Name: extracellular glucose depletion as an indirect measure of glucose uptake in cells and tissues ex vivo
Uploaded: 2022-04-06T14:20:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Extracellular Glucose Depletion as an Indirect Measure of Glucose Uptake in Cells and Tissues Ex Vivo at JoVE.com

Projektet stöddes av Ralph och Marian Falk Medical Research Catalyst Award och Kathleen Kelly Award. Andra stöd inkluderade National Center for Research Resources UL1RR025755 och NCI P30CA16058 (OSUCCC), NIH Roadmap for Medical Research. Innehållet är enbart författarnas ansvar och representerar inte de officiella åsikterna från National Center for Research Resources eller NIH.

Djurstudier godkändes av Institutional Animal Care and Use Committee vid Ohio State University (OSU, protokoll 2007A0262-R4).
OBS: Alla procedurer måste göras i ett klass II biosäkerhetsskåp med fläkten på och lamporna släckta.
1. Beredning av material
OBS: Alla material är listade i materialförteckningen.
<ol><li>Förbered Medium 1, centrifugering Medium 2 och lagrings- och arbetslösningar a...

<ol>
	<li>Kyrtata, N., Emsley, H. C. A., Sparasci, O., Parkes, L. M., Dickie, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+systematic+review+of+glucose+transport+alterations+in+Alzheimer's+disease.">A systematic review of glucose transport alterations in Alzheimer's disease.</a> Frontiers in Neuroscience. 15, 568 (2021).</li><li>Garcia-Carbonell, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Critical+role+of+glucose+metabolism+in+rheumatoid+arthritis+fibroblast-like+synoviocytes.">Critical role of glucose metabolism in rheumatoid arthritis fibroblast-like synoviocytes.</a> Arthritis Rheumatology. 68 (7), 1614-1626 (2016).</li><li>Kumar, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Is+diabetes+mellitus+associated+with+mortality+and+severity+of+COVID-19?+A+meta-analysis.">Is diabetes mellitus associated with mortality and severity of COVID-19? A meta-analysis.</a> Diabetes &amp; Metabolic Syndrome: Clinical Research &amp; Review. 14 (4), 535-545 (2020).</li><li>Lee, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Different+prognostic+impact+of+glucose+uptake+in+visceral+adipose+tissue+according+to+sex+in+patients+with+colorectal+cancer.">Different prognostic impact of glucose uptake in visceral adipose tissue according to sex in patients with colorectal cancer.</a> Scientific Reports. 11 (1), 21556 (2021).</li><li>Miner, M. W. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of:+(2S,4R)-4-[(18)F]Fluoroglutamine,+[(11)C]Methionine,+and+2-Deoxy-2-[(18)F]Fluoro-D-Glucose+and+two+small-animal+PET/CT+systems+imaging+rat+gliomas.">Comparison of: (2S,4R)-4-[(18)F]Fluoroglutamine, [(11)C]Methionine, and 2-Deoxy-2-[(18)F]Fluoro-D-Glucose and two small-animal PET/CT systems imaging rat gliomas.</a> Frontiers in Oncology. 11 (18), 730358 (2021).</li><li>Gumbiner, B., Thorburn, A. W., Ditzler, T. M., Bulacan, F., Henry, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+impaired+intracellular+glucose+metabolism+in+the+insulin+resistance+of+aging.">Role of impaired intracellular glucose metabolism in the insulin resistance of aging.</a> Metabolism. 41 (10), 1115-1121 (1992).</li><li>Ebrahimi, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beta+cell+identity+changes+with+mild+hyperglycemia:+Implications+for+function,+growth,+and+vulnerability.">Beta cell identity changes with mild hyperglycemia: Implications for function, growth, and vulnerability.</a> Molecular Metabolism. 35, 100959 (2020).</li><li>Ruberto, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=KLF10+integrates+circadian+timing+and+sugar+signaling+to+coordinate+hepatic+metabolism.">KLF10 integrates circadian timing and sugar signaling to coordinate hepatic metabolism.</a> Elife. 10, 65574 (2021).</li><li>Stocks, B., Zierath, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Post-translational+modifications:+The+signals+at+the+intersection+of+exercise,+glucose+uptake,+and+insulin+sensitivity.">Post-translational modifications: The signals at the intersection of exercise, glucose uptake, and insulin sensitivity.</a> Endocrinology Reviews. , (2021).</li><li>World Health Organization. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+report+on+diabetes.">Global report on diabetes.</a> World Health Organization. , (2016).</li><li>Kolb, H., Martin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Environmental/lifestyle+factors+in+the+pathogenesis+and+prevention+of+type+2+diabetes.">Environmental/lifestyle factors in the pathogenesis and prevention of type 2 diabetes.