Name: extracellular glucose depletion as an indirect measure of glucose uptake in cells and tissues ex vivo
Uploaded: 2022-04-06T14:20:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Extracellular Glucose Depletion as an Indirect Measure of Glucose Uptake in Cells and Tissues Ex Vivo at JoVE.com

Il progetto è stato sostenuto da Ralph e Marian Falk Medical Research Catalyst Award e Kathleen Kelly Award. Altri supporti includevano il National Center for Research Resources UL1RR025755 e NCI P30CA16058 (OSUCCC), la roadmap NIH per la ricerca medica. Il contenuto è di esclusiva responsabilità degli autori e non rappresenta le opinioni ufficiali del National Center for Research Resources o del NIH.

Gli studi sugli animali sono stati approvati dall'Institutional Animal Care and Use Committee della Ohio State University (OSU, protocollo 2007A0262-R4).
NOTA: Tutte le procedure devono essere eseguite in un armadio di biosicurezza di classe II con il ventilatore acceso e le luci spente.
1. Preparazione dei materiali
NOTA: Tutti i materiali sono elencati nella Tabella dei materiali.
<ol><li>Preparare il...

<ol>
	<li>Kyrtata, N., Emsley, H. C. A., Sparasci, O., Parkes, L. M., Dickie, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+systematic+review+of+glucose+transport+alterations+in+Alzheimer's+disease.">A systematic review of glucose transport alterations in Alzheimer's disease.</a> Frontiers in Neuroscience. 15, 568 (2021).</li><li>Garcia-Carbonell, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Critical+role+of+glucose+metabolism+in+rheumatoid+arthritis+fibroblast-like+synoviocytes.">Critical role of glucose metabolism in rheumatoid arthritis fibroblast-like synoviocytes.</a> Arthritis Rheumatology. 68 (7), 1614-1626 (2016).</li><li>Kumar, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Is+diabetes+mellitus+associated+with+mortality+and+severity+of+COVID-19?+A+meta-analysis.">Is diabetes mellitus associated with mortality and severity of COVID-19? A meta-analysis.</a> Diabetes &amp; Metabolic Syndrome: Clinical Research &amp; Review. 14 (4), 535-545 (2020).</li><li>Lee, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Different+prognostic+impact+of+glucose+uptake+in+visceral+adipose+tissue+according+to+sex+in+patients+with+colorectal+cancer.">Different prognostic impact of glucose uptake in visceral adipose tissue according to sex in patients with colorectal cancer.</a> Scientific Reports. 11 (1), 21556 (2021).</li><li>Miner, M. W. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of:+(2S,4R)-4-[(18)F]Fluoroglutamine,+[(11)C]Methionine,+and+2-Deoxy-2-[(18)F]Fluoro-D-Glucose+and+two+small-animal+PET/CT+systems+imaging+rat+gliomas.">Comparison of: (2S,4R)-4-[(18)F]Fluoroglutamine, [(11)C]Methionine, and 2-Deoxy-2-[(18)F]Fluoro-D-Glucose and two small-animal PET/CT systems imaging rat gliomas.</a> Frontiers in Oncology. 11 (18), 730358 (2021).</li><li>Gumbiner, B., Thorburn, A. W., Ditzler, T. M., Bulacan, F., Henry, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+impaired+intracellular+glucose+metabolism+in+the+insulin+resistance+of+aging.">Role of impaired intracellular glucose metabolism in the insulin resistance of aging.</a> Metabolism. 41 (10), 1115-1121 (1992).</li><li>Ebrahimi, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beta+cell+identity+changes+with+mild+hyperglycemia:+Implications+for+function,+growth,+and+vulnerability.">Beta cell identity changes with mild hyperglycemia: Implications for function, growth, and vulnerability.</a> Molecular Metabolism. 35, 100959 (2020).</li><li>Ruberto, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=KLF10+integrates+circadian+timing+and+sugar+signaling+to+coordinate+hepatic+metabolism.">KLF10 integrates circadian timing and sugar signaling to coordinate hepatic metabolism.</a> Elife. 10, 65574 (2021).</li><li>Stocks, B., Zierath, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Post-translational+modifications:+The+signals+at+the+intersection+of+exercise,+glucose+uptake,+and+insulin+sensitivity.">Post-translational modifications: The signals at the intersection of exercise, glucose uptake, and insulin sensitivity.</a> Endocrinology Reviews. , (2021).</li><li>World Health Organization. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+report+on+diabetes.">Global report on diabetes.</a> World Health Organization. , (2016).</li><li>Kolb, H., Martin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Environmental/lifestyle+factors+in+the+pathogenesis+and+prevention+of+type+2+diabetes.">Environmental/lifestyle factors in the pathogenesis and prevention of type 2 diabetes.