Name: extracellular glucose depletion as an indirect measure of glucose uptake in cells and tissues ex vivo
Uploaded: 2022-04-06T14:20:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Extracellular Glucose Depletion as an Indirect Measure of Glucose Uptake in Cells and Tissues Ex Vivo at JoVE.com

Проект был поддержан Ralph and Marian Falk Medical Research Catalyst Award и Kathleen Kelly Award. Другие виды поддержки включали Национальный центр исследовательских ресурсов UL1RR025755 и NCI P30CA16058 (OSUCCC), Дорожную карту NIH для медицинских исследований. Содержание является исключительной ответственностью авторов и не отражает официальную точку зрения Национального центра исследовательских ресурсов или NIH.

Исследования на животных были одобрены Институциональным комитетом по уходу за животными и их использованию Университета штата Огайо (OSU, протокол 2007A0262-R4).
ПРИМЕЧАНИЕ: Все процедуры должны проводиться в шкафу биобезопасности класса II с включенным воздуходувкой и выключ...

<ol>
	<li>Kyrtata, N., Emsley, H. C. A., Sparasci, O., Parkes, L. M., Dickie, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+systematic+review+of+glucose+transport+alterations+in+Alzheimer's+disease.">A systematic review of glucose transport alterations in Alzheimer's disease.</a> Frontiers in Neuroscience. 15, 568 (2021).</li><li>Garcia-Carbonell, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Critical+role+of+glucose+metabolism+in+rheumatoid+arthritis+fibroblast-like+synoviocytes.">Critical role of glucose metabolism in rheumatoid arthritis fibroblast-like synoviocytes.</a> Arthritis Rheumatology. 68 (7), 1614-1626 (2016).</li><li>Kumar, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Is+diabetes+mellitus+associated+with+mortality+and+severity+of+COVID-19?+A+meta-analysis.">Is diabetes mellitus associated with mortality and severity of COVID-19? A meta-analysis.</a> Diabetes &amp; Metabolic Syndrome: Clinical Research &amp; Review. 14 (4), 535-545 (2020).</li><li>Lee, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Different+prognostic+impact+of+glucose+uptake+in+visceral+adipose+tissue+according+to+sex+in+patients+with+colorectal+cancer.">Different prognostic impact of glucose uptake in visceral adipose tissue according to sex in patients with colorectal cancer.</a> Scientific Reports. 11 (1), 21556 (2021).</li><li>Miner, M. W. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of:+(2S,4R)-4-[(18)F]Fluoroglutamine,+[(11)C]Methionine,+and+2-Deoxy-2-[(18)F]Fluoro-D-Glucose+and+two+small-animal+PET/CT+systems+imaging+rat+gliomas.">Comparison of: (2S,4R)-4-[(18)F]Fluoroglutamine, [(11)C]Methionine, and 2-Deoxy-2-[(18)F]Fluoro-D-Glucose and two small-animal PET/CT systems imaging rat gliomas.</a> Frontiers in Oncology. 11 (18), 730358 (2021).</li><li>Gumbiner, B., Thorburn, A. W., Ditzler, T. M., Bulacan, F., Henry, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+impaired+intracellular+glucose+metabolism+in+the+insulin+resistance+of+aging.">Role of impaired intracellular glucose metabolism in the insulin resistance of aging.</a> Metabolism. 41 (10), 1115-1121 (1992).</li><li>Ebrahimi, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beta+cell+identity+changes+with+mild+hyperglycemia:+Implications+for+function,+growth,+and+vulnerability.">Beta cell identity changes with mild hyperglycemia: Implications for function, growth, and vulnerability.</a> Molecular Metabolism. 35, 100959 (2020).</li><li>Ruberto, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=KLF10+integrates+circadian+timing+and+sugar+signaling+to+coordinate+hepatic+metabolism.">KLF10 integrates circadian timing and sugar signaling to coordinate hepatic metabolism.</a> Elife. 10, 65574 (2021).</li><li>Stocks, B., Zierath, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Post-translational+modifications:+The+signals+at+the+intersection+of+exercise,+glucose+uptake,+and+insulin+sensitivity.">Post-translational modifications: The signals at the intersection of exercise, glucose uptake, and insulin sensitivity.</a> Endocrinology Reviews. , (2021).</li><li>World Health Organization. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+report+on+diabetes.">Global report on diabetes.</a> World Health Organization. , (2016).</li><li>Kolb, H., Martin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Environmental/lifestyle+factors+in+the+pathogenesis+and+prevention+of+type+2+diabetes.">Environmental/lifestyle factors in the pathogenesis and prevention of type 2 diabetes.</a> BMC Medicine. 15 (1), 131 (2017).