Name: extracellular glucose depletion as an indirect measure of glucose uptake in cells and tissues ex vivo
Uploaded: 2022-04-06T14:20:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Extracellular Glucose Depletion as an Indirect Measure of Glucose Uptake in Cells and Tissues Ex Vivo at JoVE.com

Proje, Ralph ve Marian Falk Tıbbi Araştırma Katalizörü Ödülü ve Kathleen Kelly Ödülü tarafından desteklendi. Diğer destekler arasında Ulusal Araştırma Kaynakları Merkezi UL1RR025755 ve NCI P30CA16058 (OSUCCC), NIH Tıbbi Araştırma Yol Haritası yer aldı. İçerik yalnızca yazarların sorumluluğundadır ve Ulusal Araştırma Kaynakları Merkezi veya NIH'nin resmi görüşlerini temsil etmemektedir.

Hayvan çalışmaları, Ohio State Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi tarafından onaylanmıştır (OSU, protokol 2007A0262-R4).
NOT: Tüm prosedürler, üfleyici açık ve ışıklar kapalı olarak sınıf II biyogüvenlik kabininde yapılmalıdır.
1. Malzemelerin hazırlanması
NOT: Tüm malzemeler Malzeme Tablosunda listelenmiştir.
<ol><li>Sınıf II biyogüvenlik kabini...