</a> BMC Medicine. 15 (1), 131 (2017).</li><li>Galicia-Garcia, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathophysiology+of+type+2+diabetes+mellitus.">Pathophysiology of type 2 diabetes mellitus.</a> International Journal of Molecular Science. 21 (17), 6275 (2020).</li><li>Petrov, M. S., Basina, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DIAGNOSIS+OF+ENDOCRINE+DISEASE:+Diagnosing+and+classifying+diabetes+in+diseases+of+the+exocrine+pancreas.">DIAGNOSIS OF ENDOCRINE DISEASE: Diagnosing and classifying diabetes in diseases of the exocrine pancreas.</a> European Journal of Endocrinology. 184 (4), 151-163 (2021).</li><li>Sirdah, M. M., Reading, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+predisposition+in+type+2+diabetes:+A+promising+approach+toward+a+personalized+management+of+diabetes.">Genetic predisposition in type 2 diabetes: A promising approach toward a personalized management of diabetes.</a> Clinical Genetics. 98 (6), 525-547 (2020).</li><li>Ramos-Lopez, O., Milagro, F. I., Riezu-Boj, J. I., Martinez, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetic+signatures+underlying+inflammation:+an+interplay+of+nutrition,+physical+activity,+metabolic+diseases,+and+environmental+factors+for+personalized+nutrition.">Epigenetic signatures underlying inflammation: an interplay of nutrition, physical activity, metabolic diseases, and environmental factors for personalized nutrition.</a> Inflammation Research. 70 (1), 29-49 (2021).</li><li>Yamamoto, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+glucose+uptake+in+cultured+cells.">Measurement of glucose uptake in cultured cells.</a> Current Protocols in Pharmacology. 71 (1), 12-14 (2015).</li><li>Yang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+sensitive+and+simple+HPLC-FLD-based+method+for+the+measurement+of+intracellular+glucose+uptake.">A sensitive and simple HPLC-FLD-based method for the measurement of intracellular glucose uptake.</a> Food Chemistry. 372, 131218 (2021).</li><li>Lee, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amino+acid-based+compound+activates+atypical+PKC+and+leptin+receptor+pathways+to+improve+glycemia+and+anxiety+like+behavior+in+diabetic+mice.">Amino acid-based compound activates atypical PKC and leptin receptor pathways to improve glycemia and anxiety like behavior in diabetic mice.</a> Biomaterials. 239, 119839 (2020).</li><li>Shukla, S. K., Mulder, S. E., Singh, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypoxia-mediated+in+vivo+tumor+glucose+uptake+measurement+and+analysis.">Hypoxia-mediated in vivo tumor glucose uptake measurement and analysis.</a> Methods in Molecular Biology. 1742, 107-113 (2018).</li><li>Jakson, I., Ujvari, D., Brusell Gidlof, S., Linden Hirschberg, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insulin+regulation+of+solute+carrier+family+2+member+1+(glucose+transporter+1)+expression+and+glucose+uptake+in+decidualizing+human+endometrial+stromal+cells:+an+in+vitro+study.">Insulin regulation of solute carrier family 2 member 1 (glucose transporter 1) expression and glucose uptake in decidualizing human endometrial stromal cells: an in vitro study.</a> Reproductive Biology and Endocrinology. 18 (1), 117 (2020).</li><li>Saparbaev, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+quantification+of+any+isoforms+of+carbohydrates+by+2D+UV-MS+fingerprinting+of+cold+ions.">Identification and quantification of any isoforms of carbohydrates by 2D UV-MS fingerprinting of cold ions.</a> Analytical Chemistry. 92 (21), 14624-14632 (2020).</li><li>Schulz, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+metabolomics+of+pellicle+and+saliva+in+children+with+different+caries+activity.">Targeted metabolomics of pellicle and saliva in children with different caries activity.</a> Scientific Reports. 10 (1), 697 (2020).</li><li>Shulman, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+magnetic+resonance+studies+of+glucose+metabolism+in+non-insulin-dependent+diabetes+mellitus+subjects.">Nuclear magnetic resonance studies of glucose metabolism in non-insulin-dependent diabetes mellitus subjects.</a> Molecular Medicine. 2 (5), 533-540 (1996).</li><li>Cochran, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+PET+imaging+with+[(18)F]FDG+to+explain+improved+glucose+uptake+in+an+apolipoprotein+A-I+treated+mouse+model+of+diabetes.">In vivo PET imaging with [(18)F]FDG to explain improved glucose uptake in an apolipoprotein A-I treated mouse model of diabetes.</a> Diabetologia. 59 (18), 1977-1984 (2016).