</a> BMC Medicine. 15 (1), 131 (2017).</li><li>Galicia-Garcia, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathophysiology+of+type+2+diabetes+mellitus.">Pathophysiology of type 2 diabetes mellitus.</a> International Journal of Molecular Science. 21 (17), 6275 (2020).</li><li>Petrov, M. S., Basina, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DIAGNOSIS+OF+ENDOCRINE+DISEASE:+Diagnosing+and+classifying+diabetes+in+diseases+of+the+exocrine+pancreas.">DIAGNOSIS OF ENDOCRINE DISEASE: Diagnosing and classifying diabetes in diseases of the exocrine pancreas.</a> European Journal of Endocrinology. 184 (4), 151-163 (2021).</li><li>Sirdah, M. M., Reading, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+predisposition+in+type+2+diabetes:+A+promising+approach+toward+a+personalized+management+of+diabetes.">Genetic predisposition in type 2 diabetes: A promising approach toward a personalized management of diabetes.</a> Clinical Genetics. 98 (6), 525-547 (2020).</li><li>Ramos-Lopez, O., Milagro, F. I., Riezu-Boj, J. I., Martinez, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetic+signatures+underlying+inflammation:+an+interplay+of+nutrition,+physical+activity,+metabolic+diseases,+and+environmental+factors+for+personalized+nutrition.">Epigenetic signatures underlying inflammation: an interplay of nutrition, physical activity, metabolic diseases, and environmental factors for personalized nutrition.</a> Inflammation Research. 70 (1), 29-49 (2021).</li><li>Yamamoto, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+glucose+uptake+in+cultured+cells.">Measurement of glucose uptake in cultured cells.</a> Current Protocols in Pharmacology. 71 (1), 12-14 (2015).</li><li>Yang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+sensitive+and+simple+HPLC-FLD-based+method+for+the+measurement+of+intracellular+glucose+uptake.">A sensitive and simple HPLC-FLD-based method for the measurement of intracellular glucose uptake.</a> Food Chemistry. 372, 131218 (2021).</li><li>Lee, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amino+acid-based+compound+activates+atypical+PKC+and+leptin+receptor+pathways+to+improve+glycemia+and+anxiety+like+behavior+in+diabetic+mice.">Amino acid-based compound activates atypical PKC and leptin receptor pathways to improve glycemia and anxiety like behavior in diabetic mice.</a> Biomaterials. 239, 119839 (2020).</li><li>Shukla, S. K., Mulder, S. E., Singh, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypoxia-mediated+in+vivo+tumor+glucose+uptake+measurement+and+analysis.">Hypoxia-mediated in vivo tumor glucose uptake measurement and analysis.</a> Methods in Molecular Biology. 1742, 107-113 (2018).</li><li>Jakson, I., Ujvari, D., Brusell Gidlof, S., Linden Hirschberg, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insulin+regulation+of+solute+carrier+family+2+member+1+(glucose+transporter+1)+expression+and+glucose+uptake+in+decidualizing+human+endometrial+stromal+cells:+an+in+vitro+study.">Insulin regulation of solute carrier family 2 member 1 (glucose transporter 1) expression and glucose uptake in decidualizing human endometrial stromal cells: an in vitro study.</a> Reproductive Biology and Endocrinology. 18 (1), 117 (2020).</li><li>Saparbaev, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+quantification+of+any+isoforms+of+carbohydrates+by+2D+UV-MS+fingerprinting+of+cold+ions.">Identification and quantification of any isoforms of carbohydrates by 2D UV-MS fingerprinting of cold ions.</a> Analytical Chemistry. 92 (21), 14624-14632 (2020).</li><li>Schulz, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+metabolomics+of+pellicle+and+saliva+in+children+with+different+caries+activity.">Targeted metabolomics of pellicle and saliva in children with different caries activity.</a> Scientific Reports. 10 (1), 697 (2020).</li><li>Shulman, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+magnetic+resonance+studies+of+glucose+metabolism+in+non-insulin-dependent+diabetes+mellitus+subjects.">Nuclear magnetic resonance studies of glucose metabolism in non-insulin-dependent diabetes mellitus subjects.</a> Molecular Medicine. 2 (5), 533-540 (1996).</li><li>Cochran, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+PET+imaging+with+[(18)F]FDG+to+explain+improved+glucose+uptake+in+an+apolipoprotein+A-I+treated+mouse+model+of+diabetes.">In vivo PET imaging with [(18)F]FDG to explain improved glucose uptake in an apolipoprotein A-I treated mouse model of diabetes.</a> Diabetologia. 59 (18), 1977-1984 (2016).