Name: extracellular glucose depletion as an indirect measure of glucose uptake in cells and tissues ex vivo
Uploaded: 2022-04-06T14:20:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Extracellular Glucose Depletion as an Indirect Measure of Glucose Uptake in Cells and Tissues Ex Vivo at JoVE.com

Prosjektet ble støttet av Ralph og Marian Falk Medical Research Catalyst Award og Kathleen Kelly Award. Andre støtter inkluderte National Center for Research Resources UL1RR025755 og NCI P30CA16058 (OSUCCC), NIH Veikart for medisinsk forskning. Innholdet er utelukkende forfatternes ansvar og representerer ikke de offisielle synspunktene til Nasjonalt senter for forskningsressurser eller NIH.

Dyrestudier ble godkjent av Institutional Animal Care and Use Committee ved Ohio State University (OSU, protokoll 2007A0262-R4).
MERK: Alle prosedyrer må gjøres i et klasse II biosikkerhetsskap med blåseren på og lysene av.
1. Forberedelse av materialer
MERK: Alle materialer er oppført i materialtabellen.
<ol><li>Forbered Medium 1, sentrifugering Medium 2, og lagrings- og arbeidsløsninger av fluor...

<ol>
	<li>Kyrtata, N., Emsley, H. C. A., Sparasci, O., Parkes, L. M., Dickie, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+systematic+review+of+glucose+transport+alterations+in+Alzheimer's+disease.">A systematic review of glucose transport alterations in Alzheimer's disease.</a> Frontiers in Neuroscience. 15, 568 (2021).</li><li>Garcia-Carbonell, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Critical+role+of+glucose+metabolism+in+rheumatoid+arthritis+fibroblast-like+synoviocytes.">Critical role of glucose metabolism in rheumatoid arthritis fibroblast-like synoviocytes.</a> Arthritis Rheumatology. 68 (7), 1614-1626 (2016).</li><li>Kumar, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Is+diabetes+mellitus+associated+with+mortality+and+severity+of+COVID-19?+A+meta-analysis.">Is diabetes mellitus associated with mortality and severity of COVID-19? A meta-analysis.</a> Diabetes &amp; Metabolic Syndrome: Clinical Research &amp; Review. 14 (4), 535-545 (2020).</li><li>Lee, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Different+prognostic+impact+of+glucose+uptake+in+visceral+adipose+tissue+according+to+sex+in+patients+with+colorectal+cancer.">Different prognostic impact of glucose uptake in visceral adipose tissue according to sex in patients with colorectal cancer.</a> Scientific Reports. 11 (1), 21556 (2021).</li><li>Miner, M. W. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of:+(2S,4R)-4-[(18)F]Fluoroglutamine,+[(11)C]Methionine,+and+2-Deoxy-2-[(18)F]Fluoro-D-Glucose+and+two+small-animal+PET/CT+systems+imaging+rat+gliomas.">Comparison of: (2S,4R)-4-[(18)F]Fluoroglutamine, [(11)C]Methionine, and 2-Deoxy-2-[(18)F]Fluoro-D-Glucose and two small-animal PET/CT systems imaging rat gliomas.</a> Frontiers in Oncology. 11 (18), 730358 (2021).</li><li>Gumbiner, B., Thorburn, A. W., Ditzler, T. M., Bulacan, F., Henry, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+impaired+intracellular+glucose+metabolism+in+the+insulin+resistance+of+aging.">Role of impaired intracellular glucose metabolism in the insulin resistance of aging.</a> Metabolism. 41 (10), 1115-1121 (1992).</li><li>Ebrahimi, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beta+cell+identity+changes+with+mild+hyperglycemia:+Implications+for+function,+growth,+and+vulnerability.">Beta cell identity changes with mild hyperglycemia: Implications for function, growth, and vulnerability.</a> Molecular Metabolism. 35, 100959 (2020).</li><li>Ruberto, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=KLF10+integrates+circadian+timing+and+sugar+signaling+to+coordinate+hepatic+metabolism.">KLF10 integrates circadian timing and sugar signaling to coordinate hepatic metabolism.</a> Elife. 10, 65574 (2021).</li><li>Stocks, B., Zierath, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Post-translational+modifications:+The+signals+at+the+intersection+of+exercise,+glucose+uptake,+and+insulin+sensitivity.">Post-translational modifications: The signals at the intersection of exercise, glucose uptake, and insulin sensitivity.</a> Endocrinology Reviews. , (2021).</li><li>World Health Organization. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+report+on+diabetes.">Global report on diabetes.</a> World Health Organization. , (2016).</li><li>Kolb, H., Martin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Environmental/lifestyle+factors+in+the+pathogenesis+and+prevention+of+type+2+diabetes.">Environmental/lifestyle factors in the pathogenesis and prevention of type 2 diabetes.