</li><li>Lloyd, P. G., Hardin, C. D., Sturek, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Examining+glucose+transport+in+single+vascular+smooth+muscle+cells+with+a+fluorescent+glucose+analog.">Examining glucose transport in single vascular smooth muscle cells with a fluorescent glucose analog.</a> Physiological Research. 48 (6), 401-410 (1999).</li><li>Beeton, C., Garcia, A., Chandy, K. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drawing+blood+from+rats+through+the+saphenous+vein+and+by+cardiac+puncture.">Drawing blood from rats through the saphenous vein and by cardiac puncture.</a> Journal of Visualized Experiments. (7), e266 (2007).</li><li>DiSilvestro, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leptin+production+by+encapsulated+adipocytes+increases+brown+fat,+decreases+resistin,+and+improves+glucose+intolerance+in+obese+mice.">Leptin production by encapsulated adipocytes increases brown fat, decreases resistin, and improves glucose intolerance in obese mice.</a> PLoS One. 11 (4), 0153198 (2016).</li><li>Friedman, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leptin+and+the+endocrine+control+of+energy+balance.">Leptin and the endocrine control of energy balance.</a> Nature Metabolism. 1 (8), 754-764 (2019).</li><li>Guillam, M. T., Burcelin, R., Thorens, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Normal+hepatic+glucose+production+in+the+absence+of+GLUT2+reveals+an+alternative+pathway+for+glucose+release+from+hepatocytes.">Normal hepatic glucose production in the absence of GLUT2 reveals an alternative pathway for glucose release from hepatocytes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 95 (21), 12317-12321 (1998).</li><li>Guillam, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+diabetes+and+abnormal+postnatal+pancreatic+islet+development+in+mice+lacking+Glut-2.">Early diabetes and abnormal postnatal pancreatic islet development in mice lacking Glut-2.</a> Nature Genetics. 17 (3), 327-330 (1997).</li><li>Barros, L. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetic+validation+of+6-NBDG+as+a+probe+for+the+glucose+transporter+GLUT1+in+astrocytes.">Kinetic validation of 6-NBDG as a probe for the glucose transporter GLUT1 in astrocytes.</a> Journal of Neurochemistry. 109, 94-100 (2009).</li><li>Sprinz, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+blood+glucose+level+on+18F-FDG+uptake+for+PET/CT+in+normal+organs:+A+systematic+review.">Effects of blood glucose level on 18F-FDG uptake for PET/CT in normal organs: A systematic review.</a> PLoS One. 13 (2), 0193140 (2018).</li><li>Johnson, T. V., Martin, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+characterization+of+an+adult+retinal+explant+organotypic+tissue+culture+system+as+an+in+vitro+intraocular+stem+cell+transplantation+model.">Development and characterization of an adult retinal explant organotypic tissue culture system as an in vitro intraocular stem cell transplantation model.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 49 (8), 3503-3512 (2008).</li><li>de Urquiza, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Docosahexaenoic+acid,+a+ligand+for+the+retinoid+X+receptor+in+mouse+brain.">Docosahexaenoic acid, a ligand for the retinoid X receptor in mouse brain.</a> Science. 290 (5499), 2140-2144 (2000).</li><li>Olson, A. L., Pessin, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure,+function,+and+regulation+of+the+mammalian+facilitative+glucose+transporter+gene+family.">Structure, function, and regulation of the mammalian facilitative glucose transporter gene family.</a> Annual Review of Nutrition. 16 (1), 235-256 (1996).</li><li>Muhanna, D., Arnipalli, S. R., Kumar, S. B., Ziouzenkova, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osmotic+adaptation+by+Na(+)-dependent+transporters+and+ACE2:+correlation+with+hemostatic+crisis+in+COVID-19.">Osmotic adaptation by Na(+)-dependent transporters and ACE2: correlation with hemostatic crisis in COVID-19.</a> Biomedicines. 8 (11), 460 (2020).</li><li>Ligasova, A., Koberna, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+dyes-highly+sensitive+reporters+of+cell+quantification:+comparison+with+other+cell+quantification+methods.">DNA dyes-highly sensitive reporters of cell quantification: comparison with other cell quantification methods.</a> Molecules. 26 (18), 5515 (2021).</li><li>DeFronzo, R. A., Tobin, J. D., Andres, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glucose+clamp+technique:+a+method+for+quantifying+insulin+secretion+and+resistance.">Glucose clamp technique: a method for quantifying insulin secretion and resistance.</a> American Journal of Physiology. 237 (3), 214-223 (1979).</li></ol>