</li><li>Galicia-Garcia, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathophysiology+of+type+2+diabetes+mellitus.">Pathophysiology of type 2 diabetes mellitus.</a> International Journal of Molecular Science. 21 (17), 6275 (2020).</li><li>Petrov, M. S., Basina, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DIAGNOSIS+OF+ENDOCRINE+DISEASE:+Diagnosing+and+classifying+diabetes+in+diseases+of+the+exocrine+pancreas.">DIAGNOSIS OF ENDOCRINE DISEASE: Diagnosing and classifying diabetes in diseases of the exocrine pancreas.</a> European Journal of Endocrinology. 184 (4), 151-163 (2021).</li><li>Sirdah, M. M., Reading, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+predisposition+in+type+2+diabetes:+A+promising+approach+toward+a+personalized+management+of+diabetes.">Genetic predisposition in type 2 diabetes: A promising approach toward a personalized management of diabetes.</a> Clinical Genetics. 98 (6), 525-547 (2020).</li><li>Ramos-Lopez, O., Milagro, F. I., Riezu-Boj, J. I., Martinez, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetic+signatures+underlying+inflammation:+an+interplay+of+nutrition,+physical+activity,+metabolic+diseases,+and+environmental+factors+for+personalized+nutrition.">Epigenetic signatures underlying inflammation: an interplay of nutrition, physical activity, metabolic diseases, and environmental factors for personalized nutrition.</a> Inflammation Research. 70 (1), 29-49 (2021).</li><li>Yamamoto, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+glucose+uptake+in+cultured+cells.">Measurement of glucose uptake in cultured cells.</a> Current Protocols in Pharmacology. 71 (1), 12-14 (2015).</li><li>Yang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+sensitive+and+simple+HPLC-FLD-based+method+for+the+measurement+of+intracellular+glucose+uptake.">A sensitive and simple HPLC-FLD-based method for the measurement of intracellular glucose uptake.</a> Food Chemistry. 372, 131218 (2021).</li><li>Lee, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amino+acid-based+compound+activates+atypical+PKC+and+leptin+receptor+pathways+to+improve+glycemia+and+anxiety+like+behavior+in+diabetic+mice.">Amino acid-based compound activates atypical PKC and leptin receptor pathways to improve glycemia and anxiety like behavior in diabetic mice.</a> Biomaterials. 239, 119839 (2020).</li><li>Shukla, S. K., Mulder, S. E., Singh, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypoxia-mediated+in+vivo+tumor+glucose+uptake+measurement+and+analysis.">Hypoxia-mediated in vivo tumor glucose uptake measurement and analysis.</a> Methods in Molecular Biology. 1742, 107-113 (2018).</li><li>Jakson, I., Ujvari, D., Brusell Gidlof, S., Linden Hirschberg, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insulin+regulation+of+solute+carrier+family+2+member+1+(glucose+transporter+1)+expression+and+glucose+uptake+in+decidualizing+human+endometrial+stromal+cells:+an+in+vitro+study.">Insulin regulation of solute carrier family 2 member 1 (glucose transporter 1) expression and glucose uptake in decidualizing human endometrial stromal cells: an in vitro study.</a> Reproductive Biology and Endocrinology. 18 (1), 117 (2020).</li><li>Saparbaev, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+quantification+of+any+isoforms+of+carbohydrates+by+2D+UV-MS+fingerprinting+of+cold+ions.">Identification and quantification of any isoforms of carbohydrates by 2D UV-MS fingerprinting of cold ions.</a> Analytical Chemistry. 92 (21), 14624-14632 (2020).</li><li>Schulz, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+metabolomics+of+pellicle+and+saliva+in+children+with+different+caries+activity.">Targeted metabolomics of pellicle and saliva in children with different caries activity.</a> Scientific Reports. 10 (1), 697 (2020).</li><li>Shulman, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+magnetic+resonance+studies+of+glucose+metabolism+in+non-insulin-dependent+diabetes+mellitus+subjects.">Nuclear magnetic resonance studies of glucose metabolism in non-insulin-dependent diabetes mellitus subjects.</a> Molecular Medicine. 2 (5), 533-540 (1996).</li><li>Cochran, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+PET+imaging+with+[(18)F]FDG+to+explain+improved+glucose+uptake+in+an+apolipoprotein+A-I+treated+mouse+model+of+diabetes.">In vivo PET imaging with [(18)F]FDG to explain improved glucose uptake in an apolipoprotein A-I treated mouse model of diabetes.</a> Diabetologia. 59 (18), 1977-1984 (2016).