Name: extracellular glucose depletion as an indirect measure of glucose uptake in cells and tissues ex vivo
Uploaded: 2022-04-06T14:20:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Extracellular Glucose Depletion as an Indirect Measure of Glucose Uptake in Cells and Tissues Ex Vivo at JoVE.com

El proyecto fue apoyado por Ralph y Marian Falk Medical Research Catalyst Award y Kathleen Kelly Award. Otros apoyos incluyeron el Centro Nacional de Recursos de Investigación UL1RR025755 y NCI P30CA16058 (OSUCCC), la Hoja de ruta de los NIH para la investigación médica. El contenido es responsabilidad exclusiva de los autores y no representa los puntos de vista oficiales del Centro Nacional de Recursos de Investigación o los NIH.

Los estudios en animales fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad Estatal de Ohio (OSU, protocolo 2007A0262-R4).
NOTA: Todos los procedimientos deben realizarse en un gabinete de bioseguridad de clase II con el soplador encendido y las luces apagadas.
1. Preparación de materiales
NOTA: Todos los materiales se enumeran en la Tabla de materiales.
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	<li>Kyrtata, N., Emsley, H. C. A., Sparasci, O., Parkes, L. M., Dickie, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+systematic+review+of+glucose+transport+alterations+in+Alzheimer's+disease.">A systematic review of glucose transport alterations in Alzheimer's disease.</a> Frontiers in Neuroscience. 15, 568 (2021).</li><li>Garcia-Carbonell, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Critical+role+of+glucose+metabolism+in+rheumatoid+arthritis+fibroblast-like+synoviocytes.">Critical role of glucose metabolism in rheumatoid arthritis fibroblast-like synoviocytes.</a> Arthritis Rheumatology. 68 (7), 1614-1626 (2016).</li><li>Kumar, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Is+diabetes+mellitus+associated+with+mortality+and+severity+of+COVID-19?+A+meta-analysis.">Is diabetes mellitus associated with mortality and severity of COVID-19? A meta-analysis.</a> Diabetes &amp; Metabolic Syndrome: Clinical Research &amp; Review. 14 (4), 535-545 (2020).</li><li>Lee, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Different+prognostic+impact+of+glucose+uptake+in+visceral+adipose+tissue+according+to+sex+in+patients+with+colorectal+cancer.">Different prognostic impact of glucose uptake in visceral adipose tissue according to sex in patients with colorectal cancer.</a> Scientific Reports. 11 (1), 21556 (2021).</li><li>Miner, M. W. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of:+(2S,4R)-4-[(18)F]Fluoroglutamine,+[(11)C]Methionine,+and+2-Deoxy-2-[(18)F]Fluoro-D-Glucose+and+two+small-animal+PET/CT+systems+imaging+rat+gliomas.">Comparison of: (2S,4R)-4-[(18)F]Fluoroglutamine, [(11)C]Methionine, and 2-Deoxy-2-[(18)F]Fluoro-D-Glucose and two small-animal PET/CT systems imaging rat gliomas.</a> Frontiers in Oncology. 11 (18), 730358 (2021).</li><li>Gumbiner, B., Thorburn, A. W., Ditzler, T. M., Bulacan, F., Henry, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+impaired+intracellular+glucose+metabolism+in+the+insulin+resistance+of+aging.">Role of impaired intracellular glucose metabolism in the insulin resistance of aging.</a> Metabolism. 41 (10), 1115-1121 (1992).</li><li>Ebrahimi, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beta+cell+identity+changes+with+mild+hyperglycemia:+Implications+for+function,+growth,+and+vulnerability.">Beta cell identity changes with mild hyperglycemia: Implications for function, growth, and vulnerability.</a> Molecular Metabolism. 35, 100959 (2020).</li><li>Ruberto, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=KLF10+integrates+circadian+timing+and+sugar+signaling+to+coordinate+hepatic+metabolism.">KLF10 integrates circadian timing and sugar signaling to coordinate hepatic metabolism.</a> Elife. 10, 65574 (2021).</li><li>Stocks, B., Zierath, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Post-translational+modifications:+The+signals+at+the+intersection+of+exercise,+glucose+uptake,+and+insulin+sensitivity.">Post-translational modifications: The signals at the intersection of exercise, glucose uptake, and insulin sensitivity.</a> Endocrinology Reviews. , (2021).</li><li>World Health Organization. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+report+on+diabetes.">Global report on diabetes.</a> World Health Organization. , (2016).</li><li>Kolb, H., Martin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Environmental/lifestyle+factors+in+the+pathogenesis+and+prevention+of+type+2+diabetes.">Environmental/lifestyle factors in the pathogenesis and prevention of type 2 diabetes.