Den direkta jämförelsen av extracellulär FD-glukosutarmning med normaliserat intracellulärt glukosupptag i cellkulturen visade en hög korrelation, vilket tyder på att extracellulär glukosutarmning kan vara en surrogatmätning för bedömning av glukosupptag. Mätningen av extracellulär FD-glukos kan använda ett brett spektrum av FD-glukoskoncentrationer, även 0,5-2,5 μg FD-glukos / ml verkar ge det optimala intervallet. Extracellulär FD-glukos kräver inte normalisering till cellantal eller proteinkoncentrati...

Efterfrågan på att mäta glukosupptaget ökar tillsammans med det kritiska behovet av att ta itu med en epidemisk ökning av en mängd sjukdomar som är beroende av glukosmetabolism. Underliggande mekanismer för degenerativa metaboliska sjukdomar, neurologiska och kognitiva störningar1, inflammatoriska2 och infektionssjukdomar3, cancer 4,5, liksom åldrande6, beror på glukosmetabolism för energi och dess lagring, anabola processer, protein och genmodifiering, signalering, reglering av gener och nukleinsyror syntes och replikation 7,8,9 . Diabetes mellitus (DM) är direkt relaterad till funktionsfel i glukosupptagsregleringen. DM är ett spektrum av kroniska sjukdomar som typ-1, -2 och -3 diabetes mellitus, graviditetsdiabetes, mognadsdiabetes hos unga och andra typer av denna sjukdom inducerad av miljömässiga och / eller genetiska faktorer. År 2016 visade den första WHO Global-rapporten om diabetes att antalet vuxna som lever med den mest utbredda DM nästan har fyrdubblats sedan 1980 till 422 miljoner vuxna10, och detta antal DM-patienter har ökat exponentiellt under de senaste decennierna. Bara under 2019 orsakades en uppskattning av 1,5 miljoner dödsfall direkt avDM 10. Denna dramatiska uppgång beror på ökningen av typ 2 DM och de förhållanden som driver den, inklusive övervikt och fetma10. COVID-19-pandemin avslöjade en tvåfaldig ökning av dödligheten hos patienter med DM jämfört med den allmänna befolkningen, vilket tyder på den djupa men dåligt förstådda rollen som glukosmetabolism i immunförsvaret3. Förebyggande, tidig diagnos och behandling av DM, fetma och andra sjukdomar kräver optimering av mätningar av glukosupptag av olika vävnader och identifiering av miljö11,näringsämne 12, endokrina13, genetiska14 och epigenetiska15 faktorer som påverkar glukosupptaget.
Inom forskning mäts vanligtvis intracellulärt och/eller vävnadsupptag av glukos med fluorescerande märkt glukos (FD-glukos) in vitro 16,17,18 och in vivo19. FD-glukos blev en föredragen metod jämfört med mer exakta metoder med radioaktivt märkt glukos20, analytisk masspektroskopianalys21, metabolomik22, kärnmagnetisk resonansmetod23 och positronemissionstomografi / datortomografi (PET / CT)5,24. Till skillnad från FD-glukosupptag kan analysmetoder som kräver mer biologiskt material involvera en flerstegs provberedning, dyra instrument och komplex dataanalys. Effektiva och billiga mätningar av FD-glukosupptag i cellkulturer har använts i proof-of-concept-experiment och kan kräva validering med andra metoder.
Grunden för FD-glukosapplikation för glukosupptagsstudier är den minskade metabolismen av FD-glukos jämfört med endogen glukos25. Icke desto mindre, både endogen glukos och FD-glukos distribueras dynamiskt mellan alla cellulära fack för användning i anabola, katabola, och signalering processer. Uppdelningen och tidsberoende bearbetning25 av FD-glukos stör fluorescensmätningarna och representerar de viktigaste begränsande faktorerna för användningen av denna analys i screeningexperiment med hög genomströmning, kinetisk analys, 3D-cellodling, samkulturer och vävnadsexplanteringsexperiment. Här tillhandahåller vi data som visar en hög korrelation mellan den extracellulära utarmningen av FD-glukos och dess intracellulära upptag, vilket tyder på extracellulär utarmning av FD-glukos som en surrogatmätning för intracellulärt glukosupptag. Mätningen av extracellulär utarmning av glukos tillämpades för att validera vävnadsspecifika skillnader i glukosupptag hos möss behandlade med insulin och ett experimentellt läkemedel18 för att ge ett principbevis för denna metod.
Det aktuella protokollet beskriver intracellulära och extracellulära (figur 1) mätningar av FD-glukosupptag i 3T3-L1-celler. Protokollavsnitt 1-7 förklarar odling och tillväxt av celler i 48 timmar; cellhushållning, stimulering och extracellulära baslinjemätningar; och poststimuleringsmätningar av extracellulär FD-glukos och intracellulära mätningar av FD-glukos och protein. Protokollavsnitt 8 beskriver ex vivo-mätningen av extracellulärt upptag av FD-glukos i vävnader som dissekeras från ob/ob-möss i närvaro och frånvaro av insulin och aminosyraförening 2 (AAC2) som beskrivs på annan plats18.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>3T3-L1 mouse fibroblasts</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CL-173</td>
			<td>Cell line</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plates</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353227</td>
			<td>Plastic ware</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B6.V-Lepob/J male mice</td>
			<td>Jackson Laboratory</td>
			<td>stock number 000632</td>
			<td>Mice</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BioTek Synergy H1 modular multimode microplate reader (Fisher Scientific, US)</td>
			<td>Fisher Scientific, US</td>
			<td>&#160;B-SHT</td>
			<td>Device</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum</td>
			<td>Gibco/ThermoFisher</td>
			<td>161790-060</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calf serum</td>
			<td>Gibco/ThermoFisher</td>
			<td>26010-066</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell incubator</td>
			<td>Forma</td>
			<td>Series II Water Jacket</td>
			<td>Device</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diet (mouse/rat diet, irradiated)</td>
			<td>Envigo</td>
			<td>Teklad LM-485</td>
			<td>Diet</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethylsulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Sigma LifeScience</td>
			<td>D2650-100mL</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium</td>
			<td>Gibco/ThermoFisher</td>
			<td>&#160;11965-092</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>E7023-500mL</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent 2-deoxy-2-[(7-nitro-2,1,3-benzoxadiazol-4-yl) amino]-D-glucose)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>72987-1MG</td>
			<td>Assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose-free and phenol red-free DMEM</td>
			<td>Gibco/ThermoFisher</td>
			<td>A14430-01</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human insulin 10 mg/mL</td>
			<td>MilliporeSigma, Cat N 91077C</td>
			<td>Cat N 91077C</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane, 5%</td>
			<td>Henry Schein</td>
			<td>NDC 11695-6776-2</td>
			<td>Anestaetic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/streptomycin (P/S)</td>
			<td>Gibco/ThermoFisher</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>DA537-500 mL</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce bicinchoninic acid (BCA) protein assay</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>Cat N23225</td>
			<td>Assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Radioimmunoprecipitation assay lysis buffer</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-24948</td>
			<td>Assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0.05%)</td>
			<td>Gibco/ThermoFisher</td>
			<td>&#160;25300-054</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