</li><li>Lloyd, P. G., Hardin, C. D., Sturek, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Examining+glucose+transport+in+single+vascular+smooth+muscle+cells+with+a+fluorescent+glucose+analog.">Examining glucose transport in single vascular smooth muscle cells with a fluorescent glucose analog.</a> Physiological Research. 48 (6), 401-410 (1999).</li><li>Beeton, C., Garcia, A., Chandy, K. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drawing+blood+from+rats+through+the+saphenous+vein+and+by+cardiac+puncture.">Drawing blood from rats through the saphenous vein and by cardiac puncture.</a> Journal of Visualized Experiments. (7), e266 (2007).</li><li>DiSilvestro, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leptin+production+by+encapsulated+adipocytes+increases+brown+fat,+decreases+resistin,+and+improves+glucose+intolerance+in+obese+mice.">Leptin production by encapsulated adipocytes increases brown fat, decreases resistin, and improves glucose intolerance in obese mice.</a> PLoS One. 11 (4), 0153198 (2016).</li><li>Friedman, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leptin+and+the+endocrine+control+of+energy+balance.">Leptin and the endocrine control of energy balance.</a> Nature Metabolism. 1 (8), 754-764 (2019).</li><li>Guillam, M. T., Burcelin, R., Thorens, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Normal+hepatic+glucose+production+in+the+absence+of+GLUT2+reveals+an+alternative+pathway+for+glucose+release+from+hepatocytes.">Normal hepatic glucose production in the absence of GLUT2 reveals an alternative pathway for glucose release from hepatocytes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 95 (21), 12317-12321 (1998).</li><li>Guillam, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+diabetes+and+abnormal+postnatal+pancreatic+islet+development+in+mice+lacking+Glut-2.">Early diabetes and abnormal postnatal pancreatic islet development in mice lacking Glut-2.</a> Nature Genetics. 17 (3), 327-330 (1997).</li><li>Barros, L. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetic+validation+of+6-NBDG+as+a+probe+for+the+glucose+transporter+GLUT1+in+astrocytes.">Kinetic validation of 6-NBDG as a probe for the glucose transporter GLUT1 in astrocytes.</a> Journal of Neurochemistry. 109, 94-100 (2009).</li><li>Sprinz, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+blood+glucose+level+on+18F-FDG+uptake+for+PET/CT+in+normal+organs:+A+systematic+review.">Effects of blood glucose level on 18F-FDG uptake for PET/CT in normal organs: A systematic review.</a> PLoS One. 13 (2), 0193140 (2018).</li><li>Johnson, T. V., Martin, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+characterization+of+an+adult+retinal+explant+organotypic+tissue+culture+system+as+an+in+vitro+intraocular+stem+cell+transplantation+model.">Development and characterization of an adult retinal explant organotypic tissue culture system as an in vitro intraocular stem cell transplantation model.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 49 (8), 3503-3512 (2008).</li><li>de Urquiza, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Docosahexaenoic+acid,+a+ligand+for+the+retinoid+X+receptor+in+mouse+brain.">Docosahexaenoic acid, a ligand for the retinoid X receptor in mouse brain.</a> Science. 290 (5499), 2140-2144 (2000).</li><li>Olson, A. L., Pessin, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure,+function,+and+regulation+of+the+mammalian+facilitative+glucose+transporter+gene+family.">Structure, function, and regulation of the mammalian facilitative glucose transporter gene family.</a> Annual Review of Nutrition. 16 (1), 235-256 (1996).</li><li>Muhanna, D., Arnipalli, S. R., Kumar, S. B., Ziouzenkova, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osmotic+adaptation+by+Na(+)-dependent+transporters+and+ACE2:+correlation+with+hemostatic+crisis+in+COVID-19.">Osmotic adaptation by Na(+)-dependent transporters and ACE2: correlation with hemostatic crisis in COVID-19.</a> Biomedicines. 8 (11), 460 (2020).</li><li>Ligasova, A., Koberna, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+dyes-highly+sensitive+reporters+of+cell+quantification:+comparison+with+other+cell+quantification+methods.">DNA dyes-highly sensitive reporters of cell quantification: comparison with other cell quantification methods.</a> Molecules. 26 (18), 5515 (2021).</li><li>DeFronzo, R. A., Tobin, J. D., Andres, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glucose+clamp+technique:+a+method+for+quantifying+insulin+secretion+and+resistance.">Glucose clamp technique: a method for quantifying insulin secretion and resistance.</a> American Journal of Physiology. 237 (3), 214-223 (1979).</li></ol>

