Name: extracellular glucose depletion as an indirect measure of glucose uptake in cells and tissues ex vivo
Uploaded: 2022-04-06T14:20:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Extracellular Glucose Depletion as an Indirect Measure of Glucose Uptake in Cells and Tissues Ex Vivo at JoVE.com

O projeto foi apoiado por Ralph e Marian Falk Medical Research Catalyst Award e Kathleen Kelly Award. Outros suportes incluíram o Centro Nacional de Recursos de Pesquisa UL1RR025755 e NCI P30CA16058 (OSUCCC), o Roteiro do NIH para Pesquisa Médica. O conteúdo é de responsabilidade exclusiva dos autores e não representa as opiniões oficiais do Centro Nacional de Recursos de Pesquisa ou do NIH.

Os estudos em animais foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Universidade Estadual de Ohio (OSU, protocolo 2007A0262-R4).
NOTA: Todos os procedimentos devem ser feitos em um armário de biossegurança classe II com o soprador ligado e as luzes apagadas.
1. Preparação de materiais
NOTA: Todos os materiais estão listados na Tabela de Materiais.
<ol><li>Prepare o Medi...

<ol>
	<li>Kyrtata, N., Emsley, H. C. A., Sparasci, O., Parkes, L. M., Dickie, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+systematic+review+of+glucose+transport+alterations+in+Alzheimer's+disease.">A systematic review of glucose transport alterations in Alzheimer's disease.</a> Frontiers in Neuroscience. 15, 568 (2021).</li><li>Garcia-Carbonell, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Critical+role+of+glucose+metabolism+in+rheumatoid+arthritis+fibroblast-like+synoviocytes.">Critical role of glucose metabolism in rheumatoid arthritis fibroblast-like synoviocytes.</a> Arthritis Rheumatology. 68 (7), 1614-1626 (2016).</li><li>Kumar, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Is+diabetes+mellitus+associated+with+mortality+and+severity+of+COVID-19?+A+meta-analysis.">Is diabetes mellitus associated with mortality and severity of COVID-19? A meta-analysis.</a> Diabetes &amp; Metabolic Syndrome: Clinical Research &amp; Review. 14 (4), 535-545 (2020).</li><li>Lee, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Different+prognostic+impact+of+glucose+uptake+in+visceral+adipose+tissue+according+to+sex+in+patients+with+colorectal+cancer.">Different prognostic impact of glucose uptake in visceral adipose tissue according to sex in patients with colorectal cancer.</a> Scientific Reports. 11 (1), 21556 (2021).</li><li>Miner, M. W. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of:+(2S,4R)-4-[(18)F]Fluoroglutamine,+[(11)C]Methionine,+and+2-Deoxy-2-[(18)F]Fluoro-D-Glucose+and+two+small-animal+PET/CT+systems+imaging+rat+gliomas.">Comparison of: (2S,4R)-4-[(18)F]Fluoroglutamine, [(11)C]Methionine, and 2-Deoxy-2-[(18)F]Fluoro-D-Glucose and two small-animal PET/CT systems imaging rat gliomas.</a> Frontiers in Oncology. 11 (18), 730358 (2021).</li><li>Gumbiner, B., Thorburn, A. W., Ditzler, T. M., Bulacan, F., Henry, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+impaired+intracellular+glucose+metabolism+in+the+insulin+resistance+of+aging.">Role of impaired intracellular glucose metabolism in the insulin resistance of aging.</a> Metabolism. 41 (10), 1115-1121 (1992).</li><li>Ebrahimi, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beta+cell+identity+changes+with+mild+hyperglycemia:+Implications+for+function,+growth,+and+vulnerability.">Beta cell identity changes with mild hyperglycemia: Implications for function, growth, and vulnerability.</a> Molecular Metabolism. 35, 100959 (2020).</li><li>Ruberto, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=KLF10+integrates+circadian+timing+and+sugar+signaling+to+coordinate+hepatic+metabolism.">KLF10 integrates circadian timing and sugar signaling to coordinate hepatic metabolism.</a> Elife. 10, 65574 (2021).</li><li>Stocks, B., Zierath, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Post-translational+modifications:+The+signals+at+the+intersection+of+exercise,+glucose+uptake,+and+insulin+sensitivity.">Post-translational modifications: The signals at the intersection of exercise, glucose uptake, and insulin sensitivity.</a> Endocrinology Reviews. , (2021).</li><li>World Health Organization. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+report+on+diabetes.">Global report on diabetes.</a> World Health Organization. , (2016).</li><li>Kolb, H., Martin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Environmental/lifestyle+factors+in+the+pathogenesis+and+prevention+of+type+2+diabetes.">Environmental/lifestyle factors in the pathogenesis and prevention of type 2 diabetes.