extracellular glucose depletion as an indirect measure of glucose uptake in cells and tissues ex vivo

Den pågående globala epidemin av diabetes ökar efterfrågan på identifiering av miljömässiga, näringsmässiga, endokrina, genetiska och epigenetiska faktorer som påverkar glukosupptaget. Mätningen av intracellulär fluorescens är en allmänt använd metod för att testa upptaget av fluorescerande märkt glukos (FD-glukos) i celler in vitro eller för avbildning av glukosförbrukande vävnader in vivo. Denna analys bedömer glukosupptaget vid en vald tidpunkt. Den intracellulära analysen förutsätter att metabolismen av FD-glukos är långsammare än för endogen glukos, som deltar i katabola och anabola reaktioner och signalering. Dynamisk glukosmetabolism förändrar emellertid också upptagsmekanismer, vilket skulle kräva kinetiska mätningar av glukosupptag som svar på olika faktorer. Denna artikel beskriver en metod för att mäta extracellulär FD-glukosutarmning och validerar dess korrelation med intracellulärt FD-glukosupptag i celler och vävnader ex vivo. Extracellulär glukosutarmning kan vara potentiellt tillämplig för kinetiska och dosberoende studier med hög genomströmning, samt för att identifiera föreningar med glykemisk aktivitet och deras vävnadsspecifika effekter.

Intracellulärt intag och extracellulär glukosutarmning mättes i 3T3-L1-preadipocyter, som svar på olika koncentrationer av FD-glukos (figur 2) med och utan insulinstimulering. Figur 2A visar en dosberoende ökning av det intracellulära upptaget av FD-glukos, vilket ökade signifikant i närvaro av insulin. Den samtidiga minskningen av extracellulär FD-glukos i samma celler visas i figur 2B, där insulinstimulering ledde till s...