Il confronto diretto della deplezione extracellulare di FD-glucosio con l'assorbimento di glucosio intracellulare normalizzato nella coltura cellulare ha mostrato un'alta correlazione, suggerendo che l'esaurimento extracellulare del glucosio potrebbe essere una misura surrogata per la valutazione dell'assorbimento del glucosio. La misurazione del glucosio FD extracellulare può utilizzare una vasta gamma di concentrazioni di glucosio FD, anche 0,5-2,5 μg FD-glucosio / mL sembrano fornire l'intervallo ottimale. Il glucos...

La domanda di misurazione dell'assorbimento di glucosio aumenta insieme alla necessità critica di affrontare un aumento epidemico di una moltitudine di malattie dipendenti dal metabolismo del glucosio. I meccanismi alla base delle malattie metaboliche degenerative, dei disturbi neurologici e cognitivi1, delle malattie infiammatorie2 e infettive3, del cancro 4,5, così come dell'invecchiamento6, dipendono dal metabolismo del glucosio per l'energia e il suo stoccaggio, i processi anabolici, le proteine e la modificazione genica, la segnalazione, la regolazione dei geni e la sintesi e la replicazione degli acidi nucleici 7,8,9 . Il diabete mellito (DM) è direttamente correlato al malfunzionamento della regolazione dell'assorbimento del glucosio. La DM è uno spettro di malattie croniche come il diabete mellito di tipo 1, -2 e -3, il diabete gestazionale, il diabete ad esordio maturo dei giovani e altri tipi di questa malattia indotti da fattori ambientali e / o genetici. Nel 2016, il primo rapporto globale dell'OMS sul diabete ha dimostrato che il numero di adulti che vivono con il DM più diffuso è quasi quadruplicato dal 1980 a 422 milioni di adulti10, e questo numero di pazienti DM è aumentato esponenzialmente negli ultimi decenni. Solo nel 2019, una stima di 1,5 milioni di morti è stata causata direttamente da10 DM. Questo drammatico aumento è dovuto all'aumento del DM di tipo 2 e alle condizioni che lo guidano, tra cui sovrappeso e obesità10. La pandemia di COVID-19 ha rivelato un aumento di due volte della mortalità nei pazienti con DM rispetto alla popolazione generale, suggerendo il ruolo profondo ma poco compreso del metabolismo del glucosio nella difesa immunitaria3. La prevenzione, la diagnosi precoce e il trattamento del DM, dell'obesità e di altre malattie richiedono l'ottimizzazione delle misurazioni dell'assorbimento del glucosio da parte di diversi tessuti e l'identificazione dei fattori ambientali11, nutrizionali12, endocrini13,genetici 14 ed epigenetici15 che influenzano l'assorbimento del glucosio.
Nella ricerca, l'assorbimento intracellulare e/o tissutale di glucosio è comunemente misurato da glucosio marcato fluorescentemente (FD-glucosio) in vitro 16,17,18 e in vivo19. Fd-glucosio è diventato un metodo preferito rispetto a metodi più precisi che utilizzano glucosio20 marcato radioattivamente, analisi analitica di spettroscopiadi massa 21, metabolomica22, metodi di risonanza magnetica nucleare23 e tomografia ad emissione di positroni / tomografia computerizzata (PET / CT) 5,24. A differenza dell'assorbimento di FD-glucosio, i metodi analitici che richiedono più materiale biologico possono comportare una preparazione del campione in più fasi, strumenti costosi e analisi di dati complessi. Misurazioni efficaci e poco costose dell'assorbimento di glucosio FD in colture cellulari sono state utilizzate in esperimenti proof-of-concept e potrebbero richiedere la convalida con altri metodi.
La base dell'applicazione di FD-glucosio per gli studi sull'assorbimento del glucosio è il ridotto metabolismo del glucosio FD rispetto al glucosio endogeno25. Tuttavia, sia il glucosio endogeno che il glucosio FD sono distribuiti dinamicamente tra tutti i compartimenti cellulari per l'uso nei processi anabolici, catabolici e di segnalazione. La compartimentazione e l'elaborazione dipendente dal tempo25 del glucosio FD interferiscono con le misurazioni di fluorescenza e rappresentano i principali fattori limitanti per l'uso di questo test in esperimenti di screening ad alto rendimento, analisi cinetica, coltura cellulare 3D, co-colture ed esperimenti di espianto tissutale. Qui, forniamo dati che dimostrano un'alta correlazione tra l'esaurimento extracellulare di FD-glucosio e il suo assorbimento intracellulare, suggerendo l'esaurimento extracellulare di FD-glucosio come misura surrogata per l'assorbimento intracellulare di glucosio. La misurazione della deplezione extracellulare del glucosio è stata applicata per convalidare le differenze tessuto-specifiche nell'assorbimento del glucosio nei topi trattati con insulina e un farmaco sperimentale18 per fornire una prova di principio di questo metodo.