</li><li>Lloyd, P. G., Hardin, C. D., Sturek, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Examining+glucose+transport+in+single+vascular+smooth+muscle+cells+with+a+fluorescent+glucose+analog.">Examining glucose transport in single vascular smooth muscle cells with a fluorescent glucose analog.</a> Physiological Research. 48 (6), 401-410 (1999).</li><li>Beeton, C., Garcia, A., Chandy, K. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drawing+blood+from+rats+through+the+saphenous+vein+and+by+cardiac+puncture.">Drawing blood from rats through the saphenous vein and by cardiac puncture.</a> Journal of Visualized Experiments. (7), e266 (2007).</li><li>DiSilvestro, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leptin+production+by+encapsulated+adipocytes+increases+brown+fat,+decreases+resistin,+and+improves+glucose+intolerance+in+obese+mice.">Leptin production by encapsulated adipocytes increases brown fat, decreases resistin, and improves glucose intolerance in obese mice.</a> PLoS One. 11 (4), 0153198 (2016).</li><li>Friedman, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leptin+and+the+endocrine+control+of+energy+balance.">Leptin and the endocrine control of energy balance.</a> Nature Metabolism. 1 (8), 754-764 (2019).</li><li>Guillam, M. T., Burcelin, R., Thorens, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Normal+hepatic+glucose+production+in+the+absence+of+GLUT2+reveals+an+alternative+pathway+for+glucose+release+from+hepatocytes.">Normal hepatic glucose production in the absence of GLUT2 reveals an alternative pathway for glucose release from hepatocytes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 95 (21), 12317-12321 (1998).</li><li>Guillam, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+diabetes+and+abnormal+postnatal+pancreatic+islet+development+in+mice+lacking+Glut-2.">Early diabetes and abnormal postnatal pancreatic islet development in mice lacking Glut-2.</a> Nature Genetics. 17 (3), 327-330 (1997).</li><li>Barros, L. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetic+validation+of+6-NBDG+as+a+probe+for+the+glucose+transporter+GLUT1+in+astrocytes.">Kinetic validation of 6-NBDG as a probe for the glucose transporter GLUT1 in astrocytes.</a> Journal of Neurochemistry. 109, 94-100 (2009).</li><li>Sprinz, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+blood+glucose+level+on+18F-FDG+uptake+for+PET/CT+in+normal+organs:+A+systematic+review.">Effects of blood glucose level on 18F-FDG uptake for PET/CT in normal organs: A systematic review.</a> PLoS One. 13 (2), 0193140 (2018).</li><li>Johnson, T. V., Martin, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+characterization+of+an+adult+retinal+explant+organotypic+tissue+culture+system+as+an+in+vitro+intraocular+stem+cell+transplantation+model.">Development and characterization of an adult retinal explant organotypic tissue culture system as an in vitro intraocular stem cell transplantation model.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 49 (8), 3503-3512 (2008).</li><li>de Urquiza, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Docosahexaenoic+acid,+a+ligand+for+the+retinoid+X+receptor+in+mouse+brain.">Docosahexaenoic acid, a ligand for the retinoid X receptor in mouse brain.</a> Science. 290 (5499), 2140-2144 (2000).</li><li>Olson, A. L., Pessin, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure,+function,+and+regulation+of+the+mammalian+facilitative+glucose+transporter+gene+family.">Structure, function, and regulation of the mammalian facilitative glucose transporter gene family.</a> Annual Review of Nutrition. 16 (1), 235-256 (1996).</li><li>Muhanna, D., Arnipalli, S. R., Kumar, S. B., Ziouzenkova, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osmotic+adaptation+by+Na(+)-dependent+transporters+and+ACE2:+correlation+with+hemostatic+crisis+in+COVID-19.">Osmotic adaptation by Na(+)-dependent transporters and ACE2: correlation with hemostatic crisis in COVID-19.</a> Biomedicines. 8 (11), 460 (2020).</li><li>Ligasova, A., Koberna, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+dyes-highly+sensitive+reporters+of+cell+quantification:+comparison+with+other+cell+quantification+methods.">DNA dyes-highly sensitive reporters of cell quantification: comparison with other cell quantification methods.</a> Molecules. 26 (18), 5515 (2021).</li><li>DeFronzo, R. A., Tobin, J. D., Andres, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glucose+clamp+technique:+a+method+for+quantifying+insulin+secretion+and+resistance.">Glucose clamp technique: a method for quantifying insulin secretion and resistance.</a> American Journal of Physiology. 237 (3), 214-223 (1979).</li></ol>