</a> BMC Medicine. 15 (1), 131 (2017).</li><li>Galicia-Garcia, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathophysiology+of+type+2+diabetes+mellitus.">Pathophysiology of type 2 diabetes mellitus.</a> International Journal of Molecular Science. 21 (17), 6275 (2020).</li><li>Petrov, M. S., Basina, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DIAGNOSIS+OF+ENDOCRINE+DISEASE:+Diagnosing+and+classifying+diabetes+in+diseases+of+the+exocrine+pancreas.">DIAGNOSIS OF ENDOCRINE DISEASE: Diagnosing and classifying diabetes in diseases of the exocrine pancreas.</a> European Journal of Endocrinology. 184 (4), 151-163 (2021).</li><li>Sirdah, M. M., Reading, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+predisposition+in+type+2+diabetes:+A+promising+approach+toward+a+personalized+management+of+diabetes.">Genetic predisposition in type 2 diabetes: A promising approach toward a personalized management of diabetes.</a> Clinical Genetics. 98 (6), 525-547 (2020).</li><li>Ramos-Lopez, O., Milagro, F. I., Riezu-Boj, J. I., Martinez, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetic+signatures+underlying+inflammation:+an+interplay+of+nutrition,+physical+activity,+metabolic+diseases,+and+environmental+factors+for+personalized+nutrition.">Epigenetic signatures underlying inflammation: an interplay of nutrition, physical activity, metabolic diseases, and environmental factors for personalized nutrition.</a> Inflammation Research. 70 (1), 29-49 (2021).</li><li>Yamamoto, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+glucose+uptake+in+cultured+cells.">Measurement of glucose uptake in cultured cells.</a> Current Protocols in Pharmacology. 71 (1), 12-14 (2015).</li><li>Yang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+sensitive+and+simple+HPLC-FLD-based+method+for+the+measurement+of+intracellular+glucose+uptake.">A sensitive and simple HPLC-FLD-based method for the measurement of intracellular glucose uptake.</a> Food Chemistry. 372, 131218 (2021).</li><li>Lee, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amino+acid-based+compound+activates+atypical+PKC+and+leptin+receptor+pathways+to+improve+glycemia+and+anxiety+like+behavior+in+diabetic+mice.">Amino acid-based compound activates atypical PKC and leptin receptor pathways to improve glycemia and anxiety like behavior in diabetic mice.</a> Biomaterials. 239, 119839 (2020).</li><li>Shukla, S. K., Mulder, S. E., Singh, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypoxia-mediated+in+vivo+tumor+glucose+uptake+measurement+and+analysis.">Hypoxia-mediated in vivo tumor glucose uptake measurement and analysis.</a> Methods in Molecular Biology. 1742, 107-113 (2018).</li><li>Jakson, I., Ujvari, D., Brusell Gidlof, S., Linden Hirschberg, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insulin+regulation+of+solute+carrier+family+2+member+1+(glucose+transporter+1)+expression+and+glucose+uptake+in+decidualizing+human+endometrial+stromal+cells:+an+in+vitro+study.">Insulin regulation of solute carrier family 2 member 1 (glucose transporter 1) expression and glucose uptake in decidualizing human endometrial stromal cells: an in vitro study.</a> Reproductive Biology and Endocrinology. 18 (1), 117 (2020).</li><li>Saparbaev, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+quantification+of+any+isoforms+of+carbohydrates+by+2D+UV-MS+fingerprinting+of+cold+ions.">Identification and quantification of any isoforms of carbohydrates by 2D UV-MS fingerprinting of cold ions.</a> Analytical Chemistry. 92 (21), 14624-14632 (2020).</li><li>Schulz, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+metabolomics+of+pellicle+and+saliva+in+children+with+different+caries+activity.">Targeted metabolomics of pellicle and saliva in children with different caries activity.</a> Scientific Reports. 10 (1), 697 (2020).</li><li>Shulman, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+magnetic+resonance+studies+of+glucose+metabolism+in+non-insulin-dependent+diabetes+mellitus+subjects.">Nuclear magnetic resonance studies of glucose metabolism in non-insulin-dependent diabetes mellitus subjects.</a> Molecular Medicine. 2 (5), 533-540 (1996).</li><li>Cochran, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+PET+imaging+with+[(18)F]FDG+to+explain+improved+glucose+uptake+in+an+apolipoprotein+A-I+treated+mouse+model+of+diabetes.">In vivo PET imaging with [(18)F]FDG to explain improved glucose uptake in an apolipoprotein A-I treated mouse model of diabetes.</a> Diabetologia. 59 (18), 1977-1984 (2016).