<ol>
	<li>Kyrtata, N., Emsley, H. C. A., Sparasci, O., Parkes, L. M., Dickie, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+systematic+review+of+glucose+transport+alterations+in+Alzheimer's+disease.">A systematic review of glucose transport alterations in Alzheimer's disease.</a> Frontiers in Neuroscience. 15, 568 (2021).</li><li>Garcia-Carbonell, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Critical+role+of+glucose+metabolism+in+rheumatoid+arthritis+fibroblast-like+synoviocytes.">Critical role of glucose metabolism in rheumatoid arthritis fibroblast-like synoviocytes.</a> Arthritis Rheumatology. 68 (7), 1614-1626 (2016).</li><li>Kumar, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Is+diabetes+mellitus+associated+with+mortality+and+severity+of+COVID-19?+A+meta-analysis.">Is diabetes mellitus associated with mortality and severity of COVID-19? A meta-analysis.</a> Diabetes &amp; Metabolic Syndrome: Clinical Research &amp; Review. 14 (4), 535-545 (2020).</li><li>Lee, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Different+prognostic+impact+of+glucose+uptake+in+visceral+adipose+tissue+according+to+sex+in+patients+with+colorectal+cancer.">Different prognostic impact of glucose uptake in visceral adipose tissue according to sex in patients with colorectal cancer.</a> Scientific Reports. 11 (1), 21556 (2021).</li><li>Miner, M. W. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of:+(2S,4R)-4-[(18)F]Fluoroglutamine,+[(11)C]Methionine,+and+2-Deoxy-2-[(18)F]Fluoro-D-Glucose+and+two+small-animal+PET/CT+systems+imaging+rat+gliomas.">Comparison of: (2S,4R)-4-[(18)F]Fluoroglutamine, [(11)C]Methionine, and 2-Deoxy-2-[(18)F]Fluoro-D-Glucose and two small-animal PET/CT systems imaging rat gliomas.</a> Frontiers in Oncology. 11 (18), 730358 (2021).</li><li>Gumbiner, B., Thorburn, A. W., Ditzler, T. M., Bulacan, F., Henry, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+impaired+intracellular+glucose+metabolism+in+the+insulin+resistance+of+aging.">Role of impaired intracellular glucose metabolism in the insulin resistance of aging.</a> Metabolism. 41 (10), 1115-1121 (1992).</li><li>Ebrahimi, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beta+cell+identity+changes+with+mild+hyperglycemia:+Implications+for+function,+growth,+and+vulnerability.">Beta cell identity changes with mild hyperglycemia: Implications for function, growth, and vulnerability.</a> Molecular Metabolism. 35, 100959 (2020).</li><li>Ruberto, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=KLF10+integrates+circadian+timing+and+sugar+signaling+to+coordinate+hepatic+metabolism.">KLF10 integrates circadian timing and sugar signaling to coordinate hepatic metabolism.</a> Elife. 10, 65574 (2021).</li><li>Stocks, B., Zierath, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Post-translational+modifications:+The+signals+at+the+intersection+of+exercise,+glucose+uptake,+and+insulin+sensitivity.">Post-translational modifications: The signals at the intersection of exercise, glucose uptake, and insulin sensitivity.</a> Endocrinology Reviews. , (2021).</li><li>World Health Organization. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+report+on+diabetes.">Global report on diabetes.</a> World Health Organization. , (2016).</li><li>Kolb, H., Martin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Environmental/lifestyle+factors+in+the+pathogenesis+and+prevention+of+type+2+diabetes.">Environmental/lifestyle factors in the pathogenesis and prevention of type 2 diabetes.</a> BMC Medicine. 15 (1), 131 (2017).</li><li>Galicia-Garcia, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathophysiology+of+type+2+diabetes+mellitus.">Pathophysiology of type 2 diabetes mellitus.</a> International Journal of Molecular Science. 21 (17), 6275 (2020).</li><li>Petrov, M. S., Basina, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DIAGNOSIS+OF+ENDOCRINE+DISEASE:+Diagnosing+and+classifying+diabetes+in+diseases+of+the+exocrine+pancreas.">DIAGNOSIS OF ENDOCRINE DISEASE: Diagnosing and classifying diabetes in diseases of the exocrine pancreas.</a> European Journal of Endocrinology. 184 (4), 151-163 (2021).</li><li>Sirdah, M. M., Reading, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+predisposition+in+type+2+diabetes:+A+promising+approach+toward+a+personalized+management+of+diabetes.">Genetic predisposition in type 2 diabetes: A promising approach toward a personalized management of diabetes.</a> Clinical Genetics. 98 (6), 525-547 (2020).</li><li>Ramos-Lopez, O., Milagro, F. I., Riezu-Boj, J. I., Martinez, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetic+signatures+underlying+inflammation:+an+interplay+of+nutrition,+physical+activity,+metabolic+diseases,+and+environmental+factors+for+personalized+nutrition.">Epigenetic signatures underlying inflammation: an interplay of nutrition, physical activity, metabolic diseases, and environmental factors for personalized nutrition.</a> Inflammation Research. 70 (1), 29-49 (2021).</li><li>Yamamoto, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+glucose+uptake+in+cultured+cells.">Measurement of glucose uptake in cultured cells.</a> Current Protocols in Pharmacology. 71 (1), 12-14 (2015).</li><li>Yang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+sensitive+and+simple+HPLC-FLD-based+method+for+the+measurement+of+intracellular+glucose+uptake.">A sensitive and simple HPLC-FLD-based method for the measurement of intracellular glucose uptake.</a> Food Chemistry. 372, 131218 (2021).</li><li>Lee, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amino+acid-based+compound+activates+atypical+PKC+and+leptin+receptor+pathways+to+improve+glycemia+and+anxiety+like+behavior+in+diabetic+mice.">Amino acid-based compound activates atypical PKC and leptin receptor pathways to improve glycemia and anxiety like behavior in diabetic mice.</a> Biomaterials. 239, 119839 (2020).</li><li>Shukla, S. K., Mulder, S. E., Singh, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypoxia-mediated+in+vivo+tumor+glucose+uptake+measurement+and+analysis.">Hypoxia-mediated in vivo tumor glucose uptake measurement and analysis.</a> Methods in Molecular Biology. 1742, 107-113 (2018).