Прямое сравнение внеклеточного истощения FD-глюкозы с нормализованным внутриклеточным поглощением глюкозы в культуре клеток показало высокую корреляцию, предполагая, что внеклеточное истощение глюкозы может быть суррогатным измерением для оценки поглощения глюкозы. Измерение внекл...

Спрос на измерение поглощения глюкозы растет вместе с острой необходимостью борьбы с эпидемическим ростом множества заболеваний, зависящих от метаболизма глюкозы. Основные механизмы дегенеративных метаболических заболеваний, неврологических и когнитивных расстройств1, воспалительных2 и инфекционных заболеваний3, рака 4,5, а также старения6 зависят от метаболизма глюкозы для получения энергии и ее хранения, анаболических процессов, модификации белка и генов, передачи сигналов, регуляции генов и синтеза и репликации нуклеиновых кислот 7,8,9 . Сахарный диабет (СД) напрямую связан с нарушением регуляции поглощения глюкозы. СД представляет собой спектр хронических заболеваний, таких как сахарный диабет 1 типа, -2 и -3, гестационный диабет, диабет зрелости молодых людей и другие типы этого заболевания, вызванные экологическими и / или генетическими факторами. В 2016 году первый Глобальный доклад ВОЗ о диабете продемонстрировал, что число взрослых, живущих с наиболее распространенным СД, увеличилось почти в четыре раза с 1980 года до 422 миллионов взрослых10, и это число пациентов с СД растет экспоненциально в течение последних нескольких десятилетий. Только в 2019 году, по оценкам, 1,5 миллиона смертей были непосредственно вызваны СД10. Этот резкий всплеск связан с ростом СД 2 типа и условиями, приводящими к нему, включая избыточный вес и ожирение10. Пандемия COVID-19 выявила двукратное увеличение смертности у пациентов с СД по сравнению с населением в целом, что свидетельствует о глубокой, но плохо изученной роли метаболизма глюкозы в иммуннойзащите 3. Профилактика, ранняя диагностика и лечение СД, ожирения и других заболеваний требуют оптимизации измерений поглощения глюкозы различными тканями и выявления факторов окружающей среды11, питания12, эндокриннойсистемы 13, генетической14 и эпигенетической15 факторов, влияющих на поглощение глюкозы.
В исследованиях внутриклеточное и/или тканевое поглощение глюкозы обычно измеряется флуоресцентно меченой глюкозой (FD-глюкоза) in vitro 16,17,18 и in vivo19. FD-глюкоза стала предпочтительным методом по сравнению с более точными методами с использованием радиоактивно меченой глюкозы20, аналитического масс-спектроскопического анализа21, метаболомики22, методов ядерного магнитного резонанса23 и позитронно-эмиссионной томографии / компьютерной томографии (ПЭТ / КТ) 5,24. В отличие от поглощения глюкозы FD, аналитические методы, требующие большего количества биологического материала, могут включать многоступенчатую подготовку образцов, дорогостоящие инструменты и сложный анализ данных. Эффективные и недорогие измерения поглощения FD-глюкозы в клеточных культурах использовались в экспериментах по доказательству концепции и могут потребовать подтверждения другими методами.
Основой применения FD-глюкозы для исследований поглощения глюкозы является сниженный метаболизм FD-глюкозы по сравнению с эндогенной глюкозой25. Тем не менее, как эндогенная глюкоза, так и FD-глюкоза динамически распределяются между всеми клеточными компартментами для использования в анаболических, катаболических и сигнальных процессах. Компартментализация и зависящая от времени обработка25 FD-глюкозы вмешиваются в измерения флуоресценции и представляют собой основные ограничивающие факторы для использования этого анализа в высокопроизводительных скрининговых экспериментах, кинетическом анализе, 3D-культуре клеток, ко-культурах и экспериментах с тканевым эксплантом. Здесь мы приводим данные, демонстрирующие высокую корреляцию между внеклеточным истощением FD-глюкозы и ее внутриклеточным поглощением, предполагая внеклеточное истощение FD-глюкозы в качестве суррогатного измерения внутриклеточного поглощения глюкозы. Измерение внеклеточного истощения глюкозы было применено для подтверждения тканеспецифических различий в поглощении глюкозы у мышей, получавших инсулин и экспериментальный препарат18 , чтобы обеспечить доказательство принципа этого метода.
Текущий протокол описывает внутриклеточные и внеклеточные (рисунок 1) измерения поглощения глюкозы FD в клетках 3T3-L1. Разделы протокола 1-7 объясняют культуру и рост клеток в течение 48 ч; клеточное голодание, стимуляция и базовые внеклеточные измерения; и постстимуляционные измерения внеклеточной FD-глюкозы и внутриклеточные измерения FD-глюкозы и белка. Раздел 8 протокола описывает измерение ex vivo внеклеточного поглощения FD-глюкозы в тканях, рассеченных у мышей ob/ob в присутствии и отсутствии инсулина и аминокислотного соединения 2 (AAC2), описанного в другом месте18.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>3T3-L1 mouse fibroblasts</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CL-173</td>
			<td>Cell line</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plates</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353227</td>
			<td>Plastic ware</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B6.V-Lepob/J male mice</td>
			<td>Jackson Laboratory</td>
			<td>stock number 000632</td>
			<td>Mice</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BioTek Synergy H1 modular multimode microplate reader (Fisher Scientific, US)</td>
			<td>Fisher Scientific, US</td>
			<td>&#160;B-SHT</td>
			<td>Device</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum</td>
			<td>Gibco/ThermoFisher</td>
			<td>161790-060</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calf serum</td>
			<td>Gibco/ThermoFisher</td>
			<td>26010-066</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell incubator</td>
			<td>Forma</td>
			<td>Series II Water Jacket</td>
			<td>Device</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diet (mouse/rat diet, irradiated)</td>
			<td>Envigo</td>
			<td>Teklad LM-485</td>
			<td>Diet</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethylsulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Sigma LifeScience</td>
			<td>D2650-100mL</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium</td>
			<td>Gibco/ThermoFisher</td>
			<td>&#160;11965-092</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>E7023-500mL</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent 2-deoxy-2-[(7-nitro-2,1,3-benzoxadiazol-4-yl) amino]-D-glucose)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>72987-1MG</td>
			<td>Assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose-free and phenol red-free DMEM</td>
			<td>Gibco/ThermoFisher</td>
			<td>A14430-01</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human insulin 10 mg/mL</td>
			<td>MilliporeSigma, Cat N 91077C</td>
			<td>Cat N 91077C</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane, 5%</td>
			<td>Henry Schein</td>
			<td>NDC 11695-6776-2</td>
			<td>Anestaetic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/streptomycin (P/S)</td>
			<td>Gibco/ThermoFisher</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>DA537-500 mL</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce bicinchoninic acid (BCA) protein assay</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>Cat N23225</td>
			<td>Assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Radioimmunoprecipitation assay lysis buffer</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-24948</td>
			<td>Assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0.05%)</td>
			<td>Gibco/ThermoFisher</td>
			<td>&#160;25300-054</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