</a> BMC Medicine. 15 (1), 131 (2017).</li><li>Galicia-Garcia, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathophysiology+of+type+2+diabetes+mellitus.">Pathophysiology of type 2 diabetes mellitus.</a> International Journal of Molecular Science. 21 (17), 6275 (2020).</li><li>Petrov, M. S., Basina, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DIAGNOSIS+OF+ENDOCRINE+DISEASE:+Diagnosing+and+classifying+diabetes+in+diseases+of+the+exocrine+pancreas.">DIAGNOSIS OF ENDOCRINE DISEASE: Diagnosing and classifying diabetes in diseases of the exocrine pancreas.</a> European Journal of Endocrinology. 184 (4), 151-163 (2021).</li><li>Sirdah, M. M., Reading, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+predisposition+in+type+2+diabetes:+A+promising+approach+toward+a+personalized+management+of+diabetes.">Genetic predisposition in type 2 diabetes: A promising approach toward a personalized management of diabetes.</a> Clinical Genetics. 98 (6), 525-547 (2020).</li><li>Ramos-Lopez, O., Milagro, F. I., Riezu-Boj, J. I., Martinez, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetic+signatures+underlying+inflammation:+an+interplay+of+nutrition,+physical+activity,+metabolic+diseases,+and+environmental+factors+for+personalized+nutrition.">Epigenetic signatures underlying inflammation: an interplay of nutrition, physical activity, metabolic diseases, and environmental factors for personalized nutrition.</a> Inflammation Research. 70 (1), 29-49 (2021).</li><li>Yamamoto, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+glucose+uptake+in+cultured+cells.">Measurement of glucose uptake in cultured cells.</a> Current Protocols in Pharmacology. 71 (1), 12-14 (2015).</li><li>Yang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+sensitive+and+simple+HPLC-FLD-based+method+for+the+measurement+of+intracellular+glucose+uptake.">A sensitive and simple HPLC-FLD-based method for the measurement of intracellular glucose uptake.</a> Food Chemistry. 372, 131218 (2021).</li><li>Lee, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amino+acid-based+compound+activates+atypical+PKC+and+leptin+receptor+pathways+to+improve+glycemia+and+anxiety+like+behavior+in+diabetic+mice.">Amino acid-based compound activates atypical PKC and leptin receptor pathways to improve glycemia and anxiety like behavior in diabetic mice.</a> Biomaterials. 239, 119839 (2020).</li><li>Shukla, S. K., Mulder, S. E., Singh, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypoxia-mediated+in+vivo+tumor+glucose+uptake+measurement+and+analysis.">Hypoxia-mediated in vivo tumor glucose uptake measurement and analysis.</a> Methods in Molecular Biology. 1742, 107-113 (2018).</li><li>Jakson, I., Ujvari, D., Brusell Gidlof, S., Linden Hirschberg, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insulin+regulation+of+solute+carrier+family+2+member+1+(glucose+transporter+1)+expression+and+glucose+uptake+in+decidualizing+human+endometrial+stromal+cells:+an+in+vitro+study.">Insulin regulation of solute carrier family 2 member 1 (glucose transporter 1) expression and glucose uptake in decidualizing human endometrial stromal cells: an in vitro study.</a> Reproductive Biology and Endocrinology. 18 (1), 117 (2020).</li><li>Saparbaev, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+quantification+of+any+isoforms+of+carbohydrates+by+2D+UV-MS+fingerprinting+of+cold+ions.">Identification and quantification of any isoforms of carbohydrates by 2D UV-MS fingerprinting of cold ions.</a> Analytical Chemistry. 92 (21), 14624-14632 (2020).</li><li>Schulz, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+metabolomics+of+pellicle+and+saliva+in+children+with+different+caries+activity.">Targeted metabolomics of pellicle and saliva in children with different caries activity.</a> Scientific Reports. 10 (1), 697 (2020).</li><li>Shulman, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+magnetic+resonance+studies+of+glucose+metabolism+in+non-insulin-dependent+diabetes+mellitus+subjects.">Nuclear magnetic resonance studies of glucose metabolism in non-insulin-dependent diabetes mellitus subjects.</a> Molecular Medicine. 2 (5), 533-540 (1996).</li><li>Cochran, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+PET+imaging+with+[(18)F]FDG+to+explain+improved+glucose+uptake+in+an+apolipoprotein+A-I+treated+mouse+model+of+diabetes.">In vivo PET imaging with [(18)F]FDG to explain improved glucose uptake in an apolipoprotein A-I treated mouse model of diabetes.</a> Diabetologia. 59 (18), 1977-1984 (2016).