L'attuale protocollo descrive le misurazioni intracellulari ed extracellulari (Figura 1) dell'assorbimento di FD-glucosio nelle cellule 3T3-L1. Le sezioni del protocollo 1-7 spiegano la coltura e la crescita delle cellule per 48 ore; fame cellulare, stimolazione e misurazioni extracellulari di base; e misure post-stimolazione di FD-glucosio extracellulare e misurazioni intracellulari di FD-glucosio e proteine. La sezione 8 del protocollo descrive la misurazione ex vivo dell'assorbimento extracellulare di FD-glucosio in tessuti sezionati da topi ob/ob in presenza e assenza di insulina e composto di aminoacidi 2 (AAC2) descritti altrove18.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>3T3-L1 mouse fibroblasts</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CL-173</td>
			<td>Cell line</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plates</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353227</td>
			<td>Plastic ware</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B6.V-Lepob/J male mice</td>
			<td>Jackson Laboratory</td>
			<td>stock number 000632</td>
			<td>Mice</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BioTek Synergy H1 modular multimode microplate reader (Fisher Scientific, US)</td>
			<td>Fisher Scientific, US</td>
			<td>&#160;B-SHT</td>
			<td>Device</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum</td>
			<td>Gibco/ThermoFisher</td>
			<td>161790-060</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calf serum</td>
			<td>Gibco/ThermoFisher</td>
			<td>26010-066</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell incubator</td>
			<td>Forma</td>
			<td>Series II Water Jacket</td>
			<td>Device</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diet (mouse/rat diet, irradiated)</td>
			<td>Envigo</td>
			<td>Teklad LM-485</td>
			<td>Diet</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethylsulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Sigma LifeScience</td>
			<td>D2650-100mL</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium</td>
			<td>Gibco/ThermoFisher</td>
			<td>&#160;11965-092</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>E7023-500mL</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent 2-deoxy-2-[(7-nitro-2,1,3-benzoxadiazol-4-yl) amino]-D-glucose)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>72987-1MG</td>
			<td>Assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose-free and phenol red-free DMEM</td>
			<td>Gibco/ThermoFisher</td>
			<td>A14430-01</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human insulin 10 mg/mL</td>
			<td>MilliporeSigma, Cat N 91077C</td>
			<td>Cat N 91077C</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane, 5%</td>
			<td>Henry Schein</td>
			<td>NDC 11695-6776-2</td>
			<td>Anestaetic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/streptomycin (P/S)</td>
			<td>Gibco/ThermoFisher</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>DA537-500 mL</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce bicinchoninic acid (BCA) protein assay</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>Cat N23225</td>
			<td>Assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Radioimmunoprecipitation assay lysis buffer</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-24948</td>
			<td>Assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0.05%)</td>
			<td>Gibco/ThermoFisher</td>
			<td>&#160;25300-054</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

