Name: extracellular glucose depletion as an indirect measure of glucose uptake in cells and tissues ex vivo
Uploaded: 2022-04-06T14:20:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Extracellular Glucose Depletion as an Indirect Measure of Glucose Uptake in Cells and Tissues Ex Vivo at JoVE.com

このプロジェクトは、Ralph and Marian Falk Medical Research Catalyst AwardとKathleen Kelly Awardの支援を受けました。その他の支援には、国立研究資源センターUL1RR025755およびNIH医学研究ロードマップであるNCI P30CA16058(OSUCCC)が含まれていました。コンテンツは著者の責任であり、国立研究資源センターまたはNIHの公式見解を表すものではありません。

動物実験は、オハイオ州立大学の施設動物ケアおよび使用委員会(OSU、プロトコル2007A0262-R4)によって承認された。
メモ:すべての手順は、送風機がオンでライトが消灯したクラスIIバイオセーフティキャビネットで行う必要があります。
1. 資料作成
メモ: すべての材料は、 材料の表にリストされています。...

<ol>
	<li>Kyrtata, N., Emsley, H. C. A., Sparasci, O., Parkes, L. M., Dickie, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+systematic+review+of+glucose+transport+alterations+in+Alzheimer's+disease.">A systematic review of glucose transport alterations in Alzheimer's disease.</a> Frontiers in Neuroscience. 15, 568 (2021).</li><li>Garcia-Carbonell, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Critical+role+of+glucose+metabolism+in+rheumatoid+arthritis+fibroblast-like+synoviocytes.">Critical role of glucose metabolism in rheumatoid arthritis fibroblast-like synoviocytes.</a> Arthritis Rheumatology. 68 (7), 1614-1626 (2016).</li><li>Kumar, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Is+diabetes+mellitus+associated+with+mortality+and+severity+of+COVID-19?+A+meta-analysis.">Is diabetes mellitus associated with mortality and severity of COVID-19? A meta-analysis.</a> Diabetes &amp; Metabolic Syndrome: Clinical Research &amp; Review. 14 (4), 535-545 (2020).</li><li>Lee, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Different+prognostic+impact+of+glucose+uptake+in+visceral+adipose+tissue+according+to+sex+in+patients+with+colorectal+cancer.">Different prognostic impact of glucose uptake in visceral adipose tissue according to sex in patients with colorectal cancer.</a> Scientific Reports. 11 (1), 21556 (2021).</li><li>Miner, M. W. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of:+(2S,4R)-4-[(18)F]Fluoroglutamine,+[(11)C]Methionine,+and+2-Deoxy-2-[(18)F]Fluoro-D-Glucose+and+two+small-animal+PET/CT+systems+imaging+rat+gliomas.">Comparison of: (2S,4R)-4-[(18)F]Fluoroglutamine, [(11)C]Methionine, and 2-Deoxy-2-[(18)F]Fluoro-D-Glucose and two small-animal PET/CT systems imaging rat gliomas.</a> Frontiers in Oncology. 11 (18), 730358 (2021).</li><li>Gumbiner, B., Thorburn, A. W., Ditzler, T. M., Bulacan, F., Henry, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+impaired+intracellular+glucose+metabolism+in+the+insulin+resistance+of+aging.">Role of impaired intracellular glucose metabolism in the insulin resistance of aging.</a> Metabolism. 41 (10), 1115-1121 (1992).</li><li>Ebrahimi, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beta+cell+identity+changes+with+mild+hyperglycemia:+Implications+for+function,+growth,+and+vulnerability.">Beta cell identity changes with mild hyperglycemia: Implications for function, growth, and vulnerability.</a> Molecular Metabolism. 35, 100959 (2020).</li><li>Ruberto, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=KLF10+integrates+circadian+timing+and+sugar+signaling+to+coordinate+hepatic+metabolism.">KLF10 integrates circadian timing and sugar signaling to coordinate hepatic metabolism.</a> Elife. 10, 65574 (2021).</li><li>Stocks, B., Zierath, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Post-translational+modifications:+The+signals+at+the+intersection+of+exercise,+glucose+uptake,+and+insulin+sensitivity.">Post-translational modifications: The signals at the intersection of exercise, glucose uptake, and insulin sensitivity.</a> Endocrinology Reviews. , (2021).</li><li>World Health Organization. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+report+on+diabetes.">Global report on diabetes.</a> World Health Organization. , (2016).</li><li>Kolb, H., Martin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Environmental/lifestyle+factors+in+the+pathogenesis+and+prevention+of+type+2+diabetes.">Environmental/lifestyle factors in the pathogenesis and prevention of type 2 diabetes.</a> BMC Medicine. 15 (1), 131 (2017).</li><li>Galicia-Garcia, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathophysiology+of+type+2+diabetes+mellitus.">Pathophysiology of type 2 diabetes mellitus.</a> International Journal of Molecular Science. 21 (17), 6275 (2020).