extracellular glucose depletion as an indirect measure of glucose uptake in cells and tissues ex vivo

Продолжающаяся во всем мире эпидемия диабета увеличивает спрос на выявление экологических, пищевых, эндокринных, генетических и эпигенетических факторов, влияющих на поглощение глюкозы. Измерение внутриклеточной флуоресценции является широко используемым методом для проверки поглощения флуоресцентно меченой глюкозы (FD-глюкозы) в клетках in vitro или для визуализации тканей, потребляющих глюкозу in vivo. Этот анализ оценивает поглощение глюкозы в выбранный момент времени. Внутриклеточный анализ предполагает, что метаболизм FD-глюкозы медленнее, чем метаболизм эндогенной глюкозы, которая участвует в катаболических и анаболических реакциях и передаче сигналов. Однако динамический метаболизм глюкозы также изменяет механизмы поглощения, что потребует кинетических измерений поглощения глюкозы в ответ на различные факторы. В данной статье описан метод измерения внеклеточного истощения FD-глюкозы и подтверждена его корреляция с внутриклеточным поглощением FD-глюкозы в клетках и тканях ex vivo. Внеклеточное истощение глюкозы может быть потенциально применимо для высокопроизводительных кинетических и дозозависимых исследований, а также для выявления соединений с гликемической активностью и их тканеспецифическими эффектами.

Внутриклеточное потребление и внеклеточное истощение глюкозы измеряли в преадипоцитах 3T3-L1 в ответ на различные концентрации FD-глюкозы (рисунок 2) с стимуляцией инсулина и без нее. Рисунок 2А демонстрирует дозозависимое увеличение внутриклеточного погл...