</li><li>Lloyd, P. G., Hardin, C. D., Sturek, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Examining+glucose+transport+in+single+vascular+smooth+muscle+cells+with+a+fluorescent+glucose+analog.">Examining glucose transport in single vascular smooth muscle cells with a fluorescent glucose analog.</a> Physiological Research. 48 (6), 401-410 (1999).</li><li>Beeton, C., Garcia, A., Chandy, K. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drawing+blood+from+rats+through+the+saphenous+vein+and+by+cardiac+puncture.">Drawing blood from rats through the saphenous vein and by cardiac puncture.</a> Journal of Visualized Experiments. (7), e266 (2007).</li><li>DiSilvestro, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leptin+production+by+encapsulated+adipocytes+increases+brown+fat,+decreases+resistin,+and+improves+glucose+intolerance+in+obese+mice.">Leptin production by encapsulated adipocytes increases brown fat, decreases resistin, and improves glucose intolerance in obese mice.</a> PLoS One. 11 (4), 0153198 (2016).</li><li>Friedman, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leptin+and+the+endocrine+control+of+energy+balance.">Leptin and the endocrine control of energy balance.</a> Nature Metabolism. 1 (8), 754-764 (2019).</li><li>Guillam, M. T., Burcelin, R., Thorens, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Normal+hepatic+glucose+production+in+the+absence+of+GLUT2+reveals+an+alternative+pathway+for+glucose+release+from+hepatocytes.">Normal hepatic glucose production in the absence of GLUT2 reveals an alternative pathway for glucose release from hepatocytes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 95 (21), 12317-12321 (1998).</li><li>Guillam, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+diabetes+and+abnormal+postnatal+pancreatic+islet+development+in+mice+lacking+Glut-2.">Early diabetes and abnormal postnatal pancreatic islet development in mice lacking Glut-2.</a> Nature Genetics. 17 (3), 327-330 (1997).</li><li>Barros, L. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetic+validation+of+6-NBDG+as+a+probe+for+the+glucose+transporter+GLUT1+in+astrocytes.">Kinetic validation of 6-NBDG as a probe for the glucose transporter GLUT1 in astrocytes.</a> Journal of Neurochemistry. 109, 94-100 (2009).</li><li>Sprinz, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+blood+glucose+level+on+18F-FDG+uptake+for+PET/CT+in+normal+organs:+A+systematic+review.">Effects of blood glucose level on 18F-FDG uptake for PET/CT in normal organs: A systematic review.</a> PLoS One. 13 (2), 0193140 (2018).</li><li>Johnson, T. V., Martin, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+characterization+of+an+adult+retinal+explant+organotypic+tissue+culture+system+as+an+in+vitro+intraocular+stem+cell+transplantation+model.">Development and characterization of an adult retinal explant organotypic tissue culture system as an in vitro intraocular stem cell transplantation model.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 49 (8), 3503-3512 (2008).</li><li>de Urquiza, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Docosahexaenoic+acid,+a+ligand+for+the+retinoid+X+receptor+in+mouse+brain.">Docosahexaenoic acid, a ligand for the retinoid X receptor in mouse brain.</a> Science. 290 (5499), 2140-2144 (2000).</li><li>Olson, A. L., Pessin, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure,+function,+and+regulation+of+the+mammalian+facilitative+glucose+transporter+gene+family.">Structure, function, and regulation of the mammalian facilitative glucose transporter gene family.</a> Annual Review of Nutrition. 16 (1), 235-256 (1996).</li><li>Muhanna, D., Arnipalli, S. R., Kumar, S. B., Ziouzenkova, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osmotic+adaptation+by+Na(+)-dependent+transporters+and+ACE2:+correlation+with+hemostatic+crisis+in+COVID-19.">Osmotic adaptation by Na(+)-dependent transporters and ACE2: correlation with hemostatic crisis in COVID-19.</a> Biomedicines. 8 (11), 460 (2020).</li><li>Ligasova, A., Koberna, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+dyes-highly+sensitive+reporters+of+cell+quantification:+comparison+with+other+cell+quantification+methods.">DNA dyes-highly sensitive reporters of cell quantification: comparison with other cell quantification methods.</a> Molecules. 26 (18), 5515 (2021).</li><li>DeFronzo, R. A., Tobin, J. D., Andres, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glucose+clamp+technique:+a+method+for+quantifying+insulin+secretion+and+resistance.">Glucose clamp technique: a method for quantifying insulin secretion and resistance.</a> American Journal of Physiology. 237 (3), 214-223 (1979).</li></ol>