</li><li>Petrov, M. S., Basina, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DIAGNOSIS+OF+ENDOCRINE+DISEASE:+Diagnosing+and+classifying+diabetes+in+diseases+of+the+exocrine+pancreas.">DIAGNOSIS OF ENDOCRINE DISEASE: Diagnosing and classifying diabetes in diseases of the exocrine pancreas.</a> European Journal of Endocrinology. 184 (4), 151-163 (2021).</li><li>Sirdah, M. M., Reading, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+predisposition+in+type+2+diabetes:+A+promising+approach+toward+a+personalized+management+of+diabetes.">Genetic predisposition in type 2 diabetes: A promising approach toward a personalized management of diabetes.</a> Clinical Genetics. 98 (6), 525-547 (2020).</li><li>Ramos-Lopez, O., Milagro, F. I., Riezu-Boj, J. I., Martinez, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetic+signatures+underlying+inflammation:+an+interplay+of+nutrition,+physical+activity,+metabolic+diseases,+and+environmental+factors+for+personalized+nutrition.">Epigenetic signatures underlying inflammation: an interplay of nutrition, physical activity, metabolic diseases, and environmental factors for personalized nutrition.</a> Inflammation Research. 70 (1), 29-49 (2021).</li><li>Yamamoto, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+glucose+uptake+in+cultured+cells.">Measurement of glucose uptake in cultured cells.</a> Current Protocols in Pharmacology. 71 (1), 12-14 (2015).</li><li>Yang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+sensitive+and+simple+HPLC-FLD-based+method+for+the+measurement+of+intracellular+glucose+uptake.">A sensitive and simple HPLC-FLD-based method for the measurement of intracellular glucose uptake.</a> Food Chemistry. 372, 131218 (2021).</li><li>Lee, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amino+acid-based+compound+activates+atypical+PKC+and+leptin+receptor+pathways+to+improve+glycemia+and+anxiety+like+behavior+in+diabetic+mice.">Amino acid-based compound activates atypical PKC and leptin receptor pathways to improve glycemia and anxiety like behavior in diabetic mice.</a> Biomaterials. 239, 119839 (2020).</li><li>Shukla, S. K., Mulder, S. E., Singh, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypoxia-mediated+in+vivo+tumor+glucose+uptake+measurement+and+analysis.">Hypoxia-mediated in vivo tumor glucose uptake measurement and analysis.</a> Methods in Molecular Biology. 1742, 107-113 (2018).</li><li>Jakson, I., Ujvari, D., Brusell Gidlof, S., Linden Hirschberg, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insulin+regulation+of+solute+carrier+family+2+member+1+(glucose+transporter+1)+expression+and+glucose+uptake+in+decidualizing+human+endometrial+stromal+cells:+an+in+vitro+study.">Insulin regulation of solute carrier family 2 member 1 (glucose transporter 1) expression and glucose uptake in decidualizing human endometrial stromal cells: an in vitro study.</a> Reproductive Biology and Endocrinology. 18 (1), 117 (2020).</li><li>Saparbaev, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+quantification+of+any+isoforms+of+carbohydrates+by+2D+UV-MS+fingerprinting+of+cold+ions.">Identification and quantification of any isoforms of carbohydrates by 2D UV-MS fingerprinting of cold ions.</a> Analytical Chemistry. 92 (21), 14624-14632 (2020).</li><li>Schulz, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+metabolomics+of+pellicle+and+saliva+in+children+with+different+caries+activity.">Targeted metabolomics of pellicle and saliva in children with different caries activity.</a> Scientific Reports. 10 (1), 697 (2020).</li><li>Shulman, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+magnetic+resonance+studies+of+glucose+metabolism+in+non-insulin-dependent+diabetes+mellitus+subjects.">Nuclear magnetic resonance studies of glucose metabolism in non-insulin-dependent diabetes mellitus subjects.</a> Molecular Medicine. 2 (5), 533-540 (1996).</li><li>Cochran, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+PET+imaging+with+[(18)F]FDG+to+explain+improved+glucose+uptake+in+an+apolipoprotein+A-I+treated+mouse+model+of+diabetes.">In vivo PET imaging with [(18)F]FDG to explain improved glucose uptake in an apolipoprotein A-I treated mouse model of diabetes.</a> Diabetologia. 59 (18), 1977-1984 (2016).</li><li>Lloyd, P. G., Hardin, C. D., Sturek, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Examining+glucose+transport+in+single+vascular+smooth+muscle+cells+with+a+fluorescent+glucose+analog.">Examining glucose transport in single vascular smooth muscle cells with a fluorescent glucose analog.