</li><li>Lloyd, P. G., Hardin, C. D., Sturek, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Examining+glucose+transport+in+single+vascular+smooth+muscle+cells+with+a+fluorescent+glucose+analog.">Examining glucose transport in single vascular smooth muscle cells with a fluorescent glucose analog.</a> Physiological Research. 48 (6), 401-410 (1999).</li><li>Beeton, C., Garcia, A., Chandy, K. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drawing+blood+from+rats+through+the+saphenous+vein+and+by+cardiac+puncture.">Drawing blood from rats through the saphenous vein and by cardiac puncture.</a> Journal of Visualized Experiments. (7), e266 (2007).</li><li>DiSilvestro, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leptin+production+by+encapsulated+adipocytes+increases+brown+fat,+decreases+resistin,+and+improves+glucose+intolerance+in+obese+mice.">Leptin production by encapsulated adipocytes increases brown fat, decreases resistin, and improves glucose intolerance in obese mice.</a> PLoS One. 11 (4), 0153198 (2016).</li><li>Friedman, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leptin+and+the+endocrine+control+of+energy+balance.">Leptin and the endocrine control of energy balance.</a> Nature Metabolism. 1 (8), 754-764 (2019).</li><li>Guillam, M. T., Burcelin, R., Thorens, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Normal+hepatic+glucose+production+in+the+absence+of+GLUT2+reveals+an+alternative+pathway+for+glucose+release+from+hepatocytes.">Normal hepatic glucose production in the absence of GLUT2 reveals an alternative pathway for glucose release from hepatocytes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 95 (21), 12317-12321 (1998).</li><li>Guillam, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+diabetes+and+abnormal+postnatal+pancreatic+islet+development+in+mice+lacking+Glut-2.">Early diabetes and abnormal postnatal pancreatic islet development in mice lacking Glut-2.</a> Nature Genetics. 17 (3), 327-330 (1997).</li><li>Barros, L. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetic+validation+of+6-NBDG+as+a+probe+for+the+glucose+transporter+GLUT1+in+astrocytes.">Kinetic validation of 6-NBDG as a probe for the glucose transporter GLUT1 in astrocytes.</a> Journal of Neurochemistry. 109, 94-100 (2009).</li><li>Sprinz, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+blood+glucose+level+on+18F-FDG+uptake+for+PET/CT+in+normal+organs:+A+systematic+review.">Effects of blood glucose level on 18F-FDG uptake for PET/CT in normal organs: A systematic review.</a> PLoS One. 13 (2), 0193140 (2018).</li><li>Johnson, T. V., Martin, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+characterization+of+an+adult+retinal+explant+organotypic+tissue+culture+system+as+an+in+vitro+intraocular+stem+cell+transplantation+model.">Development and characterization of an adult retinal explant organotypic tissue culture system as an in vitro intraocular stem cell transplantation model.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 49 (8), 3503-3512 (2008).</li><li>de Urquiza, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Docosahexaenoic+acid,+a+ligand+for+the+retinoid+X+receptor+in+mouse+brain.">Docosahexaenoic acid, a ligand for the retinoid X receptor in mouse brain.</a> Science. 290 (5499), 2140-2144 (2000).</li><li>Olson, A. L., Pessin, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure,+function,+and+regulation+of+the+mammalian+facilitative+glucose+transporter+gene+family.">Structure, function, and regulation of the mammalian facilitative glucose transporter gene family.</a> Annual Review of Nutrition. 16 (1), 235-256 (1996).</li><li>Muhanna, D., Arnipalli, S. R., Kumar, S. B., Ziouzenkova, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osmotic+adaptation+by+Na(+)-dependent+transporters+and+ACE2:+correlation+with+hemostatic+crisis+in+COVID-19.">Osmotic adaptation by Na(+)-dependent transporters and ACE2: correlation with hemostatic crisis in COVID-19.</a> Biomedicines. 8 (11), 460 (2020).</li><li>Ligasova, A., Koberna, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+dyes-highly+sensitive+reporters+of+cell+quantification:+comparison+with+other+cell+quantification+methods.">DNA dyes-highly sensitive reporters of cell quantification: comparison with other cell quantification methods.</a> Molecules. 26 (18), 5515 (2021).</li><li>DeFronzo, R. A., Tobin, J. D., Andres, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glucose+clamp+technique:+a+method+for+quantifying+insulin+secretion+and+resistance.">Glucose clamp technique: a method for quantifying insulin secretion and resistance.</a> American Journal of Physiology. 237 (3), 214-223 (1979).</li></ol>