Watch this Scientific Journal Video about Extracellular Glucose Depletion as an Indirect Measure of Glucose Uptake in Cells and Tissues Ex Vivo at JoVE.com

Extracellular Glucose Depletion as an Indirect Measure of Glucose Uptake in Cells and Tissues Ex Vivo

Внеклеточное истощение флуоресцентно меченой глюкозы коррелирует с поглощением глюкозы и может быть использовано для высокопроизводительного скрининга поглощения глюкозы в иссеченных органах и клеточных культурах.

Внеклеточное истощение глюкозы как косвенная мера поглощения глюкозы в клетках и тканях Ex Vivo

The ongoing worldwide epidemic of diabetes increases the demand for the identification of environmental, nutritional, endocrine, genetic, and epigenetic ...

Поглощение глюкозы является ключом к пониманию здоровья и болезней. Поскольку глюкоза играет ключевую роль в метаболических и структурных потребностях в организме человека, а также играет жизненно важную роль в регуляции. Внеклеточное измерение глюкозы позволяет разработать высокопроизводительные анализы кинетики поглощения глюкозы в клетках, тканях и органах различного генетического фона в ответ на питательные вещества или лекарства.Этот анализ станет ценным инструментом для открытия терапии и питания при диабете, раке, дегенеративных заболеваниях центральной нервной системы, ожирении и всех заболеваниях глюкозы и обмена веществ. Анализ нуждается в корректировке времени для голодания и стимуляции, которая должна основываться на метаболической специфике для различных тканей и клеточных культур. Культивируют фибробласты мыши 3T3-L1 путем покрытия от 10 до 6 клеток, разбавленных в 20 миллилитрах среды 1 в 296 луночных пластинах.Пластина 100 микролитров клеточной суспензии на лунку, обеспечивающая поддержание однородности этой суспензии путем перемешивания. Выращивайте клетки в течение 48 часов в инкубаторе с температурой 37 градусов Цельсия без изменения среды до слияния примерно до 70-80%. Поддерживайте клетки сливающимися и голодающими, культивируя их в одной среде в течение 48 часов.Варьируйте время инкубации от 24 до 72 часов в зависимости от желаемого катаболического состояния натощак. Декант среды из ячеек в 96 пластинах скважины. Впитайте оставшуюся жидкость стерильными бумажными полотенцами.Промыть 96-луночную пластину 100 микролитрами PBS на лунку и впитать оставшуюся жидкость стерильными бумажными полотенцами. Добавьте 100 микролитров свободного от глюкозы DMEM на лунку и инкубируйте в течение 40 минут. Отрегулируйте время инкубации в зависимости от стимулов типа клеток и желаемого уровня голодания.Используйте восемь реплик для каждого условия моделирования. Поэтому подготовьте один миллилитр для каждого условия моделирования. Используйте семь симуляционных состояний без инсулина.Глюкоза FD 2,5 микрограмма на миллилитр, 1 микрограмм на миллилитр, 0,5 микрограмма на миллилитр, 0,2 микрограмма на миллилитр, 0,1 микрограмма на миллилитр, 0,05 микрограмма на миллилитр и 0 миллиграмм на миллилитр в 196 пластине скважины. Используйте семь состояний стимуляции инсулином. Глюкоза FD составляет 2,5 микрограмма на миллилитр, 1 микрограмм на миллилитр, 0,5 микрограмма на миллилитр, 0,2 микрограмма на миллилитр, 0,1 микрограмма на миллилитр, 0,05 микрограмма на миллилитр и 0 микрограмм на миллилитр в другой 96-луночной пластине.Для подготовки условий стимуляции разводят один микролитр в пять миллиграммов на миллилитр рабочего раствора глюкозы FD и 999 микролитров DMEM без глюкозы для получения одного миллилитра рабочего раствора. Используя этот рабочий раствор, приготовьте от 1 до 2000, от 1 до 5 000, от 1 до 10 000, от 1 до 25 000, от 1 до 50 000 и от 1 до 100 000 бредов глюкозы FD для получения 2,5 микрограмм на миллилитр, 1 микрограмм на миллилитр, 0,5 микрограмма на миллилитр, 0,2 микрограмма на миллилитр, 0,1 микрограмма на миллилитр, 0,05 мкг на миллилитр в двух миллилитрах непосредственно перед экспериментами в шкафу биобезопасности без освещения. Добавьте один микролитр инсулина к каждому из этих состояний.После 40 минут инкубации декантируйте свободный от глюкозы DMEM из каждой лунки в 96 луночных пластинах и поглощайте оставшуюся жидкость стерильными бумажными полотенцами. Добавьте 100 микролитров каждый из различных условий обработки, описанных выше, в скважины вдоль одной колонны. И 100 микролитров от одного и того же условия обработки до колодцев вдоль ряда в обеих 96 стеновых плитах.Маркируйте пластины, которые использовали условия, с инсулином и без него. Добавьте только DMEM без глюкозы в контрольные колодцы. Инкубируют пластину в течение 40 минут в инкубаторе клеточной культуры в темноте.