</a> Physiological Research. 48 (6), 401-410 (1999).</li><li>Beeton, C., Garcia, A., Chandy, K. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drawing+blood+from+rats+through+the+saphenous+vein+and+by+cardiac+puncture.">Drawing blood from rats through the saphenous vein and by cardiac puncture.</a> Journal of Visualized Experiments. (7), e266 (2007).</li><li>DiSilvestro, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leptin+production+by+encapsulated+adipocytes+increases+brown+fat,+decreases+resistin,+and+improves+glucose+intolerance+in+obese+mice.">Leptin production by encapsulated adipocytes increases brown fat, decreases resistin, and improves glucose intolerance in obese mice.</a> PLoS One. 11 (4), 0153198 (2016).</li><li>Friedman, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leptin+and+the+endocrine+control+of+energy+balance.">Leptin and the endocrine control of energy balance.</a> Nature Metabolism. 1 (8), 754-764 (2019).</li><li>Guillam, M. T., Burcelin, R., Thorens, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Normal+hepatic+glucose+production+in+the+absence+of+GLUT2+reveals+an+alternative+pathway+for+glucose+release+from+hepatocytes.">Normal hepatic glucose production in the absence of GLUT2 reveals an alternative pathway for glucose release from hepatocytes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 95 (21), 12317-12321 (1998).</li><li>Guillam, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+diabetes+and+abnormal+postnatal+pancreatic+islet+development+in+mice+lacking+Glut-2.">Early diabetes and abnormal postnatal pancreatic islet development in mice lacking Glut-2.</a> Nature Genetics. 17 (3), 327-330 (1997).</li><li>Barros, L. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetic+validation+of+6-NBDG+as+a+probe+for+the+glucose+transporter+GLUT1+in+astrocytes.">Kinetic validation of 6-NBDG as a probe for the glucose transporter GLUT1 in astrocytes.</a> Journal of Neurochemistry. 109, 94-100 (2009).</li><li>Sprinz, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+blood+glucose+level+on+18F-FDG+uptake+for+PET/CT+in+normal+organs:+A+systematic+review.">Effects of blood glucose level on 18F-FDG uptake for PET/CT in normal organs: A systematic review.</a> PLoS One. 13 (2), 0193140 (2018).</li><li>Johnson, T. V., Martin, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+characterization+of+an+adult+retinal+explant+organotypic+tissue+culture+system+as+an+in+vitro+intraocular+stem+cell+transplantation+model.">Development and characterization of an adult retinal explant organotypic tissue culture system as an in vitro intraocular stem cell transplantation model.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 49 (8), 3503-3512 (2008).</li><li>de Urquiza, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Docosahexaenoic+acid,+a+ligand+for+the+retinoid+X+receptor+in+mouse+brain.">Docosahexaenoic acid, a ligand for the retinoid X receptor in mouse brain.</a> Science. 290 (5499), 2140-2144 (2000).</li><li>Olson, A. L., Pessin, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure,+function,+and+regulation+of+the+mammalian+facilitative+glucose+transporter+gene+family.">Structure, function, and regulation of the mammalian facilitative glucose transporter gene family.</a> Annual Review of Nutrition. 16 (1), 235-256 (1996).</li><li>Muhanna, D., Arnipalli, S. R., Kumar, S. B., Ziouzenkova, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osmotic+adaptation+by+Na(+)-dependent+transporters+and+ACE2:+correlation+with+hemostatic+crisis+in+COVID-19.">Osmotic adaptation by Na(+)-dependent transporters and ACE2: correlation with hemostatic crisis in COVID-19.</a> Biomedicines. 8 (11), 460 (2020).</li><li>Ligasova, A., Koberna, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+dyes-highly+sensitive+reporters+of+cell+quantification:+comparison+with+other+cell+quantification+methods.">DNA dyes-highly sensitive reporters of cell quantification: comparison with other cell quantification methods.</a> Molecules. 26 (18), 5515 (2021).</li><li>DeFronzo, R. A., Tobin, J. D., Andres, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glucose+clamp+technique:+a+method+for+quantifying+insulin+secretion+and+resistance.">Glucose clamp technique: a method for quantifying insulin secretion and resistance.</a> American Journal of Physiology. 237 (3), 214-223 (1979).</li></ol>