</a> BMC Medicine. 15 (1), 131 (2017).</li><li>Galicia-Garcia, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathophysiology+of+type+2+diabetes+mellitus.">Pathophysiology of type 2 diabetes mellitus.</a> International Journal of Molecular Science. 21 (17), 6275 (2020).</li><li>Petrov, M. S., Basina, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DIAGNOSIS+OF+ENDOCRINE+DISEASE:+Diagnosing+and+classifying+diabetes+in+diseases+of+the+exocrine+pancreas.">DIAGNOSIS OF ENDOCRINE DISEASE: Diagnosing and classifying diabetes in diseases of the exocrine pancreas.</a> European Journal of Endocrinology. 184 (4), 151-163 (2021).</li><li>Sirdah, M. M., Reading, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+predisposition+in+type+2+diabetes:+A+promising+approach+toward+a+personalized+management+of+diabetes.">Genetic predisposition in type 2 diabetes: A promising approach toward a personalized management of diabetes.</a> Clinical Genetics. 98 (6), 525-547 (2020).</li><li>Ramos-Lopez, O., Milagro, F. I., Riezu-Boj, J. I., Martinez, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetic+signatures+underlying+inflammation:+an+interplay+of+nutrition,+physical+activity,+metabolic+diseases,+and+environmental+factors+for+personalized+nutrition.">Epigenetic signatures underlying inflammation: an interplay of nutrition, physical activity, metabolic diseases, and environmental factors for personalized nutrition.</a> Inflammation Research. 70 (1), 29-49 (2021).</li><li>Yamamoto, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+glucose+uptake+in+cultured+cells.">Measurement of glucose uptake in cultured cells.</a> Current Protocols in Pharmacology. 71 (1), 12-14 (2015).</li><li>Yang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+sensitive+and+simple+HPLC-FLD-based+method+for+the+measurement+of+intracellular+glucose+uptake.">A sensitive and simple HPLC-FLD-based method for the measurement of intracellular glucose uptake.</a> Food Chemistry. 372, 131218 (2021).</li><li>Lee, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amino+acid-based+compound+activates+atypical+PKC+and+leptin+receptor+pathways+to+improve+glycemia+and+anxiety+like+behavior+in+diabetic+mice.">Amino acid-based compound activates atypical PKC and leptin receptor pathways to improve glycemia and anxiety like behavior in diabetic mice.</a> Biomaterials. 239, 119839 (2020).</li><li>Shukla, S. K., Mulder, S. E., Singh, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypoxia-mediated+in+vivo+tumor+glucose+uptake+measurement+and+analysis.">Hypoxia-mediated in vivo tumor glucose uptake measurement and analysis.</a> Methods in Molecular Biology. 1742, 107-113 (2018).</li><li>Jakson, I., Ujvari, D., Brusell Gidlof, S., Linden Hirschberg, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insulin+regulation+of+solute+carrier+family+2+member+1+(glucose+transporter+1)+expression+and+glucose+uptake+in+decidualizing+human+endometrial+stromal+cells:+an+in+vitro+study.">Insulin regulation of solute carrier family 2 member 1 (glucose transporter 1) expression and glucose uptake in decidualizing human endometrial stromal cells: an in vitro study.</a> Reproductive Biology and Endocrinology. 18 (1), 117 (2020).</li><li>Saparbaev, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+quantification+of+any+isoforms+of+carbohydrates+by+2D+UV-MS+fingerprinting+of+cold+ions.">Identification and quantification of any isoforms of carbohydrates by 2D UV-MS fingerprinting of cold ions.</a> Analytical Chemistry. 92 (21), 14624-14632 (2020).</li><li>Schulz, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+metabolomics+of+pellicle+and+saliva+in+children+with+different+caries+activity.">Targeted metabolomics of pellicle and saliva in children with different caries activity.</a> Scientific Reports. 10 (1), 697 (2020).</li><li>Shulman, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+magnetic+resonance+studies+of+glucose+metabolism+in+non-insulin-dependent+diabetes+mellitus+subjects.">Nuclear magnetic resonance studies of glucose metabolism in non-insulin-dependent diabetes mellitus subjects.</a> Molecular Medicine. 2 (5), 533-540 (1996).</li><li>Cochran, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+PET+imaging+with+[(18)F]FDG+to+explain+improved+glucose+uptake+in+an+apolipoprotein+A-I+treated+mouse+model+of+diabetes.">In vivo PET imaging with [(18)F]FDG to explain improved glucose uptake in an apolipoprotein A-I treated mouse model of diabetes.</a> Diabetologia. 59 (18), 1977-1984 (2016).