После этого клетки стимулировались в течение 40 минут. Перенесите стимулирующую среду с обеих пластин в новые 96 плит скважины, сохранив ту же экспериментальную компоновку. Промывайте ячейки PBS.Удалите PBS и нанесите оставшийся раствор на стерильные бумажные полотенца. Добавьте ингибитор протеазы в буфер радиоиммунопреципитации для защиты белков. Поместите пластины, содержащие радиоинмунопреципитационный анализ, в шейкер на 30 минут.Используя считыватель микропластин, измерьте флуоресценцию при возбуждении и длинах волн излучения на 485 и 535 нанометрах соответственно. Сначала в среде, содержащей внеклеточную глюкозу ФД, а затем в пластинке с радиоиммунопреципитационным анализом литизируют клетки в конце 30 мин инкубации. Выполните анализ белка BCA в соответствии с инструкциями производителя.Количественно оценить концентрации белка в каждой лунке, содержащей радиоимунопреципитационный анализ литизированных клеток. Используют 10 микролитров радиоиммунопреципитации, анализируют гомогенат, а также измеряют концентрации белка и трижды для повышения точности измерений в 96 пластинах скважин. Количественная оценка белка на основе белковых стандартов, проанализированных вместе с образцами на каждой 96-луночной пластине.Инкубируйте извлеченные ткани или органы в шестилуночной пластине, содержащей PBS, в течение одной минуты. Обработайте каждую ткань или орган в отдельном колодце. Через минуту поместите каждую салфетку на стерильное бумажное полотенце, чтобы впитать PBS.Перенесите ткани или органы в отдельную шестистенную пластину, содержащую 4000 микролитров свободного от глюкозы DMEM, и инкубируйте в течение двух минут. Через две минуты удаляют и переносят ткани в колодцы шестилуночной пластины, содержащей 0,29 миллимоляра FD рабочего раствора глюкозы. Инкубируют шесть луночных пластин, содержащих ткани в рабочем растворе глюкозы FD при температуре 37 градусов Цельсия.Соберите 100 микролитров рабочего раствора глюкозы FD из каждой скважины после 0, 10, 20, 30, 40, 60, 90 и 120 минут инкубации и переведите собранные 100 микролитров рабочего раствора глюкозы FD в 96 пластин лунок для анализа кинетики внеклеточного истощения глюкозы FD. Встряхните до и после сбора. Измерьте флуоресценцию при возбуждении в длинах волн излучения на 485 и 535 нанометрах соответственно с помощью считывателя микропластин.Дозовая зависимость во внутриклеточном поглощении глюкозы ФД была значительно повышена в присутствии инсулина. Стимуляция инсулина привела к значительному снижению внеклеточного уровня глюкозы FD по сравнению с образцами без стимуляции инсулином. Внеклеточное истощение глюкозы FD может измерять изменение поглощения глюкозы с сопоставимой точностью с внутриклеточным поглощением глюкозы FD.Внеклеточная глюкоза FD не истощалась в нестимулированном контрольном висцеральном жире в течение 120 минут инкубации. Напротив, предварительное лечение мышей инсулином или AAC2 перед рассечением приводило к значительному истощению внеклеточной глюкозы FD в течение временного интервала в 30 минут и 60 минут соответственно. Внеклеточная глюкоза FD не была истощена в инсулин-стимулированных эксплантах печени, по сравнению с нестимулированными эксплантами печени.Внеклеточная глюкоза FD была значительно снижена зависящим от времени образом, а экспланты печени, предварительно обработанные AAC2,22%, истощение глюкозы наблюдалось во внеклеточной среде, содержащей необработанный мозг, после 60 минут инкубации. Среда, инкубированная с мозгом мышей, получавших инсулин, показала линейное снижение глюкозы FD на 5%. Стимулируемый AAC2 мозг привел к глубокому быстрому снижению до 67,4% внеклеточной глюкозы FD в течение первых 20 минут.Вещества, связанные с промывкой, особенно важны для удаления следов глюкозы, крови или сыворотки в среде и/ органах, поскольку они могут мешать флуоресцентному чтению этих сред. После высокой пропускной способности идентификация соединений метаболитов в генах с гликемическими свойствами, а также оптимальных условий их действия in vivo эксперименты могут быть подтверждены с помощью меченой глюкозы FD и ПЭТ-сканирования для подтверждения накопления глюкозы в конкретных органах. Этот метод для обнаружения гликемического действия полезен как при удалении многочисленных метаболитов, терапевтических средств или их комбинаций, так и подчеркивает их действия в разных органах.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Extracellular Glucose Depletion as an Indirect Measure of Glucose Uptake in Cells and Tissues Ex Vivo

