dem Trans-Golgi-Netzwerk

Transport of proteins and membranes from the cell surface to the Golgi and beyond is essential for homeostasis, organelle identity and physiology. To ...

Atomic Absorbance Spectroscopy to Measure Intracellular Zinc Pools in Mammalian Cells

Atomische Absorbance-Spektroskopie zur Messung von intrazellulären Zink-Pools in den Mamänarchalzellen

Transition metals are essential micronutrients for organisms but can be toxic to cells at high concentrations by competing with physiological metals in ...

Quantification of Coenzyme A in Cells and Tissues

Quantifizierung von Coenzym A in Zellen und Geweben

Emerging research has revealed that the cellular coenzyme A (CoA) supply can become limiting with a detrimental impact on growth, metabolism and survival. ...

An Integrated Raman Spectroscopy and Mass Spectrometry Platform to Study Single-Cell Drug Uptake, Metabolism, and Effects

Eine integrierte Raman-Spektroskopie- und Massenspektrometrie-Plattform zur Untersuchung der Aufnahme von Einzelzellen-Medikamenten, des Stoffwechsels und der Effekte

Cells are known to be inherently heterogeneous in their responses to drugs. Therefore, it is essential that single-cell heterogeneity is accounted for in ...

Using an Extracellular Flux Analyzer to Measure Changes in Glycolysis and Oxidative Phosphorylation during Mouse Sperm Capacitation

Verwendung eines extrazellulären Flux-Analyzers zur Messung von Veränderungen in der Glykolyse und oxidativen Phosphorylierung während der Maus Sperma-Capacitation

Mammalian sperm acquire fertilization capacity in the female reproductive tract in a process known as capacitation. Capacitation-associated processes ...

Ex Vivo Hepatic Perfusion Through the Portal Vein in Mouse

Ex Vivo Hepatic Perfusion Through the Portal Vein in Mouse

Ex vivo Leberperfusion durch die Portalader in der Maus

Metabolic diseases such as diabetes, pre-diabetes, non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD), and nonalcoholic steatohepatitis (NASH) are becoming ...

Stable Isotope Tracing & LC-MS Analysis to Measure DHODH and SDH Activities

Oxygen-Independent Assays to Measure Mitochondrial Function in Mammals

Oxygen-Independent Assays to Measure Mitochondrial Function in Mammals (Video) | JoVE 

Sauerstoffunabhängige Assays zur Messung der mitochondrialen Funktion bei Säugetieren

The flow of electrons in the mitochondrial electron transport chain (ETC) supports multifaceted biosynthetic, bioenergetic, and signaling functions in ...