</li><li>Jakson, I., Ujvari, D., Brusell Gidlof, S., Linden Hirschberg, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insulin+regulation+of+solute+carrier+family+2+member+1+(glucose+transporter+1)+expression+and+glucose+uptake+in+decidualizing+human+endometrial+stromal+cells:+an+in+vitro+study.">Insulin regulation of solute carrier family 2 member 1 (glucose transporter 1) expression and glucose uptake in decidualizing human endometrial stromal cells: an in vitro study.</a> Reproductive Biology and Endocrinology. 18 (1), 117 (2020).</li><li>Saparbaev, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+quantification+of+any+isoforms+of+carbohydrates+by+2D+UV-MS+fingerprinting+of+cold+ions.">Identification and quantification of any isoforms of carbohydrates by 2D UV-MS fingerprinting of cold ions.</a> Analytical Chemistry. 92 (21), 14624-14632 (2020).</li><li>Schulz, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+metabolomics+of+pellicle+and+saliva+in+children+with+different+caries+activity.">Targeted metabolomics of pellicle and saliva in children with different caries activity.</a> Scientific Reports. 10 (1), 697 (2020).</li><li>Shulman, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+magnetic+resonance+studies+of+glucose+metabolism+in+non-insulin-dependent+diabetes+mellitus+subjects.">Nuclear magnetic resonance studies of glucose metabolism in non-insulin-dependent diabetes mellitus subjects.</a> Molecular Medicine. 2 (5), 533-540 (1996).</li><li>Cochran, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+PET+imaging+with+[(18)F]FDG+to+explain+improved+glucose+uptake+in+an+apolipoprotein+A-I+treated+mouse+model+of+diabetes.">In vivo PET imaging with [(18)F]FDG to explain improved glucose uptake in an apolipoprotein A-I treated mouse model of diabetes.</a> Diabetologia. 59 (18), 1977-1984 (2016).</li><li>Lloyd, P. G., Hardin, C. D., Sturek, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Examining+glucose+transport+in+single+vascular+smooth+muscle+cells+with+a+fluorescent+glucose+analog.">Examining glucose transport in single vascular smooth muscle cells with a fluorescent glucose analog.</a> Physiological Research. 48 (6), 401-410 (1999).</li><li>Beeton, C., Garcia, A., Chandy, K. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drawing+blood+from+rats+through+the+saphenous+vein+and+by+cardiac+puncture.">Drawing blood from rats through the saphenous vein and by cardiac puncture.</a> Journal of Visualized Experiments. (7), e266 (2007).</li><li>DiSilvestro, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leptin+production+by+encapsulated+adipocytes+increases+brown+fat,+decreases+resistin,+and+improves+glucose+intolerance+in+obese+mice.">Leptin production by encapsulated adipocytes increases brown fat, decreases resistin, and improves glucose intolerance in obese mice.</a> PLoS One. 11 (4), 0153198 (2016).</li><li>Friedman, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leptin+and+the+endocrine+control+of+energy+balance.">Leptin and the endocrine control of energy balance.</a> Nature Metabolism. 1 (8), 754-764 (2019).</li><li>Guillam, M. T., Burcelin, R., Thorens, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Normal+hepatic+glucose+production+in+the+absence+of+GLUT2+reveals+an+alternative+pathway+for+glucose+release+from+hepatocytes.">Normal hepatic glucose production in the absence of GLUT2 reveals an alternative pathway for glucose release from hepatocytes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 95 (21), 12317-12321 (1998).</li><li>Guillam, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+diabetes+and+abnormal+postnatal+pancreatic+islet+development+in+mice+lacking+Glut-2.">Early diabetes and abnormal postnatal pancreatic islet development in mice lacking Glut-2.</a> Nature Genetics. 17 (3), 327-330 (1997).</li><li>Barros, L. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetic+validation+of+6-NBDG+as+a+probe+for+the+glucose+transporter+GLUT1+in+astrocytes.">Kinetic validation of 6-NBDG as a probe for the glucose transporter GLUT1 in astrocytes.</a> Journal of Neurochemistry. 109, 94-100 (2009).</li><li>Sprinz, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+blood+glucose+level+on+18F-FDG+uptake+for+PET/CT+in+normal+organs:+A+systematic+review.">Effects of blood glucose level on 18F-FDG uptake for PET/CT in normal organs: A systematic review.</a> PLoS One. 13 (2), 0193140 (2018).</li><li>Johnson, T. V., Martin, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+characterization+of+an+adult+retinal+explant+organotypic+tissue+culture+system+as+an+in+vitro+intraocular+stem+cell+transplantation+model.">Development and characterization of an adult retinal explant organotypic tissue culture system as an in vitro intraocular stem cell transplantation model.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 49 (8), 3503-3512 (2008).</li><li>de Urquiza, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Docosahexaenoic+acid,+a+ligand+for+the+retinoid+X+receptor+in+mouse+brain.">Docosahexaenoic acid, a ligand for the retinoid X receptor in mouse brain.</a> Science. 290 (5499), 2140-2144 (2000).</li><li>Olson, A. L., Pessin, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure,+function,+and+regulation+of+the+mammalian+facilitative+glucose+transporter+gene+family.">Structure, function, and regulation of the mammalian facilitative glucose transporter gene family.</a> Annual Review of Nutrition. 16 (1), 235-256 (1996).</li><li>Muhanna, D., Arnipalli, S. R., Kumar, S. B., Ziouzenkova, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osmotic+adaptation+by+Na(+)-dependent+transporters+and+ACE2:+correlation+with+hemostatic+crisis+in+COVID-19.">Osmotic adaptation by Na(+)-dependent transporters and ACE2: correlation with hemostatic crisis in COVID-19.</a> Biomedicines. 8 (11), 460 (2020).</li><li>Ligasova, A., Koberna, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+dyes-highly+sensitive+reporters+of+cell+quantification:+comparison+with+other+cell+quantification+methods.">DNA dyes-highly sensitive reporters of cell quantification: comparison with other cell quantification methods.</a> Molecules. 26 (18), 5515 (2021).</li><li>DeFronzo, R. A., Tobin, J. D., Andres, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glucose+clamp+technique:+a+method+for+quantifying+insulin+secretion+and+resistance.">Glucose clamp technique: a method for quantifying insulin secretion and resistance.</a> American Journal of Physiology. 237 (3), 214-223 (1979).</li></ol>