</li><li>Lloyd, P. G., Hardin, C. D., Sturek, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Examining+glucose+transport+in+single+vascular+smooth+muscle+cells+with+a+fluorescent+glucose+analog.">Examining glucose transport in single vascular smooth muscle cells with a fluorescent glucose analog.</a> Physiological Research. 48 (6), 401-410 (1999).</li><li>Beeton, C., Garcia, A., Chandy, K. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drawing+blood+from+rats+through+the+saphenous+vein+and+by+cardiac+puncture.">Drawing blood from rats through the saphenous vein and by cardiac puncture.</a> Journal of Visualized Experiments. (7), e266 (2007).</li><li>DiSilvestro, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leptin+production+by+encapsulated+adipocytes+increases+brown+fat,+decreases+resistin,+and+improves+glucose+intolerance+in+obese+mice.">Leptin production by encapsulated adipocytes increases brown fat, decreases resistin, and improves glucose intolerance in obese mice.</a> PLoS One. 11 (4), 0153198 (2016).</li><li>Friedman, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leptin+and+the+endocrine+control+of+energy+balance.">Leptin and the endocrine control of energy balance.</a> Nature Metabolism. 1 (8), 754-764 (2019).</li><li>Guillam, M. T., Burcelin, R., Thorens, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Normal+hepatic+glucose+production+in+the+absence+of+GLUT2+reveals+an+alternative+pathway+for+glucose+release+from+hepatocytes.">Normal hepatic glucose production in the absence of GLUT2 reveals an alternative pathway for glucose release from hepatocytes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 95 (21), 12317-12321 (1998).</li><li>Guillam, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+diabetes+and+abnormal+postnatal+pancreatic+islet+development+in+mice+lacking+Glut-2.">Early diabetes and abnormal postnatal pancreatic islet development in mice lacking Glut-2.</a> Nature Genetics. 17 (3), 327-330 (1997).</li><li>Barros, L. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetic+validation+of+6-NBDG+as+a+probe+for+the+glucose+transporter+GLUT1+in+astrocytes.">Kinetic validation of 6-NBDG as a probe for the glucose transporter GLUT1 in astrocytes.</a> Journal of Neurochemistry. 109, 94-100 (2009).</li><li>Sprinz, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+blood+glucose+level+on+18F-FDG+uptake+for+PET/CT+in+normal+organs:+A+systematic+review.">Effects of blood glucose level on 18F-FDG uptake for PET/CT in normal organs: A systematic review.</a> PLoS One. 13 (2), 0193140 (2018).</li><li>Johnson, T. V., Martin, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+characterization+of+an+adult+retinal+explant+organotypic+tissue+culture+system+as+an+in+vitro+intraocular+stem+cell+transplantation+model.">Development and characterization of an adult retinal explant organotypic tissue culture system as an in vitro intraocular stem cell transplantation model.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 49 (8), 3503-3512 (2008).</li><li>de Urquiza, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Docosahexaenoic+acid,+a+ligand+for+the+retinoid+X+receptor+in+mouse+brain.">Docosahexaenoic acid, a ligand for the retinoid X receptor in mouse brain.</a> Science. 290 (5499), 2140-2144 (2000).</li><li>Olson, A. L., Pessin, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure,+function,+and+regulation+of+the+mammalian+facilitative+glucose+transporter+gene+family.">Structure, function, and regulation of the mammalian facilitative glucose transporter gene family.</a> Annual Review of Nutrition. 16 (1), 235-256 (1996).</li><li>Muhanna, D., Arnipalli, S. R., Kumar, S. B., Ziouzenkova, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osmotic+adaptation+by+Na(+)-dependent+transporters+and+ACE2:+correlation+with+hemostatic+crisis+in+COVID-19.">Osmotic adaptation by Na(+)-dependent transporters and ACE2: correlation with hemostatic crisis in COVID-19.</a> Biomedicines. 8 (11), 460 (2020).</li><li>Ligasova, A., Koberna, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+dyes-highly+sensitive+reporters+of+cell+quantification:+comparison+with+other+cell+quantification+methods.">DNA dyes-highly sensitive reporters of cell quantification: comparison with other cell quantification methods.</a> Molecules. 26 (18), 5515 (2021).</li><li>DeFronzo, R. A., Tobin, J. D., Andres, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glucose+clamp+technique:+a+method+for+quantifying+insulin+secretion+and+resistance.">Glucose clamp technique: a method for quantifying insulin secretion and resistance.</a> American Journal of Physiology. 237 (3), 214-223 (1979).</li></ol>