Watch this Scientific Journal Video about Extracellular Glucose Depletion as an Indirect Measure of Glucose Uptake in Cells and Tissues Ex Vivo at JoVE.com

Extracellular Glucose Depletion as an Indirect Measure of Glucose Uptake in Cells and Tissues Ex Vivo

Extracellulär utarmning av fluorescerande märkt glukos korrelerar med glukosupptag och kan användas för screening med hög genomströmning av glukosupptag i utskurna organ och cellkulturer.

Extracellulär glukosutarmning som ett indirekt mått på glukosupptag i celler och vävnader ex vivo

The ongoing worldwide epidemic of diabetes increases the demand for the identification of environmental, nutritional, endocrine, genetic, and epigenetic ...

Glukosupptag är nyckeln till att förstå hälsa och sjukdom. Eftersom glukos spelar en avgörande roll i metaboliska och strukturella krav i människokroppen, samt spelar en viktig roll i regleringen. Den extracellulära mätningen av glukos möjliggör utveckling av analyser med hög genomströmning för kinetik av glukosupptag i celler, vävnader och organ med olika genetisk bakgrund som svar på näringsämnen eller läkemedel.Denna analys skulle vara ett värdefullt verktyg för upptäckten av terapi och näring för diabetes, cancer, degenerativa sjukdomar i centrala nervsystemet, fetma och alla sjukdomar i glukos och metabolism. Analysen behöver en justering av tiden för svält och stimulering som bör baseras på metaboliska detaljer för olika vävnader och cellkulturer. Odla 3T3-L1 musfibroblaster genom plätering av 10 till de 6 cellerna, utspädda i 20 ml medium 1 i 296 brunnsplattor.Platta 100 mikroliter cellsuspension per brunn, vilket säkerställer att homogeniteten hos denna suspension bibehålls genom blandning. Växa celler i 48 timmar i en 37 grader Celsius inkubator utan att byta media tills ca 70 till 80% sammanflöde. Håll cellerna sammanflytande och fasta genom att odla dem i samma medium i 48 timmar.Variera inkubationstiden från 24 till 72 timmar, beroende på önskat fastande kataboliskt tillstånd. Dekantera media från celler i de 96 brunnsplattorna. Absorbera den återstående vätskan med sterila pappershanddukar.Skölj 96-brunnsplattan med 100 mikroliter PBS per brunn och absorbera den återstående vätskan med sterila pappershanddukar. Tillsätt 100 mikroliter glukosfri DMEM per brunn och inkubera i 40 minuter. Justera inkubationstiden beroende på celltypstimuli och önskad fastenivå.Använd åtta replikat för varje simuleringsvillkor. Förbered därför en milliliter för varje simuleringstillstånd. Använd sju simuleringsförhållanden utan insulin.FD-glukos på 2,5 mikrogram per milliliter, 1 mikrogram per milliliter, 0,5 mikrogram per milliliter, 0,2 mikrogram per milliliter, 0,1 mikrogram per milliliter, 0,05 mikrogram per milliliter och 0 milligram per milliliter i 196 brunnsplatta. Använd sju stimuleringstillstånd med insulin. FD-glukos på 2,5 mikrogram per milliliter, 1 mikrogram per milliliter, 0,5 mikrogram per milliliter, 0,2 mikrogram per milliliter, 0,1 mikrogram per milliliter, 0,05 mikrogram per milliliter och 0 mikrogram per milliliter i ytterligare 96 brunnsplattor.För att förbereda stimuleringsförhållanden, späd en mikroliter av fem milligram per milliliter FD-glukosarbetslösning och 999 mikroliter glukosfri DMEM för att erhålla en milliliter arbetsstamlösning. Använd denna arbetsstamlösning, förbered 1 till 2000, 1 till 5 000, 1 till 10 000, 1 till 25 000, 1 till 50 000 och 1 till 100 000 vanföreställningar av FD-glukos för att erhålla 2,5 mikrogram per milliliter, 1 mikrogram per milliliter, 0,5 mikrogram per milliliter, 0,2 mikrogram per milliliter, 0,1 mikrogram per milliliter, 0,05 mikrogram per milliliter i två milliliterrör omedelbart före experiment i ett biosäkerhetsskåp utan lampor. Tillsätt en mikroliter insulin till vart och ett av dessa tillstånd.Efter 40 minuters inkubation, dekantera den glukosfria DMEM från varje brunn i 96 brunnsplattor och absorbera den återstående vätskan med sterila pappershanddukar. Tillsätt 100 mikroliter vardera från de olika behandlingsbetingelserna som beskrivits tidigare, till brunnar längs en kolonn. Och 100 mikroliter från samma behandlingstillstånd till brunnarna längs raden i båda 96 väggplattorna.Märk plattorna som utnyttjade villkoren, med och utan insulin. Tillsätt glukosfri DMEM ensam till kontrollbrunnarna. Inkubera plattan i 