A Method for Measuring RNA N6-methyladenosine Modifications in Cells and Tissues

A Method for Measuring RNA N6-methyladenosine Modifications in Cells and Tissues

Метод для измерения РНК<em&gt; N</em<sup&gt; 6</sup&gt; -methyladenosine Изменения в клетках и тканях

N6-Methyladenosine (m6A) modifications of RNA are diverse and ubiquitous amongst eukaryotes. They occur in mRNA, rRNA, tRNA, and microRNA. Recent studies ...

Brain Membrane Fractionation: An Ex Vivo Approach to Assess Subsynaptic Protein Localization

Brain Membrane Fractionation: An Ex Vivo Approach to Assess Subsynaptic Protein Localization

Фракционирование мозговых мембран:<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Подход к оценке локализации сусинаптических белков

Assessing the synaptic protein composition and function constitutes an important challenge in neuroscience. However, it is not easy to evaluate ...

Dissipative Microgravimetry to Study the Binding Dynamics of the Phospholipid Binding Protein Annexin A2 to Solid-supported Lipid Bilayers Using a Quartz Resonator

Диссипативных Microgravimetry для изучения динамики привязки фосфолипидного связывая протеин Annexin A2 в твердой поддержке липидов бислоев с помощью кварцевого резонатора

The dissipative quartz crystal microbalance technique is a simple and label-free approach to measure simultaneously the mass uptake and viscoelastic ...

Analysis of Endocytic Uptake and Retrograde Transport to the Trans-Golgi Network Using Functionalized Nanobodies in Cultured Cells

Анализ Endocytic поглощения и ретроградным транспорта Trans Гольджи сеть с помощью функционализированных Nanobodies в культивируемых клеток

Transport of proteins and membranes from the cell surface to the Golgi and beyond is essential for homeostasis, organelle identity and physiology. To ...

Atomic Absorbance Spectroscopy to Measure Intracellular Zinc Pools in Mammalian Cells

Атомная спектроскопия поглощения для измерения внутриклеточного цинка бассейны в клетках млекопитающих

Transition metals are essential micronutrients for organisms but can be toxic to cells at high concentrations by competing with physiological metals in ...

Quantification of Coenzyme A in Cells and Tissues

Количественная оценка коэнзима А в клетках и тканях

Emerging research has revealed that the cellular coenzyme A (CoA) supply can become limiting with a detrimental impact on growth, metabolism and survival. ...

An Integrated Raman Spectroscopy and Mass Spectrometry Platform to Study Single-Cell Drug Uptake, Metabolism, and Effects

Интегрированная Рамана спектроскопия и массовая спектрометрия Платформа для изучения одноклеточного потребления наркотиков, метаболизма и эффектов

Cells are known to be inherently heterogeneous in their responses to drugs. Therefore, it is essential that single-cell heterogeneity is accounted for in ...

Using an Extracellular Flux Analyzer to Measure Changes in Glycolysis and Oxidative Phosphorylation during Mouse Sperm Capacitation

Использование внеклеточного анализатора flux для измерения изменений в гликолизе и окислительной фосфорилации во время емки спермы мыши

Mammalian sperm acquire fertilization capacity in the female reproductive tract in a process known as capacitation. Capacitation-associated processes ...

Ex Vivo Hepatic Perfusion Through the Portal Vein in Mouse

Ex Vivo Hepatic Perfusion Through the Portal Vein in Mouse

Ex Vivo Перфузия печени через воротную вену у мыши

Metabolic diseases such as diabetes, pre-diabetes, non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD), and nonalcoholic steatohepatitis (NASH) are becoming ...

Stable Isotope Tracing & LC-MS Analysis to Measure DHODH and SDH Activities

Oxygen-Independent Assays to Measure Mitochondrial Function in Mammals

Oxygen-Independent Assays to Measure Mitochondrial Function in Mammals (Video) | JoVE 

Кислородно-независимые анализы для измерения функции митохондрий у млекопитающих

The flow of electrons in the mitochondrial electron transport chain (ETC) supports multifaceted biosynthetic, bioenergetic, and signaling functions in ...