La comparación directa del agotamiento extracelular de la glucosa FD con la absorción normalizada de glucosa intracelular en el cultivo celular mostró una alta correlación, lo que sugiere que el agotamiento extracelular de la glucosa podría ser una medida sustituta para la evaluación de la absorción de glucosa. La medición de la glucosa FD extracelular puede utilizar una amplia gama de concentraciones de glucosa FD, también 0.5-2.5 μg FD-glucosa / ml parecen proporcionar el rango óptimo. La FD-glucosa extracel...

La demanda para medir la absorción de glucosa aumenta junto con la necesidad crítica de abordar un aumento epidémico en una multitud de enfermedades dependientes del metabolismo de la glucosa. Los mecanismos subyacentes de las enfermedades metabólicas degenerativas, los trastornos neurológicos y cognitivos1, las enfermedades inflamatorias2 e infecciosas3, el cáncer 4,5, así como el envejecimiento6, dependen del metabolismo de la glucosa para obtener energía y su almacenamiento, los procesos anabólicos, la modificación de proteínas y genes, la señalización, la regulación de genes y la síntesis y replicación de ácidos nucleicos 7,8,9 . La diabetes mellitus (DM) está directamente relacionada con el mal funcionamiento de la regulación de la absorción de glucosa. La DM es un espectro de enfermedades crónicas como la diabetes mellitus tipo 1, -2 y -3, la diabetes gestacional, la diabetes de inicio en la madurez de los jóvenes y otros tipos de esta enfermedad inducida por factores ambientales y / o genéticos. En 2016, el primer informe mundial de la OMS sobre la diabetes demostró que el número de adultos que viven con la DM más extendida casi se ha cuadruplicado desde 1980 a 422 millones de adultos10, y este número de pacientes con DM ha aumentado exponencialmente durante las últimas décadas. Solo en 2019, una estimación de 1,5 millones de muertes fue causada directamente por DM10. Este aumento dramático se debe al aumento de la DM tipo 2 y las condiciones que la impulsan, incluido el sobrepeso y la obesidad10. La pandemia de COVID-19 reveló un aumento de dos veces en la mortalidad en pacientes con DM en comparación con la población general, lo que sugiere el papel profundo pero poco conocido del metabolismo de la glucosa en la defensa inmune3. La prevención, el diagnóstico temprano y el tratamiento de la DM, la obesidad y otras enfermedades requieren la optimización de las mediciones de la absorción de glucosa por diferentes tejidos y la identificación de los factores ambientales11,nutricionales 12, endocrinos 13,genéticos 14 y epigenéticos15 que afectan la absorción de glucosa.
En la investigación, la absorción intracelular y/o tisular de glucosa se mide comúnmente mediante glucosa marcada fluorescentemente (FD-glucosa) in vitro 16,17,18 e in vivo19. La glucosa FD se convirtió en un método preferido en comparación con los métodos más precisos que utilizan glucosa20 marcada radiactivamente, análisis analítico de espectroscopiade masas 21, metabolómica22, métodos de resonancia magnética nuclear23 y tomografía por emisión de positrones/tomografía computarizada (PET/CT)5,24. A diferencia de la absorción de glucosa FD, los métodos analíticos que requieren más material biológico pueden implicar una preparación de muestras de varios pasos, instrumentos costosos y análisis de datos complejos. Las mediciones efectivas y económicas de la absorción de glucosa FD en cultivos celulares se han utilizado en experimentos de prueba de concepto y pueden requerir la validación por otros métodos.
La base de la aplicación de DF-glucosa para los estudios de captación de glucosa es la reducción del metabolismo de la glucosa-DF en comparación con la glucosa endógena25. Sin embargo, tanto la glucosa endógena como la glucosa FD se distribuyen dinámicamente entre todos los compartimentos celulares para su uso en procesos anabólicos, catabólicos y de señalización. La compartimentación y el procesamiento dependiente del tiempo25 de la glucosa FD interfieren con las mediciones de fluorescencia y representan los principales factores limitantes para el uso de este ensayo en experimentos de detección de alto rendimiento, análisis cinético, cultivo celular 3D, cocultivos y experimentos de explante de tejidos. Aquí, proporcionamos datos que demuestran una alta correlación entre el agotamiento extracelular de la glucosa FD y su absorción intracelular, lo que sugiere el agotamiento extracelular de la glucosa FD como una medida sustituta para la absorción de glucosa intracelular. La medición del agotamiento extracelular de la glucosa se aplicó para validar las diferencias específicas del tejido en la absorción de glucosa en ratones tratados con insulina y un fármaco experimental18 para proporcionar una prueba de principio de este método.
El protocolo actual describe mediciones intracelulares y extracelulares (Figura 1) de la absorción de glucosa FD en células 3T3-L1. Las secciones 1-7 del protocolo explican el cultivo y el crecimiento de las células durante 48 h; inanición celular, estimulación y mediciones extracelulares basales; y mediciones posteriores a la estimulación de la FD-glucosa extracelular y mediciones intracelulares de la FD-glucosa y la proteína. La sección 8 del protocolo describe la medición ex vivo de la captación extracelular de FD-glucosa en tejidos diseccionados de ratones ob/ob en presencia y ausencia de insulina y compuesto de aminoácidos 2 (AAC2) descrita en otra parte18.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>3T3-L1 mouse fibroblasts</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CL-173</td>
			<td>Cell line</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plates</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353227</td>
			<td>Plastic ware</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B6.V-Lepob/J male mice</td>
			<td>Jackson Laboratory</td>
			<td>stock number 000632</td>
			<td>Mice</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BioTek Synergy H1 modular multimode microplate reader (Fisher Scientific, US)</td>
			<td>Fisher Scientific, US</td>
			<td>&#160;B-SHT</td>
			<td>Device</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum</td>
			<td>Gibco/ThermoFisher</td>
			<td>161790-060</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calf serum</td>
			<td>Gibco/ThermoFisher</td>
			<td>26010-066</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell incubator</td>
			<td>Forma</td>
			<td>Series II Water Jacket</td>
			<td>Device</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diet (mouse/rat diet, irradiated)</td>
			<td>Envigo</td>
			<td>Teklad LM-485</td>
			<td>Diet</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethylsulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Sigma LifeScience</td>
			<td>D2650-100mL</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium</td>
			<td>Gibco/ThermoFisher</td>
			<td>&#160;11965-092</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>E7023-500mL</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent 2-deoxy-2-[(7-nitro-2,1,3-benzoxadiazol-4-yl) amino]-D-glucose)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>72987-1MG</td>
			<td>Assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose-free and phenol red-free DMEM</td>
			<td>Gibco/ThermoFisher</td>
			<td>A14430-01</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human insulin 10 mg/mL</td>
			<td>MilliporeSigma, Cat N 91077C</td>
			<td>Cat N 91077C</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane, 5%</td>
			<td>Henry Schein</td>
			<td>NDC 11695-6776-2</td>
			<td>Anestaetic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/streptomycin (P/S)</td>
			<td>Gibco/ThermoFisher</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>DA537-500 mL</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce bicinchoninic acid (BCA) protein assay</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>Cat N23225</td>
			<td>Assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Radioimmunoprecipitation assay lysis buffer</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-24948</td>
			<td>Assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0.05%)</td>
			<td>Gibco/ThermoFisher</td>
			<td>&#160;25300-054</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