Den direkte sammenligningen av ekstracellulær FD-glukosemangel med normalisert intracellulært glukoseopptak i cellekultur viste en høy korrelasjon, noe som tyder på at ekstracellulær glukosemangel kan være en surrogatmåling for glukoseopptaksvurdering. Måling av ekstracellulær FD-glukose kan bruke et bredt spekter av FD-glukosekonsentrasjoner, også 0,5-2,5 μg FD-glukose / ml ser ut til å gi det optimale området. Ekstracellulær FD-glukose krever ikke normalisering til cellenummer eller proteinkonsentrasjoner...

Etterspørselen etter måling av glukoseopptak stiger sammen med det kritiske behovet for å takle en epidemisk økning i en rekke sykdommer avhengig av glukosemetabolismen. Underliggende mekanismer for degenerative metabolske sykdommer, nevrologiske og kognitive forstyrrelser1,inflammatoriske 2 og smittsomme sykdommer3, kreft 4,5, samt aldring6, avhenger av glukosemetabolismen for energi og lagring, anabole prosesser, protein og genmodifisering, signalering, regulering av gener og nukleinsyresyntese og replikasjon 7,8,9 . Diabetes mellitus (DM) er direkte relatert til funksjonsfeil i glukoseopptaksreguleringen. DM er et spekter av kroniske sykdommer som type-1, -2 og -3 diabetes mellitus, svangerskapsdiabetes, modenhetsdempende diabetes hos de unge og andre typer av denne sykdommen indusert av miljømessige og / eller genetiske faktorer. I 2016 viste den første WHO Global-rapporten om diabetes at antall voksne som lever med den mest utbredte DM har nesten firedoblet seg siden 1980 til 422 millioner voksne10, og dette antallet DM-pasienter har økt eksponentielt de siste tiårene. Bare i 2019 var et estimat på 1,5 millioner dødsfall direkte forårsaket av DM10. Denne dramatiske økningen skyldes økningen i type 2 DM og forholdene som driver den, inkludert overvekt og fedme10. COVID-19-pandemien avslørte en to ganger økning i dødelighet hos pasienter med DM sammenlignet med befolkningen generelt, noe som tyder på den dype, men dårlig forståtte rollen som glukosemetabolismen i immunforsvaret3. Forebygging, tidlig diagnose og behandling av DM, fedme og andre sykdommer krever optimalisering av målinger av glukoseopptak av forskjellige vev, og identifisering av miljø11,ernæringsmessige 12, endokrine13,genetiske 14 og epigenetiske15 faktorer som påvirker glukoseopptaket.
I forskning måles intracellulært og/eller vevsopptak av glukose vanligvis med fluorescerende merket glukose (FD-glukose) in vitro 16,17,18 og in vivo19. FD-glukose ble en foretrukket metode sammenlignet med mer presise metoder ved bruk av radioaktivtmerket glukose 20, analytisk massespektroskopianalyse21, metabolomics22, kjernemagnetiske resonansmetoder23 og positronemisjonstomografi/computertomografi (PET/CT)5,24. I motsetning til FD-glukoseopptak, kan analysemetoder som krever mer biologisk materiale innebære en flertrinns prøvepreparering, dyre instrumenter og kompleks dataanalyse. Effektive og rimelige målinger av FD-glukoseopptak i cellekulturer har blitt brukt i proof-of-concept eksperimenter og kan kreve validering ved andre metoder.
Grunnlaget for FD-glukoseapplikasjon for glukoseopptaksstudier er redusert metabolisme av FD-glukose sammenlignet med endogen glukose25. Ikke desto mindre er både endogen glukose og FD-glukose dynamisk fordelt mellom alle cellulære rom for bruk i anabole, katabolske og signalprosesser. Compartmentalization og tidsavhengig behandling25 av FD-glukose forstyrrer fluorescensmålingene, og representerer de viktigste begrensende faktorene for bruk av denne analysen i høy gjennomstrømningsscreeningseksperimenter, kinetisk analyse, 3D-cellekultur, kokulturer og vevseksperimenter. Her gir vi data som viser en høy korrelasjon mellom den ekstracellulære uttømmingen av FD-glukose og dets intracellulære opptak, noe som tyder på den ekstracellulære uttømmingen av FD-glukose som en surrogatmåling for intracellulært glukoseopptak. Måling av ekstracellulær uttømming av glukose ble brukt for å validere vevsspesifikke forskjeller i glukoseopptak hos mus behandlet med insulin og et eksperimentelt legemiddel18 for å gi et prinsippbevis for denne metoden.
Den nåværende protokollen beskriver intracellulære og ekstracellulære (figur 1) målinger av FD-glukoseopptak i 3T3-L1-celler. Protokoll avsnitt 1-7 forklarer kulturen og veksten av celler i 48 timer; celle sult, stimulering og baseline ekstracellulære målinger; og poststimuleringsmålinger av ekstracellulær FD-glukose og intracellulære målinger av FD-glukose og protein. Protokollavsnitt 8 beskriver ex vivo-måling av ekstracellulært opptak av FD-glukose i vev dissekert fra ob/ob-mus i nærvær og fravær av insulin og aminosyreforbindelse 2 (AAC2) beskrevet andre steder18.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>3T3-L1 mouse fibroblasts</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CL-173</td>
			<td>Cell line</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plates</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353227</td>
			<td>Plastic ware</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B6.V-Lepob/J male mice</td>
			<td>Jackson Laboratory</td>
			<td>stock number 000632</td>
			<td>Mice</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BioTek Synergy H1 modular multimode microplate reader (Fisher Scientific, US)</td>
			<td>Fisher Scientific, US</td>
			<td>&#160;B-SHT</td>
			<td>Device</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum</td>
			<td>Gibco/ThermoFisher</td>
			<td>161790-060</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calf serum</td>
			<td>Gibco/ThermoFisher</td>
			<td>26010-066</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell incubator</td>
			<td>Forma</td>
			<td>Series II Water Jacket</td>
			<td>Device</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diet (mouse/rat diet, irradiated)</td>
			<td>Envigo</td>
			<td>Teklad LM-485</td>
			<td>Diet</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethylsulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Sigma LifeScience</td>
			<td>D2650-100mL</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium</td>
			<td>Gibco/ThermoFisher</td>
			<td>&#160;11965-092</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>E7023-500mL</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent 2-deoxy-2-[(7-nitro-2,1,3-benzoxadiazol-4-yl) amino]-D-glucose)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>72987-1MG</td>
			<td>Assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose-free and phenol red-free DMEM</td>
			<td>Gibco/ThermoFisher</td>
			<td>A14430-01</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human insulin 10 mg/mL</td>
			<td>MilliporeSigma, Cat N 91077C</td>
			<td>Cat N 91077C</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane, 5%</td>
			<td>Henry Schein</td>
			<td>NDC 11695-6776-2</td>
			<td>Anestaetic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/streptomycin (P/S)</td>
			<td>Gibco/ThermoFisher</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>DA537-500 mL</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce bicinchoninic acid (BCA) protein assay</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>Cat N23225</td>
			<td>Assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Radioimmunoprecipitation assay lysis buffer</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-24948</td>
			<td>Assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0.05%)</td>
			<td>Gibco/ThermoFisher</td>
			<td>&#160;25300-054</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