extracellular glucose depletion as an indirect measure of glucose uptake in cells and tissues ex vivo

L'epidemia mondiale in corso di diabete aumenta la domanda per l'identificazione di fattori ambientali, nutrizionali, endocrini, genetici ed epigenetici che influenzano l'assorbimento del glucosio. La misurazione della fluorescenza intracellulare è un metodo ampiamente utilizzato per testare l'assorbimento di glucosio marcato fluorescentemente (FD-glucosio) nelle cellule in vitro o per l'imaging di tessuti che consumano glucosio in vivo. Questo test valuta l'assorbimento del glucosio in un punto temporale scelto. L'analisi intracellulare presuppone che il metabolismo del glucosio FD sia più lento di quello del glucosio endogeno, che partecipa alle reazioni cataboliche e anaboliche e alla segnalazione. Tuttavia, il metabolismo dinamico del glucosio altera anche i meccanismi di assorbimento, che richiederebbero misurazioni cinetiche dell'assorbimento del glucosio in risposta a diversi fattori. Questo articolo descrive un metodo per misurare l'esaurimento extracellulare di FD-glucosio e convalida la sua correlazione con l'assorbimento intracellulare di FD-glucosio in cellule e tessuti ex vivo. La deplezione extracellulare del glucosio può essere potenzialmente applicabile per studi cinetici e dose-dipendenti ad alto rendimento, nonché per l'identificazione di composti con attività glicemica e dei loro effetti specifici per i tessuti.

L'assunzione intracellulare e la deplezione extracellulare di glucosio sono state misurate nei preadipociti 3T3-L1, in risposta a diverse concentrazioni di FD-glucosio (Figura 2) con e senza stimolazione insulinica. La Figura 2A mostra un aumento dose-dipendente dell'assorbimento intracellulare di FD-glucosio, che è stato significativamente aumentato in presenza di insulina. La concomitante diminuzione del fd-glucosio extracellulare nelle stesse cellule è most...

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Extracellular Glucose Depletion as an Indirect Measure of Glucose Uptake in Cells and Tissues Ex Vivo

L'esaurimento extracellulare del glucosio marcato fluorescentemente è correlato all'assorbimento del glucosio e potrebbe essere utilizzato per lo screening ad alto rendimento dell'assorbimento del glucosio negli organi asportati e nelle colture cellulari.

Deplezione extracellulare di glucosio come misura indiretta dell'assorbimento di glucosio nelle cellule e nei tessuti Ex Vivo

The ongoing worldwide epidemic of diabetes increases the demand for the identification of environmental, nutritional, endocrine, genetic, and epigenetic ...