Hücre dışı FD-glukoz tükenmesinin hücre kültüründe normalize hücre içi glukoz alımı ile doğrudan karşılaştırılması, hücre dışı glikoz tükenmesinin glikoz alım değerlendirmesi için vekil bir ölçüm olabileceğini düşündüren yüksek bir korelasyon göstermiştir. Hücre dışı FD-glukoz ölçümü çok çeşitli FD glukoz konsantrasyonlarını kullanabilir, ayrıca 0.5-2.5 μg FD-glukoz / mL'nin optimal aralığı sağladığı görülmektedir. Hücre dışı FD-glukoz, hücre içi FD-glu...

Glikoz alımını ölçme talebi, glikoz metabolizmasına bağlı çok sayıda hastalıkta salgın bir artışı ele alma konusundaki kritik ihtiyaçla birlikte artmaktadır. Dejeneratif metabolik hastalıkların altında yatan mekanizmalar, nörolojik ve bilişsel bozukluklar1, enflamatuar2 ve bulaşıcı hastalıklar3, kanser 4,5 ve yaşlanma6, enerji ve depolanması için glikoz metabolizmasına, anabolik süreçlere, proteine ve gen modifikasyonuna, sinyalleşmeye, genlerin düzenlenmesine ve nükleik asitlerin sentezi ve replikasyonuna bağlıdır 7,8,9 . Diabetes mellitus (DM), glukoz alım regülasyonunun arızalanması ile doğrudan ilişkilidir. DM, tip-1, -2 ve -3 diabetes mellitus, gestasyonel diyabet, gençlerin olgunluk başlangıçlı diyabeti ve bu hastalığın çevresel ve / veya genetik faktörlerin neden olduğu diğer türleri gibi kronik hastalıkların bir spektrumudur. 2016 yılında, diyabetle ilgili ilk DSÖ Küresel raporu, en yaygın DM ile yaşayan yetişkinlerin sayısının 1980'den bu yana neredeyse dört katına çıkarak 422 milyon yetişkine10 ulaştığını ve bu DM hastalarının sayısının son birkaç on yıldır katlanarak arttığını göstermiştir. Sadece 2019 yılında, 1,5 milyon ölüm tahmini doğrudan DM10'dan kaynaklandı. Bu dramatik yükseliş, tip-2 DM'deki artıştan ve aşırı kilolu ve obezite 10 dahil olmak üzere onu yönlendiren koşullardankaynaklanmaktadır. COVID-19 pandemisi, DM'li hastalarda mortalitede genel popülasyona kıyasla iki kat artış olduğunu ortaya koymuştur ve bu da glukoz metabolizmasının immün savunmadaki derin ancak tam olarak anlaşılmamış rolünü düşündürmektedir3. DM, obezite ve diğer hastalıkların önlenmesi, erken teşhisi ve tedavisi, farklı dokular tarafından glikoz alımının ölçümlerinin optimizasyonunu ve glukoz alımını etkileyen çevresel 11, beslenme 12, endokrin13, genetik14 ve epigenetik 15 faktörün tanımlanmasını gerektirir.
Araştırmada, hücre içi ve / veya doku glukoz alımı genellikle floresan olarak etiketlenmiş glikoz (FD-glukoz) in vitro 16,17,18 ve in vivo19 ile ölçülür. FD-glukoz, radyoaktif olarak etiketlenmiş glukoz 20, analitik kütle spektroskopisi analizi 21, metabolomik 22, nükleer manyetik rezonans yöntemleri23 ve pozitron emisyon tomografisi/bilgisayarlı tomografi (PET/BT)5,24 kullanılarak daha hassas yöntemlere kıyasla tercih edilen bir yöntem haline gelmiştir. FD-glikoz alımından farklı olarak, daha fazla biyolojik materyal gerektiren analitik yöntemler, çok adımlı bir numune hazırlama, pahalı aletler ve karmaşık veri analizini içerebilir. Hücre kültürlerinde FD-glikoz alımının etkili ve ucuz ölçümleri, kavram kanıtı deneylerinde kullanılmıştır ve diğer yöntemlerle doğrulama gerektirebilir.
Glukoz alım çalışmaları için FD-glukoz uygulamasının temeli, endojen glukoz25'e kıyasla FD-glukoz metabolizmasının azalmasıdır. Bununla birlikte, hem endojen glikoz hem de FD-glikoz, anabolik, katabolik ve sinyal süreçlerinde kullanılmak üzere tüm hücresel bölmeler arasında dinamik olarak dağıtılır. FD-glikozun bölümlendirilmesi ve zamana bağlı işlenmesi25 , floresan ölçümlerine müdahale eder ve bu tahlilin yüksek verimli tarama deneyleri, kinetik analiz, 3D hücre kültürü, ko-kültürler ve doku eksplant deneylerinde kullanımı için ana sınırlayıcı faktörleri temsil eder. Burada, FD-glukozun hücre dışı tükenmesi ile hücre içi alımı arasında yüksek bir korelasyon olduğunu gösteren veriler sunuyoruz, bu da FD-glukozun hücre içi glikoz alımı için vekil bir ölçüm olarak hücre dışı tükenmesini düşündürmektedir. Glikozun hücre dışı tükenmesinin ölçümü, insülin ile tedavi edilen farelerde glikoz alımındaki dokuya özgü farklılıkları doğrulamak için ve bu yöntemin bir ilke kanıtı sağlamak için deneysel bir ilaç18 uygulanmıştır.
Mevcut protokol, 3T3-L1 hücrelerinde FD-glukoz alımının hücre içi ve hücre dışı (Şekil 1) ölçümlerini tanımlamaktadır. Protokol bölümleri 1-7, 48 saat boyunca hücrelerin kültürünü ve büyümesini açıklar; hücre açlığı, stimülasyon ve temel hücre dışı ölçümler; ve hücre dışı FD-glukozun stimülasyon sonrası ölçümleri ve FD-glukoz ve proteinin hücre içi ölçümleri. Protokol bölüm 8, başka bir yerde tarif edilen insülin ve amino asit bileşiği 2'nin (AAC2) varlığı ve yokluğunda ob / ob farelerinden diseke edilen dokularda FD-glukozun hücre dışı alımının ex vivo ölçümünü açıklamaktadır18.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>3T3-L1 mouse fibroblasts</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CL-173</td>
			<td>Cell line</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plates</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353227</td>
			<td>Plastic ware</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B6.V-Lepob/J male mice</td>
			<td>Jackson Laboratory</td>
			<td>stock number 000632</td>
			<td>Mice</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BioTek Synergy H1 modular multimode microplate reader (Fisher Scientific, US)</td>
			<td>Fisher Scientific, US</td>
			<td>&#160;B-SHT</td>
			<td>Device</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum</td>
			<td>Gibco/ThermoFisher</td>
			<td>161790-060</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calf serum</td>
			<td>Gibco/ThermoFisher</td>
			<td>26010-066</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell incubator</td>
			<td>Forma</td>
			<td>Series II Water Jacket</td>
			<td>Device</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diet (mouse/rat diet, irradiated)</td>
			<td>Envigo</td>
			<td>Teklad LM-485</td>
			<td>Diet</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethylsulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Sigma LifeScience</td>
			<td>D2650-100mL</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium</td>
			<td>Gibco/ThermoFisher</td>
			<td>&#160;11965-092</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>E7023-500mL</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent 2-deoxy-2-[(7-nitro-2,1,3-benzoxadiazol-4-yl) amino]-D-glucose)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>72987-1MG</td>
			<td>Assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose-free and phenol red-free DMEM</td>
			<td>Gibco/ThermoFisher</td>
			<td>A14430-01</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human insulin 10 mg/mL</td>
			<td>MilliporeSigma, Cat N 91077C</td>
			<td>Cat N 91077C</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane, 5%</td>
			<td>Henry Schein</td>
			<td>NDC 11695-6776-2</td>
			<td>Anestaetic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/streptomycin (P/S)</td>
			<td>Gibco/ThermoFisher</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>DA537-500 mL</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce bicinchoninic acid (BCA) protein assay</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>Cat N23225</td>
			<td>Assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Radioimmunoprecipitation assay lysis buffer</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-24948</td>
			<td>Assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0.05%)</td>
			<td>Gibco/ThermoFisher</td>
			<td>&#160;25300-054</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