A comparação direta do esgotamento extracelular da glicose FD com a absorção normalizada de glicose intracelular na cultura celular mostrou uma alta correlação, sugerindo que o esgotamento extracelular da glicose poderia ser uma medida substituta para a avaliação da absorção de glicose. A medição da glicemia de FD extracelular pode usar uma ampla gama de concentrações de glicose FD, também 0,5-2,5 μg FD-glicose/mL parecem fornecer a faixa ideal. A glicemia de FD extracelular não requer normalização par...

A demanda por medição da absorção de glicose aumenta juntamente com a necessidade crítica de enfrentar um aumento epidêmico em uma infinidade de doenças dependentes do metabolismo da glicose. Os mecanismos subjacentes de doenças metabólicas degenerativas, distúrbios neurológicos e cognitivos1, inflamatório2 e doenças infecciosas3, câncer 4,5, bem como envelhecimento6, dependem do metabolismo de glicose para energia e seu armazenamento, processos anabólicos, inflamação de proteínas e genes, sinalização, regulação de genes e síntese de ácidos nucleicos e replicação 7,8,9 . Diabetes mellitus (DM) está diretamente relacionada ao mau funcionamento da regulação da absorção de glicose. DM é um espectro de doenças crônicas como tipo-1, -2 e -3 diabetes mellitus, diabetes gestacional, diabetes de início de maturidade dos jovens e outros tipos dessa doença induzidas por fatores ambientais e/ou genéticos. Em 2016, o primeiro relatório global da OMS sobre diabetes demonstrou que o número de adultos vivendo com o DM mais difundido quase quadruplicou desde 1980 para 422 milhões de adultos10, e esse número de pacientes com DM tem aumentado exponencialmente nas últimas décadas. Só em 2019, a estimativa de 1,5 milhão de mortes foi diretamente causada pelo DM10. Esse aumento dramático deve-se ao aumento do DM tipo 2 e às condições que o conduzem, incluindo sobrepeso e obesidade10. A pandemia COVID-19 revelou um aumento de duas vezes na mortalidade em pacientes com DM em comparação com a população geral, sugerindo o papel profundo, mas mal compreendido, do metabolismo da glicose na defesa imunológica3. Prevenção, diagnóstico precoce e tratamento de DM, obesidade e outras doenças requerem otimização das medidas de captação de glicose por diferentes tecidos, e identificação de fatores ambientais11, nutricionais12, endócrinos13,genéticos 14 e15 fatores epigenéticos que afetam a captação de glicose.
Em pesquisa, a absorção intracelular e/ou tecidual de glicose é comumente medida por glicose fluorescente (FD-glicose) in vitro 16,17,18 e in vivo19. A fD-glicose tornou-se um método preferido em comparação com métodos mais precisos usando glicose radioativamente rotulada20, análise de espectroscopia de massa analítica21, metabolômica22, métodos de ressonância magnética nuclear23 e tomografia/tomografia computadorizada de emissão de pósitrons (PET/CT)5,24. Ao contrário da absorção de glicose FD, métodos analíticos que requerem mais material biológico podem envolver uma preparação de amostras em várias etapas, instrumentos caros e análise de dados complexos. Medições eficazes e baratas da absorção de FD-glicose nas culturas celulares têm sido utilizadas em experimentos de prova de conceito e podem exigir validação por outros métodos.
A base da aplicação de FD-glicose para estudos de absorção de glicose é o metabolismo reduzido de FD-glicose em comparação com a glicose endógena25. No entanto, tanto a glicose endógena quanto a fd-glicose são distribuídas dinamicamente entre todos os compartimentos celulares para uso em processos anabólicos, catabólicos e de sinalização. A compartimentação e o processamento dependente do tempo25 de FD-glicose interferem nas medidas de fluorescência, e representam os principais fatores limitadores para o uso deste ensaio em experimentos de triagem de alto rendimento, análise cinética, cultura celular 3D, co-culturas e experimentos de explant tecidual. Aqui, fornecemos dados demonstrando uma alta correlação entre o esgotamento extracelular da glicemia FD e sua absorção intracelular, sugerindo o esgotamento extracelular da fd-glicose como uma medida substituta para absorção intracelular de glicose. A medição do esgotamento extracelular da glicose foi aplicada para validar diferenças específicas de tecido na absorção de glicose em camundongos tratados com insulina e uma droga experimental18 para fornecer uma prova de princípio deste método.
O protocolo atual descreve medições intracelulares e extracelulares (Figura 1) da absorção de fd-glicose em células 3T3-L1. As seções de protocolo 1-7 explicam a cultura e o crescimento das células por 48 h; fome celular, estimulação e medidas extracelulares de linha de base; e medidas pós-estimulação de medidas extracelulares de FD-glicose e medidas intracelulares de FD-glicose e proteína. A seção 8 do protocolo descreve a medição ex vivo da absorção extracelular de fd-glicose em tecidos dissecados de camundongos ob/ob na presença e ausência de insulina e composto de aminoácidos 2 (AAC2) descritos em outros lugares18.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>3T3-L1 mouse fibroblasts</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CL-173</td>
			<td>Cell line</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plates</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353227</td>
			<td>Plastic ware</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B6.V-Lepob/J male mice</td>
			<td>Jackson Laboratory</td>
			<td>stock number 000632</td>
			<td>Mice</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BioTek Synergy H1 modular multimode microplate reader (Fisher Scientific, US)</td>
			<td>Fisher Scientific, US</td>
			<td>&#160;B-SHT</td>
			<td>Device</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum</td>
			<td>Gibco/ThermoFisher</td>
			<td>161790-060</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calf serum</td>
			<td>Gibco/ThermoFisher</td>
			<td>26010-066</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell incubator</td>
			<td>Forma</td>
			<td>Series II Water Jacket</td>
			<td>Device</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diet (mouse/rat diet, irradiated)</td>
			<td>Envigo</td>
			<td>Teklad LM-485</td>
			<td>Diet</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethylsulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Sigma LifeScience</td>
			<td>D2650-100mL</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium</td>
			<td>Gibco/ThermoFisher</td>
			<td>&#160;11965-092</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>E7023-500mL</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent 2-deoxy-2-[(7-nitro-2,1,3-benzoxadiazol-4-yl) amino]-D-glucose)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>72987-1MG</td>
			<td>Assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose-free and phenol red-free DMEM</td>
			<td>Gibco/ThermoFisher</td>
			<td>A14430-01</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human insulin 10 mg/mL</td>
			<td>MilliporeSigma, Cat N 91077C</td>
			<td>Cat N 91077C</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane, 5%</td>
			<td>Henry Schein</td>
			<td>NDC 11695-6776-2</td>
			<td>Anestaetic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/streptomycin (P/S)</td>
			<td>Gibco/ThermoFisher</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>DA537-500 mL</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce bicinchoninic acid (BCA) protein assay</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>Cat N23225</td>
			<td>Assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Radioimmunoprecipitation assay lysis buffer</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-24948</td>
			<td>Assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0.05%)</td>
			<td>Gibco/ThermoFisher</td>
			<td>&#160;25300-054</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