extracellular glucose depletion as an indirect measure of glucose uptake in cells and tissues ex vivo

Den pågående verdensomspennende epidemien av diabetes øker etterspørselen etter identifisering av miljømessige, ernæringsmessige, endokrine, genetiske og epigenetiske faktorer som påvirker glukoseopptaket. Måling av intracellulær fluorescens er en mye brukt metode for å teste opptaket av fluorescerende merket glukose (FD-glukose) i celler in vitro, eller for avbildning av glukoseforbrukende vev in vivo. Denne analysen vurderer glukoseopptaket på et valgt tidspunkt. Den intracellulære analysen antar at metabolismen av FD-glukose er langsommere enn for endogen glukose, som deltar i katabolske og anabole reaksjoner og signalering. Dynamisk glukosemetabolisme endrer imidlertid også opptaksmekanismer, noe som vil kreve kinetiske målinger av glukoseopptak som respons på forskjellige faktorer. Denne artikkelen beskriver en metode for å måle ekstracellulær FD-glukosedeplesjon og validerer korrelasjonen med intracellulært FD-glukoseopptak i celler og vev ex vivo. Ekstracellulær glukosemangel kan potensielt være aktuelt for kinetiske og doseavhengige studier med høy gjennomstrømning, samt identifisering av forbindelser med glykemisk aktivitet og deres vevsspesifikke effekter.

Intracellulært inntak og ekstracellulær glukosedeplesjon ble målt i 3T3-L1 preadipocytter, som respons på ulike konsentrasjoner av FD-glukose (figur 2) med og uten insulinstimulering. Figur 2A viser en doseavhengig økning i det intracellulære opptaket av FD-glukose, som var signifikant økt i nærvær av insulin. Den samtidige reduksjonen i ekstracellulær FD-glukose i de samme cellene er vist i figur 2B, hvor insulinstimuleri...