extracellular glucose depletion as an indirect measure of glucose uptake in cells and tissues ex vivo

Dünya çapında devam eden diyabet salgını, glikoz alımını etkileyen çevresel, beslenme, endokrin, genetik ve epigenetik faktörlerin tanımlanmasına olan talebi artırmaktadır. Hücre içi floresan ölçümü, in vitro hücrelerde floresan olarak etiketlenmiş glikoz (FD-glukoz) alımını test etmek veya glikoz tüketen dokuları in vivo olarak görüntülemek için yaygın olarak kullanılan bir yöntemdir. Bu tahlil, seçilen bir zaman noktasında glikoz alımını değerlendirir. Hücre içi analiz, FD-glikoz metabolizmasının, katabolik ve anabolik reaksiyonlara ve sinyalleşmeye katılan endojen glikozunkinden daha yavaş olduğunu varsayar. Bununla birlikte, dinamik glikoz metabolizması, farklı faktörlere yanıt olarak glikoz alımının kinetik ölçümlerini gerektiren alım mekanizmalarını da değiştirir. Bu makalede, hücre dışı FD-glukoz tükenmesini ölçmek için bir yöntem açıklanmakta ve hücre ve dokularda hücre içi FD-glukoz alımı ile korelasyonunu ex vivo olarak doğrulamaktadır. Hücre dışı glikoz tükenmesi, yüksek verimli kinetik ve doza bağımlı çalışmaların yanı sıra glisemik aktiviteye sahip bileşikleri ve dokuya özgü etkilerini tanımlamak için potansiyel olarak uygulanabilir.