細胞外FD-グルコース枯渇と細胞培養における正規化された細胞内グルコース取り込みとの直接比較は高い相関関係を示し、細胞外グルコース枯渇がグルコース取り込み評価のための代理測定である可能性があることを示唆した。細胞外FD-グルコースの測定には、広範囲のFDグルコース濃度を使用することができ、また、0.5-2.5μgのFD-グルコース/mLが最適な範囲を提供するようである。細胞外FD-?...

グルコース取り込みを測定するための需要は、グルコース代謝に依存する多数の疾患の流行の増加に対処するための重要な必要性とともに上昇する。変性代謝疾患の根底にあるメカニズムは、神経学的および認知障害1、炎症性2および感染症3、癌4、5、ならびに加齢6について、エネルギーおよびその貯蔵、同化プロセス、タンパク質、および遺伝子修飾、シグナル伝達、遺伝子の調節、ならびに核酸合成および複製のためのグルコース代謝に依存する7,8,9.真性糖尿病(DM)は、グルコース取り込み調節の機能不全に直接関係している。DMは、1型、-2型、および-3型真性糖尿病、妊娠糖尿病、若年者の成熟発症糖尿病、および環境的および/または遺伝的要因によって誘発される他のタイプのこの疾患などの慢性疾患のスペクトルである。2016年、糖尿病に関する最初のWHOグローバルレポートは、最も広範なDMとともに生きる成人の数が1980年以来ほぼ4倍に増加し、成人10人の4億2,200万人に増加し、このDM患者の数は過去数十年間指数関数的に増加していることを実証しました。2019年だけでも、推定150万人の死亡がDM10によって直接引き起こされました。この劇的な上昇は、タイプ2 DMの増加と、太りすぎや肥満を含むそれを駆動する状態によるものです10。COVID-19のパンデミックは、一般集団と比較してDM患者の死亡率が2倍に増加することを明らかにし、免疫防御におけるグルコース代謝の深遠でありながらあまり理解されていない役割を示唆しています3。DM、肥満、およびその他の疾患の予防、早期診断、および治療には、異なる組織によるグルコース取り込みの測定の最適化、およびグルコース取り込みに影響を及ぼす環境11、栄養12、内分泌13、遺伝的14、およびエピジェネティック15因子の同定が必要である。
研究において、グルコースの細胞内および/または組織内取り込みは、一般に、インビトロ16、17、18およびインビボ19で蛍光標識されたグルコース(FD-グルコース)によって測定される。FD-グルコースは、放射性標識グルコース20、分析質量分析21、メタボロミクス22、核磁気共鳴法23、陽電子放射断層撮影/コンピュータ断層撮影法(PET/CT)5,24を用いたより正確な方法と比較して好ましい方法となった。FD-グルコース取り込みとは異なり、より多くの生物学的材料を必要とする分析方法は、多段階のサンプル調製、高価な機器、および複雑なデータ分析を含む可能性がある。細胞培養におけるFD-グルコース取り込みの効果的かつ安価な測定は、概念実証実験で利用されており、他の方法による検証が必要な場合がある。
グルコース取り込み研究のためのFD-グルコース適用の基礎は、内因性グルコースと比較してFD-グルコースの代謝の低下である25。それにもかかわらず、内因性グルコースおよびFDグルコースの両方が、同化、異化、およびシグナル伝達プロセスで使用するために、すべての細胞コンパートメント間で動的に分布する。FD-グルコースの区画化および時間依存性処理25 は、蛍光測定を妨害し、ハイスループットスクリーニング実験、速度論的分析、3D細胞培養、共培養、および組織外植実験におけるこのアッセイの使用のための主要な制限因子を表す。ここでは、FD-グルコースの細胞外枯渇とその細胞内取り込みとの間に高い相関関係を示すデータを提供し、細胞内グルコース取り込みの代理測定としてのFD-グルコースの細胞外枯渇を示唆する。グルコースの細胞外枯渇の測定を、インスリンおよび実験薬物18 で処置したマウスにおけるグルコース取り込みの組織特異的差異を検証するために適用し、この方法の原理証明を提供する。
現在のプロトコールは、3T3-L1細胞におけるFDグルコース取り込みの細胞内および細胞外(図1)測定値を記載している。プロトコルセクション1〜7は、48時間の細胞の培養および増殖を説明する。細胞飢餓、刺激、およびベースライン細胞外測定;細胞外FD-グルコースの刺激後測定およびFD-グルコースおよびタンパク質の細胞内測定。プロトコールセクション8は、他の箇所に記載されるインスリンおよびアミノ酸化合物2(AAC2)の存在下および非存在下でob/obマウスから解剖された組織におけるFDグルコースの細胞外取り込みのエクスビボ測定を記載している18。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>3T3-L1 mouse fibroblasts</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CL-173</td>
			<td>Cell line</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plates</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353227</td>
			<td>Plastic ware</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B6.V-Lepob/J male mice</td>
			<td>Jackson Laboratory</td>
			<td>stock number 000632</td>
			<td>Mice</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BioTek Synergy H1 modular multimode microplate reader (Fisher Scientific, US)</td>
			<td>Fisher Scientific, US</td>
			<td>&#160;B-SHT</td>
			<td>Device</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum</td>
			<td>Gibco/ThermoFisher</td>
			<td>161790-060</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calf serum</td>
			<td>Gibco/ThermoFisher</td>
			<td>26010-066</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell incubator</td>
			<td>Forma</td>
			<td>Series II Water Jacket</td>
			<td>Device</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diet (mouse/rat diet, irradiated)</td>
			<td>Envigo</td>
			<td>Teklad LM-485</td>
			<td>Diet</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethylsulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Sigma LifeScience</td>
			<td>D2650-100mL</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium</td>
			<td>Gibco/ThermoFisher</td>
			<td>&#160;11965-092</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>E7023-500mL</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent 2-deoxy-2-[(7-nitro-2,1,3-benzoxadiazol-4-yl) amino]-D-glucose)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>72987-1MG</td>
			<td>Assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose-free and phenol red-free DMEM</td>
			<td>Gibco/ThermoFisher</td>
			<td>A14430-01</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human insulin 10 mg/mL</td>
			<td>MilliporeSigma, Cat N 91077C</td>
			<td>Cat N 91077C</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane, 5%</td>
			<td>Henry Schein</td>
			<td>NDC 11695-6776-2</td>
			<td>Anestaetic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/streptomycin (P/S)</td>
			<td>Gibco/ThermoFisher</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>DA537-500 mL</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce bicinchoninic acid (BCA) protein assay</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>Cat N23225</td>
			<td>Assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Radioimmunoprecipitation assay lysis buffer</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-24948</td>
			<td>Assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0.05%)</td>
			<td>Gibco/ThermoFisher</td>
			<td>&#160;25300-054</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
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</table>