extracellular glucose depletion as an indirect measure of glucose uptake in cells and tissues ex vivo

A epidemia mundial de diabetes aumenta a demanda pela identificação de fatores ambientais, nutricionais, endócrinos, genéticos e epigenéticos que afetam a absorção de glicose. A medição da fluorescência intracelular é um método amplamente utilizado para testar a absorção de glicose fluorescente (FD-glicose) em células in vitro, ou para tecidos que consomem glicose em imagens in vivo. Este ensaio avalia a absorção de glicose em um ponto de tempo escolhido. A análise intracelular pressupõe que o metabolismo da fd-glicose é mais lento do que o da glicose endógena, que participa de reações catabólicas e anabólicos e sinalização. No entanto, o metabolismo dinâmico da glicose também altera os mecanismos de absorção, o que exigiria medidas cinéticas de absorção de glicose em resposta a diferentes fatores. Este artigo descreve um método para medir o esgotamento extracelular da glicose FD e valida sua correlação com a absorção intracelular de FD-glicose em células e tecidos ex vivo. O esgotamento extracelular da glicose pode ser potencialmente aplicável para estudos cinéticos e dependentes de doses de alta produtividade, bem como identificar compostos com atividade glicêmica e seus efeitos específicos do tecido.

A ingestão intracelular e o esgotamento extracelular da glicose foram medidos em pré-adipócitos 3T3-L1, em resposta a diferentes concentrações de FD-glicose (Figura 2) com e sem estimulação de insulina. A Figura 2A demonstra um aumento dependente de dose na absorção intracelular da fd-glicose, que foi significativamente aumentada na presença de insulina. A diminuição concomitante da glicemia de FD extracelular nas mesmas células é mostrada na <stro...

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Extracellular Glucose Depletion as an Indirect Measure of Glucose Uptake in Cells and Tissues Ex Vivo

O esgotamento extracelular da glicose fluorescente se correlaciona com a absorção de glicose e pode ser usado para triagem de alto rendimento da absorção de glicose em órgãos excisados e culturas celulares.

Esgotamento da glicose extracelular como medida indireta de captação de glicose em células e tecidos Ex Vivo

The ongoing worldwide epidemic of diabetes increases the demand for the identification of environmental, nutritional, endocrine, genetic, and epigenetic ...