İnsülin stimülasyonu olan ve olmayan farklı FD-glukoz konsantrasyonlarına yanıt olarak 3T3-L1 preadipositlerde hücre içi alım ve hücre dışı glukoz tükenmesi ölçüldü (Şekil 2). Şekil 2A , insülin varlığında önemli ölçüde artmış olan FD-glukozun hücre içi alımında doza bağlı bir artış göstermektedir. Aynı hücrelerde hücre dışı FD-glukozdaki eşzamanlı azalma, insülin stimülasyonunun insülin stimülasyonu olmayan ör...

Watch this Scientific Journal Video about Extracellular Glucose Depletion as an Indirect Measure of Glucose Uptake in Cells and Tissues Ex Vivo at JoVE.com

Extracellular Glucose Depletion as an Indirect Measure of Glucose Uptake in Cells and Tissues Ex Vivo

Floresan olarak etiketlenmiş glikozun hücre dışı tükenmesi, glikoz alımı ile ilişkilidir ve eksize edilmiş organlarda ve hücre kültürlerinde glikoz alımının yüksek verimli taranması için kullanılabilir.

Ex Vivo'da Hücrelerde ve Dokularda Glikoz Alımının Dolaylı Bir Ölçüsü Olarak Hücre Dışı Glikoz Tükenmesi

The ongoing worldwide epidemic of diabetes increases the demand for the identification of environmental, nutritional, endocrine, genetic, and epigenetic ...