extracellular glucose depletion as an indirect measure of glucose uptake in cells and tissues ex vivo

La epidemia mundial de diabetes en curso aumenta la demanda de identificación de factores ambientales, nutricionales, endocrinos, genéticos y epigenéticos que afectan la absorción de glucosa. La medición de la fluorescencia intracelular es un método ampliamente utilizado para probar la absorción de glucosa marcada fluorescentemente (FD-glucosa) en células in vitro, o para obtener imágenes de tejidos que consumen glucosa in vivo. Este ensayo evalúa la absorción de glucosa en un punto de tiempo elegido. El análisis intracelular asume que el metabolismo de la glucosa DF es más lento que el de la glucosa endógena, que participa en las reacciones catabólicas y anabólicas y en la señalización. Sin embargo, el metabolismo dinámico de la glucosa también altera los mecanismos de absorción, lo que requeriría mediciones cinéticas de la absorción de glucosa en respuesta a diferentes factores. Este artículo describe un método para medir el agotamiento extracelular de la DF-glucosa y valida su correlación con la absorción intracelular de FD-glucosa en células y tejidos ex vivo. El agotamiento extracelular de la glucosa puede ser potencialmente aplicable para estudios cinéticos y dependientes de la dosis de alto rendimiento, así como para identificar compuestos con actividad glucémica y sus efectos específicos del tejido.

La ingesta intracelular y el agotamiento extracelular de glucosa se midieron en preadipocitos 3T3-L1, en respuesta a diferentes concentraciones de DF-glucosa (Figura 2) con y sin estimulación con insulina. La Figura 2A demuestra un aumento dependiente de la dosis en la absorción intracelular de FD-glucosa, que aumentó significativamente en presencia de insulina. La disminución concomitante de la glucosa FD extracelular en las mismas células se muestra en la...