A captação de glicose é a chave para entender a saúde e a doença. Como a glicose desempenha um papel fundamental nas demandas metabólicas e estruturais no corpo humano, além de desempenhar um papel vital na regulação. A medição extracelular da glicose permite o desenvolvimento de ensaios de alto rendimento para cinéticas de absorção de glicose em células, tecidos e órgãos de diferentes origens genéticas em resposta a nutrientes ou drogas.Este ensaio seria uma ferramenta valiosa para a descoberta de terapêutica e nutrição para diabetes, câncer, doenças degenerativas do sistema nervoso central, obesidade e todas as doenças da glicose e metabolismo. O ensaio precisa de um ajuste de tempo para fome e estimulação que deve ser baseado em especificidades metabólicas para diferentes tecidos e culturas celulares. Fibroblastos de camundongos 3T3-L1 por revestimento de 10 a 6 células, diluídos em 20 mililitros de média 1 em 296 placas de poço.Placa 100 microliters de suspensão celular por poço, garantindo manter a homogeneidade desta suspensão misturando. Cultivar células por 48 horas em uma incubadora Celsius de 37 graus sem mudar a mídia até cerca de 70 a 80% de confluência. Mantenha as células confluentes e jejuadas, culminando-as no mesmo meio por 48 horas.Varie o tempo de incubação de 24 a 72 horas, dependendo do estado catabólico de jejum desejado. Mídia decantada de células nas 96 placas do poço. Absorva o fluido restante usando toalhas de papel estéreis.Enxágüe a placa de 96 poços com 100 microliters de PBS por poço, e absorva o fluido restante com toalhas de papel estéreis. Adicione 100 microliters de DMEM livre de glicose por poço e incubar por 40 minutos. Ajuste o tempo de incubação dependendo dos estímulos do tipo celular e do nível desejado de jejum.Use oito réplicas para cada condição de simulação. Portanto, prepare um mililitro para cada condição de simulação. Use sete condições de simulação sem insulina.Glicose FD de 2,5 microgramas por mililitro, 1 micrograma por mililitro, 0,5 micrograma por mililitro, 0,2 micrograma por mililitro, 0,1 micrograma por mililitro, 0,05 microgramas por mililitro e 0 miligrama por mililitro em placa de 196. Use sete condições de estimulação com insulina. Glicose FD de 2,5 microgramas por mililitro, 1 micrograma por mililitro, 0,5 micrograma por mililitro, 0,2 micrograma por mililitro, 0,1 micrograma por mililitro, 0,05 microgramas por mililitro e 0 micrograma por mililitro em outra placa de poço de 96.Para preparar as condições de estimulação, diluir um microlitr de cinco miligramas por solução de trabalho de glicose FD mililitro, e 999 microliters de DMEM livre de glicose para obter um mililitro de solução de estoque de trabalho. Usando esta solução de estoque de trabalho, prepare de 1 a 2000, 1 a 5.000, 1 a 10.000, 1 a 25.000, 1 a 50.000, e 1 a 100.000 delírios de glicose FD para obter 2,5 microgramas por mililitro, 1 micrograma per mililitro, 0,5 micrograma por mililitro, 0,2 micrograma por mililitro, 0,05 microgramas por mililitro em dois tubos mililitros imediatamente antes de experimentos em um armário de biossegurança sem luzes. Adicione um microliter de insulina a cada uma dessas condições.Após 40 minutos de incubação, decante o DMEM livre de glicose de cada poço em 96 placas de poço, e absorva o fluido restante com toalhas de papel estéreis. Adicione 100 microliters cada um das várias condições de tratamento descritas anteriormente, a poços ao longo de uma coluna. E 100 microliters da mesma condição de tratamento para os poços ao longo da linha em ambas as 96 placas de parede.Rotule as placas que utilizaram as condições, com e sem insulina. Adicione dMEM sem glicose sozinho aos poços de controle. Incubar a placa por 40 minutos na incubadora de cultura celular no escuro.Depois que as células foram estimuladas por 40 minutos. Transfira a mídia de estimulação de ambas as placas para novas placas de poço 96, mantendo o mesmo layout experimental. Lave as células com PBS.Remova o PBS e decante qualquer solução restante em toalhas de papel estéreis. Adicione um inibidor de protease ao tampão de ensaio de imunoprecipitação de rádio para proteger as proteínas. Coloque placas contendo