L'assorbimento del glucosio è la chiave per comprendere la salute e la malattia. Poiché il glucosio svolge un ruolo fondamentale nelle richieste metaboliche e strutturali nel corpo umano, oltre a svolgere un ruolo vitale nella regolazione. La misurazione extracellulare del glucosio consente lo sviluppo di saggi ad alto rendimento per la cinetica dell'assorbimento del glucosio in cellule, tessuti e organi di diverso background genetico in risposta a nutrienti o farmaci.Questo test sarebbe uno strumento prezioso per la scoperta di terapie e nutrizione per il diabete, il cancro, le malattie degenerative del sistema nervoso centrale, l'obesità e tutte le malattie del glucosio e del metabolismo. Il test richiede un aggiustamento del tempo per la fame e la stimolazione che dovrebbe essere basato sulle specifiche metaboliche per diversi tessuti e colture cellulari. Coltura 3T3-L1 fibroblasti di topo placcando 10 alle 6 cellule, diluito in 20 millilitri di mezzo 1 in 296 piastre di pozzetto.Piastra 100 microlitri di sospensione cellulare per pozzetto, assicurando di mantenere l'omogeneità di questa sospensione mediante miscelazione. Coltiva le cellule per 48 ore in un'incubatrice a 37 gradi Celsius senza cambiare terreno fino a circa il 70-80% di confluenza. Mantenere le cellule confluenti e digiunate coltivandole nello stesso mezzo per 48 ore.Variare il tempo di incubazione da 24 a 72 ore, a seconda dello stato catabolico a digiuno desiderato. Decantare i mezzi dalle celle nelle lastre a 96 pozzetti. Assorbire il fluido rimanente utilizzando asciugamani di carta sterili.Risciacquare la piastra a 96 pozzetti con 100 microlitri di PBS per pozzetto e assorbire il liquido rimanente con carta assorbente sterile. Aggiungere 100 microlitri di DMEM senza glucosio per pozzetto e incubare per 40 minuti. Regolare il tempo di incubazione in base agli stimoli del tipo di cellula e al livello desiderato di digiuno.Utilizzare otto repliche per ogni condizione di simulazione. Pertanto, preparare un millilitro per ogni condizione di simulazione. Utilizzare sette condizioni di simulazione senza insulina.Glucosio FD di 2,5 microgrammi per millilitro, 1 microgrammo per millilitro, 0,5 microgrammi per millilitro, 0,2 microgrammi per millilitro, 0,1 microgrammi per millilitro, 0,05 microgrammi per millilitro e 0 milligrammi per millilitro in 196 pozzetti. Utilizzare sette condizioni di stimolazione con insulina. Glucosio FD di 2,5 microgrammi per millilitro, 1 microgrammo per millilitro, 0,5 microgrammi per millilitro, 0,2 microgrammi per millilitro, 0,1 microgrammi per millilitro, 0,05 microgrammi per millilitro e 0 microgrammi per millilitro in un'altra piastra da 96 pozzetti.Per preparare le condizioni di stimolazione, diluire un microlitro di cinque milligrammi per millilitro di soluzione di lavoro di glucosio FD e 999 microlitri di DMEM privo di glucosio per ottenere un millilitro di soluzione madre di lavoro. Utilizzando questa soluzione di materiale di lavoro, preparare da 1 a 2000, da 1 a 5.000, da 1 a 10.000, da 1 a 25.000, da 1 a 50.000 e da 1 a 100.000 deliri di glucosio FD per ottenere 2,5 microgrammi per millilitro, 1 microgrammo per millilitro, 0,5 microgrammi per millilitro, 0,2 microgrammi per millilitro, 0,1 microgrammi per millilitro, 0,05 microgrammi per millilitro in tubi da due millilitri immediatamente prima degli esperimenti in un armadio di biosicurezza senza luci. Aggiungere un microlitro di insulina a ciascuna di queste condizioni.Dopo 40 minuti di incubazione, decantare il DMEM privo di glucosio da ciascun pozzetto in 96 piastre di pozzetto e assorbire il fluido rimanente con asciugamani di carta sterili. Aggiungere 100 microlitri ciascuno dalle varie condizioni di trattamento descritte in precedenza, ai pozzetti lungo una colonna. E 100 microlitri dalla stessa condizione di trattamento ai pozzetti lungo la fila in entrambe le 96 piastre a parete.Etichettare le piastre che hanno utilizzato le condizioni, con e senza insulina. Aggiungi DMEM privo di glucosio da solo ai pozzetti di controllo. Incubare la piastra per 40 minuti nell'incubatore di coltura cellulare al buio.Dopo che le cellule sono state stimolate per 40 minuti. Trasferire i mezzi di stimolazione da entrambe le piastre in nuove piastre da 96 pozzetti, mantenendo lo stesso layout sperimentale. Lavare le celle con PBS.Rimuovere PBS e decantare qualsiasi soluzione residua su carta assorbente sterile. Aggiungere un inibitore della proteasi al tampone di dosaggio di radioimmunoprecipitazione per proteggere le proteine. Posizionare le piastre contenenti il saggio di