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Extracellular Glucose Depletion as an Indirect Measure of Glucose Uptake in Cells and Tissues Ex Vivo

El agotamiento extracelular de la glucosa marcada fluorescentemente se correlaciona con la absorción de glucosa y podría usarse para la detección de alto rendimiento de la absorción de glucosa en órganos extirpados y cultivos celulares.

El agotamiento extracelular de glucosa como medida indirecta de la absorción de glucosa en células y tejidos ex vivo

The ongoing worldwide epidemic of diabetes increases the demand for the identification of environmental, nutritional, endocrine, genetic, and epigenetic ...

La absorción de glucosa es la clave para comprender la salud y la enfermedad. Como la glucosa juega un papel fundamental en las demandas metabólicas y estructurales en el cuerpo humano, además de desempeñar un papel vital en la regulación. La medición extracelular de la glucosa permite el desarrollo de ensayos de alto rendimiento para la cinética de la absorción de glucosa en células, tejidos y órganos de diferentes antecedentes genéticos en respuesta a nutrientes o fármacos.Este ensayo sería una herramienta valiosa para el descubrimiento de terapias y nutrición para la diabetes, el cáncer, las enfermedades degenerativas del sistema nervioso central, la obesidad y todas las enfermedades de la glucosa y el metabolismo. El ensayo necesita un ajuste de tiempo para la inanición y la estimulación que debe basarse en especificaciones metabólicas para diferentes tejidos y cultivos celulares. Cultivo de fibroblastos de ratón 3T3-L1 mediante recubrimiento de 10 a las 6 células, diluido en 20 mililitros de medio 1 en placas de 296 pocillos.Placa de 100 microlitros de suspensión celular por pozo, asegurando mantener la homogeneidad de esta suspensión mediante la mezcla. Cultive células durante 48 horas en una incubadora de 37 grados centígrados sin cambiar de medio hasta aproximadamente 70 a 80% de confluencia. Mantener las células confluentes y en ayunas cultivándolas en el mismo medio durante 48 horas.Varíe el tiempo de incubación de 24 a 72 horas, dependiendo del estado catabólico de ayuno deseado. Decantar los medios de las células en las placas de 96 pocillos. Absorba el líquido restante con toallas de papel estériles.Enjuague la placa de 96 pocillos con 100 microlitros de PBS por pocillo y absorba el líquido restante con toallas de papel estériles. Agregue 100 microlitros de DMEM libre de glucosa por pocillo e incube durante 40 minutos. Ajuste el tiempo de incubación dependiendo de los estímulos del tipo celular y el nivel deseado de ayuno.Utilice ocho réplicas para cada condición de simulación. Por lo tanto, prepare un mililitro para cada condición de simulación. Utilice siete condiciones de simulación sin insulina.Glucosa FD de 2.5 microgramos por mililitro, 1 microgramo por mililitro, 0.5 microgramos por mililitro, 0.2 microgramos por mililitro, 0.1 microgramos por mililitro, 0.05 microgramos por mililitro y 0 miligramos por mililitro en placa de 196 pocillos. Use siete condiciones de estimulación con insulina. FD glucosa de 2.5 microgramos por mililitro, 1 microgramo por mililitro, 0.5 microgramos por mililitro, 0.2 microgramos por mililitro, 0.1 microgramos por mililitro, 0.05 microgramos por mililitro y 0 microgramos por mililitro en otra placa de 96 pocillos.Para preparar las condiciones de estimulación, diluya un microlitro de cinco miligramos por mililitro de solución de trabajo de glucosa FD y 999 microlitros de DMEM libre de glucosa para obtener un mililitro de solución de material de trabajo. Usando esta solución de material de trabajo, prepare de 1 a 2000, 1 a 5, 000, 1 a 10, 000, 1 a 25, 000, 1 a 50, 000 y 1 a 100, 000 delirios de glucosa FD para obtener 2.5 microgramos por mililitro, 1 microgramo por mililitro, 0.5 microgramos por mililitro, 0.2 microgramos por mililitro, 0.1 microgramos por mililitro, 0,05 microgramos por mililitro en tubos de dos mililitros inmediatamente antes de los experimentos en un gabinete de bioseguridad sin luces. Agregue un microlitro de insulina a cada una de estas condiciones.Después de 40 minutos de incubación, decantar el DMEM libre de glucosa de cada pocillo en placas de 96 pocillos y absorber el líquido restante con toallas de papel estériles. Agregue 100 microlitros cada uno de las diversas condiciones de tratamiento descritas anteriormente, a los pozos a lo largo de una columna. Y 100 microlitros de la misma condición de tratamiento a los pozos a lo largo de la fila en ambas placas de pared 96.Etiquete las placas que utilizaron las condiciones, con y sin insulina. Agregue DMEM libre de glucosa solo a los pocillos de control. Incubar la placa durante 40 minutos en la incubadora de cultivo celular en la oscuridad.Después de que las células hayan sido estimuladas durante 40 minutos. Transfiera