Glikoz alımı, sağlığı ve hastalığı anlamanın anahtarıdır. Glikoz, insan vücudundaki metabolik ve yapısal taleplerde çok önemli bir rol oynadığından, aynı zamanda düzenlemede hayati bir rol oynamaktadır. Glikozun hücre dışı ölçümü, besin maddelerine veya ilaçlara yanıt olarak farklı genetik geçmişe sahip hücrelerde, dokularda ve organlarda glikoz alımının kinetiği için yüksek verimli testlerin geliştirilmesine izin verir.Bu tahlil, diyabet, kanser, merkezi sinir sisteminin dejeneratif hastalıkları, obezite ve tüm glikoz ve metabolizma hastalıkları için terapötiklerin ve beslenmenin keşfi için değerli bir araç olacaktır. Tahlil, farklı dokular ve hücre kültürleri için metabolik özelliklere dayanması gereken açlık ve stimülasyon için zamanın ayarlanmasına ihtiyaç duyar. Kültür 3T3-L1 fare fibroblastları, 10'u 6 hücreye kaplayarak 296 kuyu plakasında 20 mililitre orta 1'de seyreltilir.Plaka kuyu başına 100 mikrolitre hücre süspansiyonu, bu süspansiyonun homojenliğini karıştırmak suretiyle korunmasını sağlar. 37 santigrat derecelik bir inkübatörde 48 saat boyunca hücreleri, yaklaşık% 70 ila% 80 akıcıya kadar ortam değiştirmeden büyütün. Hücreleri 48 saat boyunca aynı ortamda kültürleyerek akıcı ve oruç tutun.İstenilen açlık katabolik durumuna bağlı olarak kuluçka süresini 24 ila 72 saat arasında değiştirin. 96 kuyu plakasındaki hücrelerden gelen dekant ortam. Steril kağıt havlular kullanarak kalan sıvıyı emer.96 kuyucuklu plakayı kuyu başına 100 mikrolitre PBS ile durulayın ve kalan sıvıyı steril kağıt havlularla emer. Kuyu başına 100 mikrolitre glikozsuz DMEM ekleyin ve 40 dakika kuluçkaya yatırın. Kuluçka süresini hücre tipi uyaranlara ve istenen açlık seviyesine bağlı olarak ayarlayın.Her simülasyon koşulu için sekiz çoğaltma kullanın. Bu nedenle, her simülasyon koşulu için bir mililitre hazırlayın. İnsülin olmadan yedi simülasyon koşulu kullanın.FD glikoz mililitre başına 2.5 mikrogram, mililitre başına 1 mikrogram, mililitre başına 0.5 mikrogram, mililitre başına 0.2 mikrogram, mililitre başına 0.1 mikrogram, mililitre başına 0.05 mikrogram ve 196 kuyu plakasında mililitre başına 0 miligram. İnsülin ile yedi stimülasyon koşulu kullanın. FD glikozu mililitre başına 2.5 mikrogram, mililitre başına 1 mikrogram, mililitre başına 0.5 mikrogram, mililitre başına 0.2 mikrogram, mililitre başına 0.1 mikrogram, mililitre başına 0.05 mikrogram ve başka bir 96 kuyu plakasında mililitre başına 0 mikrogramdır.Stimülasyon koşullarını hazırlamak için, mililitre FD glikoz çalışma çözeltisi başına bir mikrolitre beş miligram ve bir mililitre çalışma stoğu çözeltisi elde etmek için 999 mikrolitre glikozsuz DMEM seyreltin. Bu çalışma stoğu çözeltisini kullanarak, mililitre başına 2.5 mikrogram, mililitre başına 1 mikrogram, mililitre başına 0.5 mikrogram, mililitre başına 0.5 mikrogram, mililitre başına 0.5 mikrogram, mililitre başına 0.2 mikrogram, mililitre başına 0.1 mikrogram, mililitre başına 0.1 mikrogram, mililitre başına 0.2 mikrogram, mililitre başına 0.1 mikrogram elde etmek için 1 ila 25, 000, 1 ila 25, 000, 1 ila 50, 000 ve 1 ila 100.000 FD glikoz sanrısı hazırlayın. Işıksız bir biyogüvenlik kabininde yapılan deneylerden hemen önce iki mililitrelik tüplerde mililitre başına 0.05 mikrogram. Bu koşulların her birine bir mikrolitre insülin ekleyin.40 dakikalık inkübasyondan sonra, glikozsuz DMEM'yi 96 kuyucuk plakasında her bir kuyucuktan boşaltın ve kalan sıvıyı steril kağıt havlularla emer. Daha önce açıklanan çeşitli tedavi koşullarından her biri 100 mikrolitreyi, bir sütun boyunca kuyucuklara ekleyin. Ve aynı işlem koşulundan 100 mikrolitre, her iki 96 duvar plakasındaki sıra boyunca kuyucuklara.Koşulları kullanan plakaları, insülinli ve insülinsiz olarak etiketleyin. Kontrol kuyularına tek başına glikozsuz DMEM ekleyin. Plakayı karanlıkta hücre kültürü inkübatöründe 40 dakika boyunca inkübe edin.Hücreler 40 dakika boyunca uyarıldıktan sonra. Stimülasyon ortamını her iki plakadan yeni 96 kuyu plakasına aktarın ve aynı deneysel düzeni koruyun. Hücreleri PBS ile yıkayın.PBS'yi çıkarın ve steril kağıt havluların üzerinde kalan solüsyonu boşaltın. Proteinleri korumak için radyo immünopresipitasyon testi tamponuna bir proteaz inhibitörü ekleyin. Radyo immünopresipitasyon testi içeren plakaları 30 dakika boyunca bir çalkalayıcıya yerleştirin.Bir mikroplaka okuyucu kullanarak, uyarılmada floresan ve sırasıyla 485 ve 535 nanometrede emisyon dalga boylarını ölçün. İlk önce hücre dışı FD glikoz içeren ortamda, daha sonra radyoimmünopresipitasyon tahlili plaka, 30 dakikalık inkübasyonun sonunda hücreleri lize etti. BCA protein testini üreticinin talimatlarına göre yapın.Radyo immünopresipitasyon tahlili lize edilmiş hücreler içeren her kuyucuktaki protein konsantrasyonlarını sayısallaştırın. 10 mikrolitre radyo immünopresipitasyon testi homojenatı kullanın ve protein konsantrasyonlarını ölçün ve 96 kuyu plakasındaki ölçümlerin doğruluğunu artırmak için üçe katlayın. Her 96 kuyu plakasındaki örneklerle birlikte analiz edilen protein standartlarına göre proteini sayısallaştırın.Hasat edilen dokuları veya organları PBS içeren altı kuyucuklu bir plakada bir dakika boyunca inkübe edin. Her doku veya organı ayrı bir kuyuda tutun. Bir dakika sonra, PBS'yi emmek için her bir mendili steril bir kağıt havluya yerleştirin.Dokuları veya organları 4.000 mikrolitre glikozsuz DMEM içeren ayrı bir altı duvar plakasına aktarın ve iki dakika boyunca inkübe edin. İki dakika sonra, dokuları çıkarın ve 0.29 Milimolar FD glikoz çalışma çözeltisi içeren altı kuyucuklu bir plakanın kuyucuklarına aktarın. FD glikoz çalışma çözeltisindeki dokuları içeren altı kuyucuk plakasını 37 santigrat derecede inkübe edin.0, 10, 20, 30, 40, 60, 90 ve 120 dakikalık inkübasyondan sonra her kuyucuktan 100 mikrolitre FD glikoz çalışma çözeltisi toplayın ve toplanan 100 mikrolitre FD glikoz çalışma çözeltisini, hücre dışı FD glikoz tükenmesinin kinetiğini analiz etmek için 96 kuyucuk plakasına aktarın. Toplamadan önce ve sonra sallayın. Bir mikroplaka okuyucu kullanarak sırasıyla 485 ve 535 nanometrede emisyon dalga boylarında uyarma sırasında floresanı ölçün.İnsülin varlığında FD glukozun hücre içi alımında doz bağımlılığı anlamlı olarak artmıştır. İnsülin stimülasyonu, insülin stimülasyonu olmayan örneklere kıyasla hücre dışı FD glukoz düzeylerinin önemli ölçüde azalmasına neden oldu. FD glukozun hücre dışı tükenmesi, glikoz alımındaki bir değişikliği, hücre içi FD glikoz alımı ile karşılaştırılabilir doğrulukla ölçebilir.Hücre dışı FD glukoz, 120 dakikalık inkübasyon sırasında uyarılmamış kontrol viseral yağında tükenmedi. Buna karşılık, diseksiyondan önce farelerin insülin veya AAC2 ile ön muamelesi, sırasıyla 30 dakika ve 60 dakikalık bir zaman aralığında hücre dışı FD glikozunun önemli ölçüde tükenmesine yol açmıştır. İnsülin ile uyarılmış karaciğer eksplantlarında hücre dışı FD glukoz, uyarılmamış karaciğer eksplantlarına kıyasla tükenmemiştir.Hücre dışı FD glukozu zamana bağlı olarak anlamlı derecede azaldı ve AAC2.22% ile önceden muamele edilmiş karaciğer eksplantları, 60 dakikalık inkübasyondan sonra tedavi edilmemiş beyni içeren hücre dışı ortamda glikozun tükenmesi gözlendi. İnsülin ile tedavi edilen farelerden beyinlerle inkübe edilen ortam, FD glikozunda% 5'lik doğrusal bir düşüş göstermiştir. AAC2 ile uyarılmış beyinler, ilk 20 dakika boyunca hücre dışı FD glikozunun% 67.4'üne kadar derin bir hızlı düşüşe yol açtı.Yıkama içeren madde, ortam ve veya organlardaki glikoz, kan veya serum izlerini gidermek için özellikle önemlidir, çünkü bu ortamların floresan okumasına müdahale edebilir. Glisemik özelliklere sahip genlerdeki metabolit bileşiklerinin yüksek verimle tanımlanmasından ve in vivo deneylerdeki eylemleri için en uygun koşullardan sonra, belirli organlarda glikoz birikimini doğrulamak için etiketli FD glikoz ve PET taraması ile doğrulanabilir. Glisemik etkinin keşfi için bu teknik, hem çok sayıda metabolitin, terapötiklerin veya bunların kombinasyonlarının silinmesinde faydalıdır hem de farklı organlardaki etkilerini vurgular.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Extracellular Glucose Depletion as an Indirect Measure of Glucose Uptake in Cells and Tissues Ex Vivo