Watch this Scientific Journal Video about Extracellular Glucose Depletion as an Indirect Measure of Glucose Uptake in Cells and Tissues Ex Vivo at JoVE.com

Extracellular Glucose Depletion as an Indirect Measure of Glucose Uptake in Cells and Tissues Ex Vivo

Ekstracellulær deplesjon av fluorescerende merket glukose korrelerer med glukoseopptak og kan brukes til høy gjennomstrømningsscreening av glukoseopptak i utskårne organer og cellekulturer.

Ekstracellulær glukoseuttømming som et indirekte mål på glukoseopptak i celler og vev ex vivo

The ongoing worldwide epidemic of diabetes increases the demand for the identification of environmental, nutritional, endocrine, genetic, and epigenetic ...

Glukoseopptak er nøkkelen til å forstå helse og sykdom. Som glukose spiller en sentral rolle i metabolske og strukturelle krav i menneskekroppen, samt spiller en viktig rolle i regulering. Den ekstracellulære målingen av glukose muliggjør utvikling av høye gjennomstrømningsanalyser for kinetikk av glukoseopptak i celler, vev og organer med forskjellig genetisk bakgrunn som respons på næringsstoffer eller legemidler.Denne analysen vil være et verdifullt verktøy for oppdagelsen av terapi og ernæring for diabetes, kreft, degenerative sykdommer i sentralnervesystemet, fedme og alle sykdommer i glukose og metabolisme. Analysen trenger en justering av tid for sult og stimulering som skal være basert på metabolske spesifikasjoner for forskjellige vev og cellekulturer. Kultur 3T3-L1 mus fibroblaster ved plating 10 til 6 celler, fortynnet i 20 milliliter medium 1 i 296 brønnplater.Plate 100 mikroliter cellesuspensjon per brønn, som sikrer å opprettholde homogenitet av denne suspensjonen ved blanding. Vokse celler i 48 timer i en 37 grader Celsius inkubator uten å bytte media til ca 70 til 80% sammenheng. Oppretthold celler sammenflytende og fastende ved å dyrke dem i samme medium i 48 timer.Varier inkubasjonstiden fra 24 til 72 timer, avhengig av ønsket fastende katabolsk tilstand. Dekantmedier fra celler i de 96 brønnplatene. Absorber gjenværende væske ved hjelp av sterile papirhåndklær.Skyll 96-brønnplaten med 100 mikroliter PBS per brønn, og absorber gjenværende væske med sterile papirhåndklær. Tilsett 100 mikroliter glukosefri DMEM per brønn, og inkuber i 40 minutter. Juster inkubasjonstiden avhengig av celletypestimuli og ønsket fastenivå.Bruk åtte replikasjoner for hver simuleringsbetingelse. Forbered derfor en milliliter for hver simuleringstilstand. Bruk syv simuleringsbetingelser uten insulin.FD glukose på 2,5 mikrogram per milliliter, 1 mikrogram per milliliter, 0,5 mikrogram per milliliter, 0,2 mikrogram per milliliter, 0,1 mikrogram per milliliter, 0,05 mikrogram per milliliter, og 0 milligram per milliliter i 196 brønnplate. Bruk syv stimuleringsbetingelser med insulin. FD glukose på 2,5 mikrogram per milliliter, 1 mikrogram per milliliter, 0,5 mikrogram per milliliter, 0,2 mikrogram per milliliter, 0,1 mikrogram per milliliter, 0,05 mikrogram per milliliter, og 0 mikrogram per milliliter i en annen 96 brønnplate.For å forberede stimuleringsforhold, fortynn en mikroliter på fem milligram per milliliter FD glukosearbeidsløsning og 999 mikroliter glukosefri DMEM for å oppnå en milliliter arbeidsmaterialeløsning. Bruk denne arbeidsmateriellløsningen, forbered 1 til 2000, 1 til 5.000, 1 til 10.000, 1 til 25.000, 1 til 50.000 og 1 til 100.000 vrangforestillinger av FD-glukose for å oppnå 2,5 mikrogram per milliliter, 1 mikrogram per milliliter, 0,5 mikrogram per milliliter, 0,2 mikrogram per milliliter, 0,1 mikrogram per milliliter, 0,05 mikrogram per milliliter i to milliliter rør umiddelbart før eksperimenter i et biosikkerhetsskap uten lys. Tilsett en mikroliter insulin til hver av disse tilstandene.Etter 40 minutters inkubasjon, dekanter glukosefri DMEM fra hver brønn i 96 brønnplater, og absorberer gjenværende væske med sterile papirhåndklær. Tilsett 100 mikroliter hver fra de ulike behandlingstilstandene som er beskrevet tidligere, til brønner langs en kolonne. Og 100 mikroliter fra samme behandlingstilstand til brønnene langs raden i begge de 96 veggplatene.Merk platene som utnyttet forholdene, med og uten insulin. Tilsett glukosefri DMEM alene i kontrollbrønnene. Inkuber platen i 40 minutter i cellekulturinkubatoren i mørket.Etter at cellene har