40 minuter i cellodlingsinkubatorn i mörkret.Efter att cellerna har stimulerats i 40 minuter. Överför stimuleringsmediet från båda plattorna till nya 96-brunnsplattor och bibehåll samma experimentella layout. Tvätta cellerna med PBS.Ta bort PBS och dekantera eventuell återstående lösning på sterila pappershanddukar. Tillsätt en proteashämmare till radioimmunprecipitationsanalysbufferten för att skydda proteiner. Placera plattor som innehåller radioimmunprecipitationsanalys i en shaker i 30 minuter.Mät fluorescens vid excitations- och emissionsvåglängder vid 485 respektive 535 nanometer med hjälp av en mikroplattläsare. Först i mediet innehållande extracellulär FD-glukos, och sedan plattan med radioimmunoprecipitationsanalys lized celler i slutet av 30 minuters inkubation. Utför BCA-proteinanalys enligt tillverkarens instruktioner.Kvantifiera proteinkoncentrationerna i varje brunn som innehåller radioimmunprecipitationsanalyserade celler. Använd 10 mikroliter av radioimmunprecipitationsanalyshomogenatet och mät proteinkoncentrationer och tredubbla för att öka mätnoggrannheten i 96 brunnsplattor. Kvantifiera protein baserat på proteinstandarder analyserade tillsammans med prover på varje 96 brunnsplatta.Inkubera de skördade vävnaderna eller organen i en sexbrunnsplatta som innehåller PBS i en minut. Hantera varje vävnad eller organ i en separat brunn. Efter en minut, placera varje vävnad på en steril pappershandduk för att absorbera PBS.Överför vävnader eller organ i en separat sexväggsplatta innehållande 4 000 mikroliter glukosfri DMEM och inkubera i två minuter. Efter två minuter, ta bort och överför vävnaderna till brunnar i en sexbrunnsplatta innehållande 0,29 millimolär FD-glukosarbetslösning. Inkubera de sex brunnsplattorna som innehåller vävnader i FD-glukosarbetslösning vid 37 grader Celsius.Samla 100 mikroliter FD-glukosarbetslösning från varje brunn efter 0, 10, 20, 30, 40, 60, 90 och 120 minuters inkubation och överför uppsamlad 100 mikroliter FD-glukosarbetslösning till 96 brunnsplattor för att analysera kinetiken för extracellulär FD-glukosutarmning. Skaka före och efter insamling. Mät fluorescensen vid excitation i emissionsvåglängder vid 485 respektive 535 nanometer med hjälp av en mikroplattläsare.Dosberoendet vid intracellulärt upptag av FD-glukos ökade signifikant i närvaro av insulin. Insulinstimuleringen ledde till signifikant minskade extracellulära FD-glukosnivåer jämfört med proverna utan insulinstimulering. Extracellulär utarmning av FD-glukos kan mäta en förändring i glukosupptag med jämförbar noggrannhet som intracellulärt FD-glukosupptag.Den extracellulära FD-glukosen utarmades inte i icke-stimulerat kontrollvisceralt fett under 120 minuters inkubation. Däremot ledde förbehandling av möss med insulin eller AAC2 före dissektionen till signifikant utarmning av extracellulär FD-glukos inom ett tidsintervall på 30 minuter respektive 60 minuter. Extracellulär FD-glukos var inte utarmad i insulinstimulerade leverutplantningar, jämfört med icke-stimulerade leverutplantningar.Extracellulär FD-glukos minskade signifikant på det tidsberoende sättet, och leverutplantor förbehandlade med AAC2.22% utarmning av glukos observerades i det extracellulära mediet innehållande den icke-behandlade hjärnan efter 60 minuters inkubation. Mediet inkuberat med hjärnor från insulinbehandlade möss har visat en 5% linjär minskning av FD-glukos. AAC2-stimulerade hjärnor ledde till en djupgående snabb minskning till 67,4% av den extracellulära FD-glukosen under de första 20 minuterna.Ämne som involverar tvättning är särskilt viktigt för att ta bort spår av glukos, blod eller serum i medium och eller organ, eftersom det kan störa fluorescensavläsningen av dessa medier. Efter hög genomströmning kunde identifiering av föreningar av metaboliter i gener med glykemiska egenskaper, liksom de optimala betingelserna för deras verkan in vivo-experiment, valideras med märkt FD-glukos och PET-skanning för att bekräfta glukosackumulering i specifika organ. Denna teknik för upptäckt av glykemisk verkan är både fördelaktig vid radering av många metaboliter, terapier eller deras kombinationer och belyser deras handlingar i olika organ.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Extracellular Glucose Depletion as an Indirect Measure of Glucose Uptake in Cells and Tissues Ex Vivo