extracellular glucose depletion as an indirect measure of glucose uptake in cells and tissues ex vivo

糖尿病の世界的な流行が続いているため、グルコースの取り込みに影響を与える環境的、栄養的、内分泌的、遺伝的、およびエピジェネティックな要因の同定に対する需要が高まっています。細胞内蛍光の測定は、インビトロで細胞内の蛍光標識グルコース(FD-グルコース)の取り込みをテストするため、または インビボでグルコースを消費する組織をイメージングするために広く使用されている 方法です。このアッセイは、選択された時点におけるグルコース取り込みを評価する。細胞内分析は、FD-グルコースの代謝が内因性グルコースの代謝よりも遅いと仮定し、これは異化および同化反応およびシグナル伝達に関与する。しかし、動的グルコース代謝はまた、取り込み機構を変化させ、これは異なる因子に応答してグルコース取り込みの速度論的測定を必要とするであろう。本稿では、細胞外FD-グルコース枯渇を測定する方法について説明し、 エキソビボの細胞および組織における細胞内FD-グルコース取り込みとの相関を検証します。細胞外グルコース枯渇は、ハイスループットの動態学的および用量依存的研究、ならびに血糖活性およびそれらの組織特異的効果を有する化合物の同定に潜在的に適用され得る。

細胞内摂取および細胞外グルコース枯渇は、インスリン刺激の有無にかかわらず、異なる濃度のFDグルコース(図2)に応答して、3T3−L1前駆脂肪細胞において測定された。 図2Aは 、FD−グルコースの細胞内取り込みの用量依存的増加を示し、これはインスリンの存在下で有意に増加した。同じ細胞における細胞外FD-グルコースの付随する減少を <strong ...