ensaio de imunoprecipitação por rádio em um agitador por 30 minutos.Usando um leitor de microplaca, meça fluorescência em comprimentos de onda de excitação e emissão a 485 e 535 nanômetros, respectivamente. Primeiro no meio contendo glicose FD extracelular, e depois a placa com radioimunoprecipitação ensaio células lized no final de 30 minutos de incubação. Realize o ensaio de proteína BCA de acordo com as instruções do fabricante.Quantifique as concentrações proteicas em cada poço contendo radioiprecipitação as células lized. Use 10 microliters do ensaio de imunoprecipitação de rádio homogeneizar, e medir concentrações proteicas, e triplicar para aumentar a precisão das medições em 96 placas de poço. Quantifique a proteína com base nos padrões proteicos analisados em conjunto com amostras em cada placa de poço de 96.Incubar os tecidos ou órgãos colhidos em uma placa de seis poços contendo PBS por um minuto. Manuseie cada tecido ou órgão em um poço separado. Após um minuto, coloque cada tecido em uma toalha de papel estéril para absorver PBS.Transfira tecidos ou órgãos em uma placa de parede separada contendo 4.000 microliters de DMEM sem glicose e incubar por dois minutos. Após dois minutos, remova e transfira os tecidos para poços de uma placa de seis poços contendo solução de trabalho de glicose 0,29 Millimolar FD. Incubar as seis placas de poço contendo tecidos na solução de trabalho de glicose FD a 37 graus Celsius.Colete 100 microliters de solução de trabalho de glicose FD de cada poço após 0, 10, 20, 30, 40, 60, 90 e 120 minutos de incubação, e transfira coletou 100 microliters de solução de glicose FD em 96 placas de poço para analisar a cinética do esgotamento de glicose extracelular FD. Agite antes e depois da coleta. Meça a fluorescência na excitação em comprimentos de onda de emissão em 485 e 535 nanômetros, respectivamente usando um leitor de microplaca.A dependência de dose na absorção intracelular da glicose FD foi significativamente aumentada na presença de insulina. A estimulação da insulina levou a uma diminuição significativa dos níveis extracelulares de glicose FD em comparação com as amostras sem estimulação de insulina. O esgotamento extracelular da glicose FD pode medir uma mudança na absorção de glicose com precisão comparável como absorção intracelular de glicose FD.A glicose fd extracelular não foi esgotada em gordura visceral de controle não estimulada durante 120 minutos de incubação. Em contraste, o pré-tratamento de camundongos com insulina ou AAC2 antes da dissecção, levou a um esgotamento significativo da glicose FD extracelular dentro de um intervalo de tempo de 30 minutos e 60 minutos, respectivamente. A glicose FD extracelular não foi esgotada em explants hepáticas estimuladas pela insulina, em comparação com explants hepáticas não estimuladas.A glicose FD extracelular foi significativamente diminuída na forma dependente do tempo, e as explanagens hepáticas pré-tratadas com esgotamento de AAC2,22% de glicose foram observadas no meio extracelular contendo o cérebro não tratado após 60 minutos de incubação. O meio incubado com cérebros de camundongos tratados com insulina tem mostrado uma diminuição 5% linear na glicose FD. Os cérebros estimulados a AAC2 levaram a uma profunda diminuição rápida para 67,4% da glicose fd extracelular durante os primeiros 20 minutos.A substância que envolve a lavagem é especialmente importante para remover vestígios de glicose, sangue ou soro dentro do meio e, ou órgãos, pois pode interferir na leitura da fluorescência desses meios. Após a identificação de alto rendimento de compostos de metabólitos em genes com propriedades glicêmicas, bem como as condições ideais para seus experimentos in vivo de ação, poderia ser validada com glicose FD rotulada e escaneamento PET para confirmar o acúmulo de glicose em órgãos específicos. Esta técnica de descoberta de ação glicêmica é benéfica tanto na exclusão de inúmeros metabólitos, terapêuticas ou suas combinações, e destaca suas ações em diferentes órgãos.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Extracellular Glucose Depletion as an Indirect Measure of Glucose Uptake in Cells and Tissues Ex Vivo