blitt stimulert i 40 minutter. Overfør stimuleringsmediet fra begge platene til nye 96 brønnplater, og oppretthold samme eksperimentelle layout. Vask cellene med PBS.Fjern PBS og dekanter eventuell gjenværende oppløsning på sterile papirhåndklær. Legg til en proteasehemmer til radioimmunoprecipitasjonsanalysebufferen for å beskytte proteiner. Plasser plater som inneholder radioimmunoprecipitasjonsanalyse i en shaker i 30 minutter.Ved hjelp av en mikroplateleser måler du fluorescens ved eksitasjon og utslippsbølgelengder ved henholdsvis 485 og 535 nanometer. Først i mediet som inneholder ekstracellulær FD-glukose, og deretter platen med radioimmunoprecipitasjonsanalyse liserte celler ved slutten av 30 minutters inkubasjon. Utfør BCA-proteinanalyse i henhold til produsentens instruksjoner.Kvantifiser proteinkonsentrasjonene i hver brønn som inneholder radioimmunprecipitasjonsanalyseliserte celler. Bruk 10 mikroliter av radioimmunoprecipitasjonsanalysehomogenatet, og mål proteinkonsentrasjoner, og tredoble for å øke nøyaktigheten av målingene i 96 brønnplater. Kvantifiser protein basert på proteinstandarder analysert sammen med prøver på hver 96 brønnplate.Inkuber høstet vev eller organer i en seks brønnplate som inneholder PBS i ett minutt. Håndter hvert vev eller organ i en separat brønn. Etter ett minutt, legg hvert vev på et sterilt papirhåndkle for å absorbere PBS.Overfør vev eller organer i en separat seksveggplate som inneholder 4.000 mikroliter glukosefri DMEM, og inkuber i to minutter. Etter to minutter, fjern og overfør vevet i brønner av en seks brønnplate som inneholder 0,29 millimolar FD glukosearbeidsløsning. Inkuber de seks brønnplatene som inneholder vev i FD-glukosearbeidsløsning ved 37 grader Celsius.Samle 100 mikroliter FD glukosearbeidsløsning fra hver brønn etter 0, 10, 20, 30, 40, 60, 90 og 120 minutters inkubasjon, og overfør oppsamlet 100 mikroliter FD glukosearbeidsløsning i 96 brønnplater for å analysere kinetikken til ekstracellulær FD glukoseuttømming. Rist før og etter samling. Mål fluorescensen ved eksitasjon i utslippsbølgelengder ved henholdsvis 485 og 535 nanometer ved hjelp av en mikroplateleser.Doseavhengigheten i det intracellulære opptaket av FD-glukose var signifikant økt i nærvær av insulin. Insulinstimuleringen førte til signifikant reduserte ekstracellulære FD-glukosenivåer sammenlignet med prøvene uten insulinstimulering. Ekstracellulær uttømming av FD-glukose kan måle en endring i glukoseopptak med tilsvarende nøyaktighet som intracellulært FD-glukoseopptak.Den ekstracellulære FD-glukosen ble ikke utarmet i ikke-stimulert kontrollvisceralt fett i løpet av 120 minutters inkubasjon. I motsetning til dette førte forbehandling av mus med insulin eller AAC2 før disseksjonen til signifikant uttømming av ekstracellulær FD-glukose innen et tidsintervall på henholdsvis 30 minutter og 60 minutter. Ekstracellulær FD-glukose ble ikke utarmet i insulinstimulerte levereksplanter, sammenlignet med ikke-stimulerte levereksplanter.Ekstracellulær FD-glukose ble signifikant redusert på den tidsavhengige måten, og levereksplanter forbehandlet med AAC2,22% uttømming av glukose ble observert i det ekstracellulære mediet som inneholdt den ikke-behandlede hjernen etter 60 minutters inkubasjon. Mediet inkubert med hjerner fra insulinbehandlede mus har vist en 5% lineær reduksjon i FD-glukose. AAC2-stimulerte hjerner førte til en dyp rask reduksjon til 67,4% av den ekstracellulære FD-glukosen i løpet av de første 20 minuttene.Stoff som involverer vask er spesielt viktig for å fjerne spor av glukose, blod eller serum i medium og eller organer, da det kan forstyrre fluorescensavlesningen av disse mediene. Etter høy gjennomstrømning kan identifisering av forbindelser av metabolitter i gener med glykemiske egenskaper, samt de optimale forholdene for deres virkning in vivo-eksperimenter, valideres med merket FD-glukose- og PET-skanning for å bekrefte glukoseakkumulering i spesifikke organer. Denne teknikken for oppdagelse av glykemisk virkning er både gunstig for sletting av mange metabolitter, terapier eller deres kombinasjoner, og fremhever deres handlinger i forskjellige organer.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Extracellular Glucose Depletion as an Indirect Measure of Glucose Uptake in Cells and Tissues Ex Vivo