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Extracellular Glucose Depletion as an Indirect Measure of Glucose Uptake in Cells and Tissues Ex Vivo

蛍光標識されたグルコースの細胞外枯渇は、グルコース取り込みと相関し、摘出した臓器および細胞培養物におけるグルコース取り込みのハイスループットスクリーニングに使用することができる。

細胞および組織におけるグルコース取り込みの間接的尺度としての細胞外グルコース枯渇 Ex vivo

The ongoing worldwide epidemic of diabetes increases the demand for the identification of environmental, nutritional, endocrine, genetic, and epigenetic ...

ブドウ糖の取り込みは、健康と病気を理解するための鍵です。グルコースは、人体の代謝および構造的要求において極めて重要な役割を果たし、調節において重要な役割を果たす。グルコースの細胞外測定により、栄養素や薬物に応答した異なる遺伝的背景の細胞、組織、および器官におけるグルコース取り込みの動態に関するハイスループットアッセイの開発が可能になります。このアッセイは、糖尿病、癌、中枢神経系の変性疾患、肥満、およびグルコースと代謝のすべての疾患に対する治療法と栄養の発見のための貴重なツールとなるでしょう。アッセイでは、さまざまな組織や細胞培養の代謝特性に基づいて、飢餓と刺激の時間を調整する必要があります。培養3T3-L1マウス線維芽細胞を10〜6細胞にプレーティングし、20ミリリットルの培地1を296ウェルプレートで希釈した。1ウェル当たり100マイクロリットルの細胞懸濁液をプレートし、混合することによってこの懸濁液の均質性を維持することを保証する。培地を交換せずに摂氏37度のインキュベーターで、約70〜80%のコンフルエントになるまで48時間細胞を増殖させます。細胞を同じ培地で48時間培養することにより、細胞をコンフルエントで絶食状態に保ちます。所望の空腹時異化状態に応じて、インキュベーション時間を24〜72時間に変化させる。96ウェルプレート内の細胞からの培地をデカントします。滅菌ペーパータオルを使用して残りの液体を吸収します。96ウェルプレートをウェルあたり100マイクロリットルのPBSですすぎ、残りの液体を滅菌ペーパータオルで吸収します。ウェルあたり100マイクロリットルのグルコースフリーDMEMを加え、40分間インキュベートします。細胞タイプの刺激、および希望する絶食レベルに応じてインキュベーション時間を調整します。シミュレーション条件ごとに8回の反復を使用します。そのため、シミュレーション条件ごとに1ミリリットルを用意してください。インスリンなしで7つのシミュレーション条件を使用します。196ウェルプレートにおける1ミリリットル当たり2.5マイクログラム、1ミリリットル当たり1マイクログラム、ミリリットル当たり0.5マイクログラム、1ミリリットル当たり0.2マイクログラム、1ミリリットル当たり0.1マイクログラム、1ミリリットル当たり0.05マイクログラム、および1ミリリットル当たり0ミリグラムのFDグルコース。インスリンで7つの刺激条件を使用します。別の96ウェルプレートにおける1ミリリットル当たり2.5マイクログラム、1ミリリットル当たり1マイクログラム、ミリリットル当たり0.5マイクログラム、1ミリリットル当たり0.2マイクログラム、1ミリリットル当たり0.1マイクログラム、1ミリリットル当たり0.05マイクログラム、および1ミリリットル当たり0マイクログラムのFDグルコース。刺激条件を調製するには、FDグルコース作動液1ミリリットルあたり5ミリグラムの1マイクロリットルと、グルコースフリーDMEM999マイクロリットルを希釈して、1ミリリットルの作動原液を得る。この作業ストック溶液を用いて、1〜2000、1〜5,000、1〜10,000、1〜25,000、1〜50,000、および1〜100,000のFDグルコースの妄想を調製して、1ミリリットルあたり2.5マイクログラム、1ミリリットルあたり1マイクログラム、1ミリリットルあたり0.2マイクログラム、1ミリリットルあたり0.1マイクログラム、 ライトのないバイオセーフティキャビネットでの実験の直前に、2ミリリットルのチューブでミリリットルあたり0.05マイクログラム。これらの各条件に1マイクロリットルのインスリンを追加します。