los medios de estimulación de ambas placas a nuevas placas de 96 pocillos, manteniendo el mismo diseño experimental. Lave las celdas con PBS.Retire PBS y decantar cualquier solución restante en toallas de papel estériles. Agregue un inhibidor de la proteasa al tampón del ensayo de inmunoprecipitación de radio para proteger las proteínas. Coloque las placas que contienen el ensayo de inmunoprecipitación de radio en un agitador durante 30 minutos.Usando un lector de microplacas, mida la fluorescencia en longitudes de onda de excitación y emisión a 485 y 535 nanómetros respectivamente. Primero en el medio que contiene glucosa FD extracelular, y luego en la placa con células lizadas de ensayo de radioinmunoprecipitación al final de 30 minutos de incubación. Realice el ensayo de proteína BCA de acuerdo con las instrucciones del fabricante.Cuantificar las concentraciones de proteínas en cada pocillo que contiene células de ensayo de radioinmunoprecipitación. Use 10 microlitros del homogeneizado del ensayo de inmunoprecipitación de radio, y mida las concentraciones de proteínas, y triplique para aumentar la precisión de las mediciones en placas de 96 pocillos. Cuantificar la proteína basada en estándares de proteínas analizados junto con muestras en cada placa de 96 pocillos.Incubar los tejidos u órganos cosechados en una placa de seis pocillos que contenga PBS durante un minuto. Maneje cada tejido u órgano en un pocillo separado. Después de un minuto, coloque cada pañuelo de papel en una toalla de papel estéril para absorber PBS.Transfiera tejidos u órganos en una placa separada de seis paredes que contenga 4, 000 microlitros de DMEM libre de glucosa e incube durante dos minutos. Después de dos minutos, retire y transfiera los tejidos a los pocillos de una placa de seis pocillos que contenga 0,29 milimolar de solución de trabajo de glucosa FD. Incubar las seis placas de pocillos que contienen tejidos en solución de trabajo de glucosa FD a 37 grados centígrados.Recolectar 100 microlitros de solución de trabajo de glucosa FD de cada pocillo después de 0, 10, 20, 30, 40, 60, 90 y 120 minutos de incubación, y transferir 100 microlitros recolectados de solución de trabajo de glucosa FD en placas de 96 pocillos para analizar la cinética del agotamiento extracelular de glucosa FD. Agitar antes y después de la recolección. Mida la fluorescencia en excitación en longitudes de onda de emisión a 485 y 535 nanómetros respectivamente utilizando un lector de microplacas.La dependencia de la dosis en la captación intracelular de glucosa FD aumentó significativamente en presencia de insulina. La estimulación con insulina condujo a una disminución significativa de los niveles de glucosa FD extracelular en comparación con las muestras sin estimulación con insulina. El agotamiento extracelular de la glucosa FD puede medir un cambio en la captación de glucosa con una precisión comparable a la captación intracelular de glucosa FD.La FD glucosa extracelular no se agotó en la grasa visceral de control no estimulada durante 120 minutos de incubación. En contraste, el pretratamiento de ratones con insulina o AAC2 antes de la disección, condujo a un agotamiento significativo de la glucosa FD extracelular dentro de un intervalo de tiempo de 30 minutos y 60 minutos, respectivamente. La glucosa FD extracelular no se agotó en los explantes hepáticos estimulados con insulina, en comparación con los explantes hepáticos no estimulados.La glucosa FD extracelular disminuyó significativamente de la manera dependiente del tiempo, y se observaron explantes hepáticos pretratados con AAC2.22% de agotamiento de glucosa en el medio extracelular que contenía el cerebro no tratado después de 60 minutos de incubación. El medio incubado con cerebros de ratones tratados con insulina ha mostrado una disminución lineal del 5% en la glucosa FD. Los cerebros estimulados por AAC2 condujeron a una profunda disminución rápida al 67,4% de la glucosa FD extracelular durante los primeros 20 minutos.Las sustancias que implican lavado son especialmente importantes para eliminar restos de glucosa, sangre o suero dentro del medio y/o órganos, ya que pueden interferir con la lectura de fluorescencia de estos medios. Después de un alto rendimiento, la identificación de compuestos de metabolitos en genes con propiedades glucémicas, así como las condiciones óptimas para su acción en experimentos in vivo, se pudo validar con glucosa FD marcada y escaneo PET para confirmar la acumulación de glucosa en órganos específicos. Esta técnica para el descubrimiento de la acción glucémica es beneficiosa en la eliminación de numerosos metabolitos, terapias o sus combinaciones, y destaca sus acciones en diferentes órganos.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Extracellular Glucose Depletion as an Indirect Measure of Glucose Uptake in Cells and Tissues Ex Vivo