A Method for Measuring RNA N6-methyladenosine Modifications in Cells and Tissues

A Method for Measuring RNA N6-methyladenosine Modifications in Cells and Tissues

En metode for måling av RNA<em&gt; N</em<sup&gt; 6</sup&gt; -methyladenosine Endringer i celler og vev

N6-Methyladenosine (m6A) modifications of RNA are diverse and ubiquitous amongst eukaryotes. They occur in mRNA, rRNA, tRNA, and microRNA. Recent studies ...

Brain Membrane Fractionation: An Ex Vivo Approach to Assess Subsynaptic Protein Localization

Brain Membrane Fractionation: An Ex Vivo Approach to Assess Subsynaptic Protein Localization

Hjernemembran Fraksjonering: An<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Tilnærming til vurdering av subsynaptisk protein lokalisering

Assessing the synaptic protein composition and function constitutes an important challenge in neuroscience. However, it is not easy to evaluate ...

Dissipative Microgravimetry to Study the Binding Dynamics of the Phospholipid Binding Protein Annexin A2 to Solid-supported Lipid Bilayers Using a Quartz Resonator

Dissipative Microgravimetry å studere Binding dynamikken i Phospholipid bindende Protein Annexin A2 til Solid-støttet Lipid Bilayers bruker et Quartz-Resonator

The dissipative quartz crystal microbalance technique is a simple and label-free approach to measure simultaneously the mass uptake and viscoelastic ...

Analysis of Endocytic Uptake and Retrograde Transport to the Trans-Golgi Network Using Functionalized Nanobodies in Cultured Cells

Analyse av Endocytic opptak og retrograd Transport til Trans-Golgi nettverket med Functionalized Nanobodies i kulturperler celler

Transport of proteins and membranes from the cell surface to the Golgi and beyond is essential for homeostasis, organelle identity and physiology. To ...

Atomic Absorbance Spectroscopy to Measure Intracellular Zinc Pools in Mammalian Cells

Atomic absorbansen spektroskopi å måle intracellulære zinc Pools i pattedyrceller

Transition metals are essential micronutrients for organisms but can be toxic to cells at high concentrations by competing with physiological metals in ...

Quantification of Coenzyme A in Cells and Tissues

Kvantifisering av koenzym A i celler og vev

Emerging research has revealed that the cellular coenzyme A (CoA) supply can become limiting with a detrimental impact on growth, metabolism and survival. ...

An Integrated Raman Spectroscopy and Mass Spectrometry Platform to Study Single-Cell Drug Uptake, Metabolism, and Effects

En integrert Raman spektroskopi og Mass massespektrometri Platform å studere single-Cell Drug opptak, metabolisme, og effekter

Cells are known to be inherently heterogeneous in their responses to drugs. Therefore, it is essential that single-cell heterogeneity is accounted for in ...

Using an Extracellular Flux Analyzer to Measure Changes in Glycolysis and Oxidative Phosphorylation during Mouse Sperm Capacitation

Bruke en ekstracellulære Flux Analyzer til å måle endringer i Glykolysen og oksidativt fosforylering under Mouse sperm Capacitation

Mammalian sperm acquire fertilization capacity in the female reproductive tract in a process known as capacitation. Capacitation-associated processes ...

Ex Vivo Hepatic Perfusion Through the Portal Vein in Mouse

Ex Vivo Hepatic Perfusion Through the Portal Vein in Mouse

Eks Vivo Leverperfusjon gjennom portalvenen i mus

Metabolic diseases such as diabetes, pre-diabetes, non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD), and nonalcoholic steatohepatitis (NASH) are becoming ...

Stable Isotope Tracing & LC-MS Analysis to Measure DHODH and SDH Activities

Oxygen-Independent Assays to Measure Mitochondrial Function in Mammals

Oxygen-Independent Assays to Measure Mitochondrial Function in Mammals (Video) | JoVE 

Oksygenuavhengige analyser for å måle mitokondriefunksjon hos pattedyr

The flow of electrons in the mitochondrial electron transport chain (ETC) supports multifaceted biosynthetic, bioenergetic, and signaling functions in ...