インキュベーションの40分後、各ウェルからのグルコース遊離DMEMを96ウェルプレートにデカントし、残りの流体を滅菌ペーパータオルで吸収する。前述のさまざまな処理条件からそれぞれ100マイクロリットルを1つのカラムに沿ってウェルに追加します。そして同じ処理条件から100マイクロリットルを96枚の壁面板の列に沿ったウェルにした。インスリンの有無にかかわらず、条件を利用したプレートにラベルを付けます。グルコースフリーDMEMのみをコントロールウェルに追加します。プレートを暗所の細胞培養インキュベーター内で40分間インキュベートします。細胞を40分間刺激した後。刺激媒体を両方のプレートから新しい96ウェルプレートに移し、同じ実験レイアウトを維持します。細胞をPBSで洗浄します。PBSを取り出し、滅菌ペーパータオルに残っている溶液をデカントします。プロテアーゼ阻害剤をラジオ免疫沈降アッセイバッファーに添加して、タンパク質を保護します。ラジオ免疫沈降アッセイを含むプレートをシェーカーに30分間入れます。マイクロプレートリーダーを使用して、励起波長と発光波長の蛍光をそれぞれ485ナノメートルと535ナノメートルで測定します。まず細胞外FDグルコースを含む培地中で、次いでプレートを放射免疫沈降アッセイを用いて30分間インキュベーションの終了時に細胞をライズした。製造元の指示に従ってBCAタンパク質アッセイを実行します。放射性免疫沈降アッセイ用細胞を含む各ウェルにおけるタンパク質濃度を定量化する。10マイクロリットルの放射性免疫沈降アッセイホモジネートを使用してタンパク質濃度を測定し、96ウェルプレートで測定の精度を高めるために三重にします。各96ウェルプレート上のサンプルと一緒に分析されたタンパク質標準物質に基づいてタンパク質を定量します。採取した組織または臓器をPBSを含む6ウェルプレートで1分間インキュベートします。各組織または臓器を別々のウェルで処理します。1分後、各ティッシュを滅菌ペーパータオルの上に置き、PBSを吸収します。組織または臓器を4, 000マイクロリットルのグルコースフリーDMEMを含む別の6つのウォールプレートに移し、2分間インキュベートします。2分後、組織を除去し、0.29ミリモルFDグルコース作業溶液を含む6ウェルプレートのウェルに移します。組織を含む6つのウェルプレートをFDグルコース作業溶液中で摂氏37度でインキュベートする。0、10、20、30、40、60、90、および120分のインキュベーション後に各ウェルから100マイクロリットルのFDグルコース作業溶液を収集し、収集した100マイクロリットルのFDグルコース作業溶液を96ウェルプレートに移して、細胞外FDグルコース枯渇の速度論を分析しました。収集の前後に振ってください。マイクロプレートリーダーを使用して、それぞれ485ナノメートルと535ナノメートルの発光波長での励起時の蛍光を測定します。FDグルコースの細胞内取り込みにおける用量依存性は、インスリンの存在下で有意に増加した。インスリン刺激は、インスリン刺激なしのサンプルと比較して、細胞外FDグルコースレベルを有意に低下させた。FDグルコースの細胞外枯渇は、細胞内FDグルコース取り込みと同等の精度でグルコース取り込みの変化を測定することができる。細胞外FDグルコースは、インキュベーションの120分の間に非刺激対照内臓脂肪において枯渇しなかった。対照的に、解剖前のインスリンまたはAAC2によるマウスの前処理は、それぞれ30分および60分の時間間隔内で細胞外FDグルコースの有意な枯渇をもたらした。細胞外FDグルコースは、インスリン刺激肝外植片では、非刺激肝外植片と比較して枯渇しなかった。細胞外FDグルコースは時間依存的に有意に減少し、AAC2.22%で前処理した肝外植片は、60分のインキュベーション後に未処理の脳を含む細胞外培地でグルコースの枯渇が観察された。インスリン処置マウスからの脳と共にインキュベートされた培地は、FDグルコースの5%直線的減少を示した。AAC2刺激脳は、最初の20分間で細胞外FDグルコースの67.4%への大幅な急速な減少をもたらしました。洗浄を伴う物質は、これらの培地の蛍光読み取りを妨げる可能性があるため、培地および/または臓器内の微量のグルコース、血液、または血清を除去するために特に重要です。血糖特性を有する遺伝子中の代謝産物の化合物のハイスループット同定、ならびにin vivo実験におけるそれらの作用のための最適条件を、標識FDグルコースおよびPETスキャンで検証し、特定の臓器におけるグルコース蓄積を確認することができた。血糖作用の発見のためのこの技術は、多数の代謝産物、治療薬またはそれらの組み合わせの欠失において有益であり、異なる器官におけるそれらの作用を強調する。