A Method for Measuring RNA N6-methyladenosine Modifications in Cells and Tissues

A Method for Measuring RNA N6-methyladenosine Modifications in Cells and Tissues

Um método para medir RNA<em&gt; N</em<sup&gt; 6</sup&gt; -methyladenosine modificações nas células e tecidos

N6-Methyladenosine (m6A) modifications of RNA are diverse and ubiquitous amongst eukaryotes. They occur in mRNA, rRNA, tRNA, and microRNA. Recent studies ...

Bioquímica

Brain Membrane Fractionation: An Ex Vivo Approach to Assess Subsynaptic Protein Localization

Brain Membrane Fractionation: An Ex Vivo Approach to Assess Subsynaptic Protein Localization

Fracionamento de Membranas Cerebrais: Um<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Abordagem para Avaliar a Localização de Proteínas Subinápticas

Assessing the synaptic protein composition and function constitutes an important challenge in neuroscience. However, it is not easy to evaluate ...

Dissipative Microgravimetry to Study the Binding Dynamics of the Phospholipid Binding Protein Annexin A2 to Solid-supported Lipid Bilayers Using a Quartz Resonator

Microgravimetry dissipativo para estudar a dinâmica da vinculação do fosfolipídeo proteína anexina A2 para Bilayers do Lipid com suporte sólido usando um ressonador de quartzo

The dissipative quartz crystal microbalance technique is a simple and label-free approach to measure simultaneously the mass uptake and viscoelastic ...

Analysis of Endocytic Uptake and Retrograde Transport to the Trans-Golgi Network Using Functionalized Nanobodies in Cultured Cells

Análise de absorção endocítica e transporte retrógrado à rede Trans-Golgi usando funcionalizados Nanobodies em culturas de células

Transport of proteins and membranes from the cell surface to the Golgi and beyond is essential for homeostasis, organelle identity and physiology. To ...

Atomic Absorbance Spectroscopy to Measure Intracellular Zinc Pools in Mammalian Cells

Espectroscopia de absorvância atômica para medir piscinas de zinco intracelular em células de mamíferos

Transition metals are essential micronutrients for organisms but can be toxic to cells at high concentrations by competing with physiological metals in ...

Quantification of Coenzyme A in Cells and Tissues

Quantificação da coenzima A em células e tecidos

Emerging research has revealed that the cellular coenzyme A (CoA) supply can become limiting with a detrimental impact on growth, metabolism and survival. ...

An Integrated Raman Spectroscopy and Mass Spectrometry Platform to Study Single-Cell Drug Uptake, Metabolism, and Effects

Uma plataforma integrada de espectroscopia e espectrometria de massa para estudar a absorção, metabolismo e efeitos de drogas unicelulares

Cells are known to be inherently heterogeneous in their responses to drugs. Therefore, it is essential that single-cell heterogeneity is accounted for in ...

Using an Extracellular Flux Analyzer to Measure Changes in Glycolysis and Oxidative Phosphorylation during Mouse Sperm Capacitation

Usando um analisador de fluxo extracelular para medir mudanças na glicodiose e fosforilação oxidativa durante a capacitação do esperma do rato

Mammalian sperm acquire fertilization capacity in the female reproductive tract in a process known as capacitation. Capacitation-associated processes ...

Ex Vivo Hepatic Perfusion Through the Portal Vein in Mouse

Ex Vivo Hepatic Perfusion Through the Portal Vein in Mouse

Ex Vivo Perfusão hepática através do Portal Veia em Rato

Metabolic diseases such as diabetes, pre-diabetes, non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD), and nonalcoholic steatohepatitis (NASH) are becoming ...

Stable Isotope Tracing & LC-MS Analysis to Measure DHODH and SDH Activities

Oxygen-Independent Assays to Measure Mitochondrial Function in Mammals

Oxygen-Independent Assays to Measure Mitochondrial Function in Mammals (Video) | JoVE 

Ensaios Independentes de Oxigênio para Medir a Função Mitocondrial em Mamíferos

The flow of electrons in the mitochondrial electron transport chain (ETC) supports multifaceted biosynthetic, bioenergetic, and signaling functions in ...