A Method for Measuring RNA N6-methyladenosine Modifications in Cells and Tissues

A Method for Measuring RNA N6-methyladenosine Modifications in Cells and Tissues

Un método para medir el ARN<em&gt; N</em<sup&gt; 6</sup&gt; -methyladenosine Modificaciones en células y tejidos

N6-Methyladenosine (m6A) modifications of RNA are diverse and ubiquitous amongst eukaryotes. They occur in mRNA, rRNA, tRNA, and microRNA. Recent studies ...

Investigación

Bioquímica

Brain Membrane Fractionation: An Ex Vivo Approach to Assess Subsynaptic Protein Localization

Brain Membrane Fractionation: An Ex Vivo Approach to Assess Subsynaptic Protein Localization

Fraccionamiento de Membranas Cerebrales: Un<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Enfoque para evaluar la localización de proteínas subsinápticas

Assessing the synaptic protein composition and function constitutes an important challenge in neuroscience. However, it is not easy to evaluate ...

Dissipative Microgravimetry to Study the Binding Dynamics of the Phospholipid Binding Protein Annexin A2 to Solid-supported Lipid Bilayers Using a Quartz Resonator

Microgravimetry disipativo para estudiar la dinámica de unión de la fosfolípido vinculante proteínas anexina A2 a bicapas de lípidos respaldados por el sólido utilizando un resonador de cuarzo

The dissipative quartz crystal microbalance technique is a simple and label-free approach to measure simultaneously the mass uptake and viscoelastic ...

Analysis of Endocytic Uptake and Retrograde Transport to the Trans-Golgi Network Using Functionalized Nanobodies in Cultured Cells

Análisis de absorción endocíticas y transporte retrógrado a la red Trans-Golgi en células cultivadas de Nanobodies funcionalizados

Transport of proteins and membranes from the cell surface to the Golgi and beyond is essential for homeostasis, organelle identity and physiology. To ...

Atomic Absorbance Spectroscopy to Measure Intracellular Zinc Pools in Mammalian Cells

Espectroscopía de absorbancia atómica para medir las agrupaciones intracelulares de zinc en células de mamífero

Transition metals are essential micronutrients for organisms but can be toxic to cells at high concentrations by competing with physiological metals in ...

Quantification of Coenzyme A in Cells and Tissues

Cuantificación de la coenzima A en células y tejidos

Emerging research has revealed that the cellular coenzyme A (CoA) supply can become limiting with a detrimental impact on growth, metabolism and survival. ...

An Integrated Raman Spectroscopy and Mass Spectrometry Platform to Study Single-Cell Drug Uptake, Metabolism, and Effects

Una plataforma integrada de espectroscopia y espectrometría de masas de Raman para estudiar la admisión, el metabolismo y los efectos de fármacos de una sola célula

Cells are known to be inherently heterogeneous in their responses to drugs. Therefore, it is essential that single-cell heterogeneity is accounted for in ...

Using an Extracellular Flux Analyzer to Measure Changes in Glycolysis and Oxidative Phosphorylation during Mouse Sperm Capacitation

Uso de un analizador de flujo extracelular para medir los cambios en la glucólisis y la fosforilación oxidativa durante la capacitación del esperma del ratón

Mammalian sperm acquire fertilization capacity in the female reproductive tract in a process known as capacitation. Capacitation-associated processes ...

Ex Vivo Hepatic Perfusion Through the Portal Vein in Mouse

Ex Vivo Hepatic Perfusion Through the Portal Vein in Mouse

Ex Vivo Perfusión hepática a través de la vena porta en el ratón

Metabolic diseases such as diabetes, pre-diabetes, non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD), and nonalcoholic steatohepatitis (NASH) are becoming ...

Stable Isotope Tracing & LC-MS Analysis to Measure DHODH and SDH Activities

Oxygen-Independent Assays to Measure Mitochondrial Function in Mammals

Oxygen-Independent Assays to Measure Mitochondrial Function in Mammals (Video) | JoVE 

Ensayos independientes del oxígeno para medir la función mitocondrial en mamíferos

The flow of electrons in the mitochondrial electron transport chain (ETC) supports multifaceted biosynthetic, bioenergetic, and signaling functions in ...