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Extracellular Glucose Depletion as an Indirect Measure of Glucose Uptake in Cells and Tissues Ex Vivo

A Method for Measuring RNA N6-methyladenosine Modifications in Cells and Tissues

A Method for Measuring RNA N6-methyladenosine Modifications in Cells and Tissues

RNAの測定方法<em&gt; N</em<sup&gt; 6</sup細胞や組織における&gt; -methyladenosine変更

N6-Methyladenosine (m6A) modifications of RNA are diverse and ubiquitous amongst eukaryotes. They occur in mRNA, rRNA, tRNA, and microRNA. Recent studies ...

Brain Membrane Fractionation: An Ex Vivo Approach to Assess Subsynaptic Protein Localization

Brain Membrane Fractionation: An Ex Vivo Approach to Assess Subsynaptic Protein Localization

脳膜分画：<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Subsynaptic Protein Localizationを評価するアプローチ

Assessing the synaptic protein composition and function constitutes an important challenge in neuroscience. However, it is not easy to evaluate ...

Dissipative Microgravimetry to Study the Binding Dynamics of the Phospholipid Binding Protein Annexin A2 to Solid-supported Lipid Bilayers Using a Quartz Resonator

散逸の Microgravimetry 結合タンパク質アネキシン A2 への水晶振動子を用いた固相担脂質膜リン脂質の結合動態を研究するには

The dissipative quartz crystal microbalance technique is a simple and label-free approach to measure simultaneously the mass uptake and viscoelastic ...

Analysis of Endocytic Uptake and Retrograde Transport to the Trans-Golgi Network Using Functionalized Nanobodies in Cultured Cells

取り込みと培養細胞における機能性 Nanobodies を用いたトランスゴルジ ネットワークへの逆行性輸送の解析

Transport of proteins and membranes from the cell surface to the Golgi and beyond is essential for homeostasis, organelle identity and physiology. To ...

Atomic Absorbance Spectroscopy to Measure Intracellular Zinc Pools in Mammalian Cells

哺乳類細胞内の細胞内亜鉛プールを測定するための原子吸光度分光法

Transition metals are essential micronutrients for organisms but can be toxic to cells at high concentrations by competing with physiological metals in ...

Quantification of Coenzyme A in Cells and Tissues

細胞および組織におけるコエンザイムAの定量

Emerging research has revealed that the cellular coenzyme A (CoA) supply can become limiting with a detrimental impact on growth, metabolism and survival. ...

An Integrated Raman Spectroscopy and Mass Spectrometry Platform to Study Single-Cell Drug Uptake, Metabolism, and Effects

単細胞薬の取り込み、代謝、および効果を研究するための統合ラマン分光法と質量分析プラットフォーム

Cells are known to be inherently heterogeneous in their responses to drugs. Therefore, it is essential that single-cell heterogeneity is accounted for in ...

Using an Extracellular Flux Analyzer to Measure Changes in Glycolysis and Oxidative Phosphorylation during Mouse Sperm Capacitation

細胞外フラックス分析装置を用いてマウス精子容量化時の糖質および酸化リン酸化の変化を測定する

Mammalian sperm acquire fertilization capacity in the female reproductive tract in a process known as capacitation. Capacitation-associated processes ...

Ex Vivo Hepatic Perfusion Through the Portal Vein in Mouse

Ex Vivo Hepatic Perfusion Through the Portal Vein in Mouse

エクスビボ マウスの門脈を通る肝臓灌流

Metabolic diseases such as diabetes, pre-diabetes, non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD), and nonalcoholic steatohepatitis (NASH) are becoming ...

Stable Isotope Tracing & LC-MS Analysis to Measure DHODH and SDH Activities

Oxygen-Independent Assays to Measure Mitochondrial Function in Mammals

Oxygen-Independent Assays to Measure Mitochondrial Function in Mammals (Video) | JoVE 

哺乳類のミトコンドリア機能を測定するための酸素非依存性アッセイ(英語)

The flow of electrons in the mitochondrial electron transport chain (ETC) supports multifaceted biosynthetic, bioenergetic, and signaling functions in ...