radioimmunoprecipitazione in uno shaker per 30 minuti.Utilizzando un lettore di micropiastre, misurare la fluorescenza a lunghezze d'onda di eccitazione ed emissione rispettivamente a 485 e 535 nanometri. Prima nel mezzo contenente glucosio FD extracellulare e poi nella piastra con cellule lizzate con saggio di radioimmunoprecipitazione alla fine di 30 minuti di incubazione. Eseguire il test della proteina BCA secondo le istruzioni del produttore.Quantificare le concentrazioni proteiche in ciascun pozzetto contenente cellule analizzate con radioimmunoprecipitazione. Utilizzare 10 microlitri di omogenato di test di radioimmunoprecipitazione, misurare le concentrazioni proteiche e triplicare per aumentare l'accuratezza delle misurazioni in 96 piastre di pozzetto. Quantificare le proteine in base agli standard proteici analizzati insieme ai campioni su ogni piastra a 96 pozzetti.Incubare i tessuti o gli organi raccolti in una piastra a sei pozzetti contenente PBS per un minuto. Maneggiare ogni tessuto o organo in un pozzetto separato. Dopo un minuto, posizionare ogni fazzoletto su un tovagliolo di carta sterile per assorbire PBS.Trasferire tessuti o organi in una piastra separata a sei pareti contenente 4.000 microlitri di DMEM privo di glucosio e incubare per due minuti. Dopo due minuti, rimuovere e trasferire i tessuti in pozzetti di una piastra a sei pozzetti contenente 0,29 millimolari di soluzione di lavoro di glucosio FD. Incubare le sei piastre del pozzetto contenenti tessuti in soluzione di lavoro di glucosio FD a 37 gradi Celsius.Raccogliere 100 microlitri di soluzione di lavoro di glucosio FD da ciascun pozzetto dopo 0, 10, 20, 30, 40, 60, 90 e 120 minuti di incubazione e trasferire 100 microlitri raccolti di soluzione di lavoro di glucosio FD in 96 piastre di pozzetto per analizzare la cinetica della deplezione extracellulare del glucosio FD. Agitare prima e dopo la raccolta. Misurare la fluorescenza all'eccitazione nelle lunghezze d'onda di emissione rispettivamente a 485 e 535 nanometri utilizzando un lettore di micropiastre.La dipendenza dalla dose nell'assorbimento intracellulare del glucosio FD è risultata significativamente aumentata in presenza di insulina. La stimolazione insulinica ha portato a una significativa diminuzione dei livelli di glucosio FD extracellulare rispetto ai campioni senza stimolazione insulinica. L'esaurimento extracellulare del glucosio FD può misurare un cambiamento nell'assorbimento del glucosio con un'accuratezza comparabile all'assorbimento intracellulare del glucosio FD.Il glucosio FD extracellulare non è stato impoverito nel grasso viscerale di controllo non stimolato durante 120 minuti di incubazione. Al contrario, il pretrattamento dei topi con insulina o AAC2 prima della dissezione, ha portato a un significativo esaurimento del glucosio FD extracellulare entro un intervallo di tempo rispettivamente di 30 minuti e 60 minuti. Il glucosio FD extracellulare non è stato esaurito negli espianti di fegato stimolati dall'insulina, rispetto agli espianti di fegato non stimolati.Il glucosio FD extracellulare è diminuito significativamente in modo dipendente dal tempo e gli espianti di fegato pretrattati con AAC 2,22% di deplezione di glucosio sono stati osservati nel mezzo extracellulare contenente il cervello non trattato dopo 60 minuti di incubazione. Il terreno incubato con cervelli di topi trattati con insulina ha mostrato una diminuzione lineare del 5% del glucosio FD. I cervelli stimolati da AAC2 hanno portato a una profonda e rapida diminuzione al 67,4% del glucosio FD extracellulare durante i primi 20 minuti.Le sostanze che comportano il lavaggio sono particolarmente importanti per rimuovere tracce di glucosio, sangue o siero all'interno del mezzo e/o degli organi, in quanto possono interferire con la lettura della fluorescenza di questi mezzi. Dopo l'identificazione ad alto rendimento di composti di metaboliti in geni con proprietà glicemiche, nonché le condizioni ottimali per la loro azione in esperimenti in vivo, potrebbero essere convalidati con glucosio FD marcato e scansione PET per confermare l'accumulo di glucosio in organi specifici. Questa tecnica per la scoperta dell'azione glicemica è utile nella delezione di numerosi metaboliti, terapie o loro combinazioni, ed evidenzia le loro azioni in diversi organi.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Extracellular Glucose Depletion as an Indirect Measure of Glucose Uptake in Cells and Tissues Ex Vivo

A Method for Measuring RNA N6-methyladenosine Modifications in Cells and Tissues

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