A Method for Measuring RNA N6-methyladenosine Modifications in Cells and Tissues

A Method for Measuring RNA N6-methyladenosine Modifications in Cells and Tissues

En metod för mätning av RNA<em&gt; N</em<sup&gt; 6</sup&gt; -methyladenosine Ändringar i celler och vävnader

N6-Methyladenosine (m6A) modifications of RNA are diverse and ubiquitous amongst eukaryotes. They occur in mRNA, rRNA, tRNA, and microRNA. Recent studies ...

Brain Membrane Fractionation: An Ex Vivo Approach to Assess Subsynaptic Protein Localization

Brain Membrane Fractionation: An Ex Vivo Approach to Assess Subsynaptic Protein Localization

Hjärnmembranfraktioner: An<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Tillvägagångssätt för att utvärdera lokalisering av subsynaptisk protein

Assessing the synaptic protein composition and function constitutes an important challenge in neuroscience. However, it is not easy to evaluate ...

Dissipative Microgravimetry to Study the Binding Dynamics of the Phospholipid Binding Protein Annexin A2 to Solid-supported Lipid Bilayers Using a Quartz Resonator

Dissipativa Microgravimetry att studera bindande dynamiken i den fosfolipid bindande proteinet Annexin A2 till Solid-stödda Lipid lipidmonolager med en kvarts Resonator

The dissipative quartz crystal microbalance technique is a simple and label-free approach to measure simultaneously the mass uptake and viscoelastic ...

Analysis of Endocytic Uptake and Retrograde Transport to the Trans-Golgi Network Using Functionalized Nanobodies in Cultured Cells

Analys av Endocytic upptag och retrograd Transport till Trans-Golgi nätverket med Functionalized Nanobodies i odlade celler

Transport of proteins and membranes from the cell surface to the Golgi and beyond is essential for homeostasis, organelle identity and physiology. To ...

Atomic Absorbance Spectroscopy to Measure Intracellular Zinc Pools in Mammalian Cells

Atomabsorptionsspektroskopi för att mäta intracellulära Zinkpooler i däggdjurs celler

Transition metals are essential micronutrients for organisms but can be toxic to cells at high concentrations by competing with physiological metals in ...

Quantification of Coenzyme A in Cells and Tissues

Kvantifiering av coenzym A i celler och vävnader

Emerging research has revealed that the cellular coenzyme A (CoA) supply can become limiting with a detrimental impact on growth, metabolism and survival. ...

An Integrated Raman Spectroscopy and Mass Spectrometry Platform to Study Single-Cell Drug Uptake, Metabolism, and Effects

En integrerad Raman spektroskopi och masspektrometri plattform för att studera Single-cell drog upptag, metabolism, och effekter

Cells are known to be inherently heterogeneous in their responses to drugs. Therefore, it is essential that single-cell heterogeneity is accounted for in ...

Using an Extracellular Flux Analyzer to Measure Changes in Glycolysis and Oxidative Phosphorylation during Mouse Sperm Capacitation

Använda en extracellulär Flux-analysator för att mäta förändringar i glykolys och oxidativ fosforylering under mus spermie kapacitet

Mammalian sperm acquire fertilization capacity in the female reproductive tract in a process known as capacitation. Capacitation-associated processes ...

Ex Vivo Hepatic Perfusion Through the Portal Vein in Mouse

Ex Vivo Hepatic Perfusion Through the Portal Vein in Mouse

Ex Vivo Hepatisk perfusion genom portalvenen i musen

Metabolic diseases such as diabetes, pre-diabetes, non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD), and nonalcoholic steatohepatitis (NASH) are becoming ...

Stable Isotope Tracing & LC-MS Analysis to Measure DHODH and SDH Activities

Oxygen-Independent Assays to Measure Mitochondrial Function in Mammals

Oxygen-Independent Assays to Measure Mitochondrial Function in Mammals (Video) | JoVE 

Syreoberoende analyser för att mäta mitokondriell funktion hos däggdjur

The flow of electrons in the mitochondrial electron transport chain (ETC) supports multifaceted biosynthetic, bioenergetic, and signaling functions in ...