A Method for Measuring RNA N6-methyladenosine Modifications in Cells and Tissues

A Method for Measuring RNA N6-methyladenosine Modifications in Cells and Tissues

RNA ölçülmesi için bir yöntem<em&gt; K</em<sup&gt; 6</supHücre ve dokularda&gt; -methyladenosine Değişiklikler

N6-Methyladenosine (m6A) modifications of RNA are diverse and ubiquitous amongst eukaryotes. They occur in mRNA, rRNA, tRNA, and microRNA. Recent studies ...

Brain Membrane Fractionation: An Ex Vivo Approach to Assess Subsynaptic Protein Localization

Brain Membrane Fractionation: An Ex Vivo Approach to Assess Subsynaptic Protein Localization

Beyin Membranı Fraksiyonu: Bir<emEx Vivo</em&gt; Subsınaptik Protein Lokalizasyonunu Değerlendirmede Yaklaşım

Assessing the synaptic protein composition and function constitutes an important challenge in neuroscience. However, it is not easy to evaluate ...

Dissipative Microgravimetry to Study the Binding Dynamics of the Phospholipid Binding Protein Annexin A2 to Solid-supported Lipid Bilayers Using a Quartz Resonator

A2 bir kuvars rezonatör kullanarak katı destekli Lipid Bilayers için Annexin Protein bağlayıcı fosfolipid bağlama dinamikleri çalışmaya dissipative Microgravimetry

The dissipative quartz crystal microbalance technique is a simple and label-free approach to measure simultaneously the mass uptake and viscoelastic ...

Analysis of Endocytic Uptake and Retrograde Transport to the Trans-Golgi Network Using Functionalized Nanobodies in Cultured Cells

Endositik alımını ve kültürlü hücrelerde Functionalized Nanobodies kullanarak Trans-Golgi ağına retrograd taşıma analizi

Transport of proteins and membranes from the cell surface to the Golgi and beyond is essential for homeostasis, organelle identity and physiology. To ...

Atomic Absorbance Spectroscopy to Measure Intracellular Zinc Pools in Mammalian Cells

Mammalin hücrelerinde hücre Içi çinko havuzlarını ölçmek için atomik absorbance spektroskopisi

Transition metals are essential micronutrients for organisms but can be toxic to cells at high concentrations by competing with physiological metals in ...

Quantification of Coenzyme A in Cells and Tissues

Hücre ve Dokularda Koenzim A'nın Sayısallaştırılması

Emerging research has revealed that the cellular coenzyme A (CoA) supply can become limiting with a detrimental impact on growth, metabolism and survival. ...

An Integrated Raman Spectroscopy and Mass Spectrometry Platform to Study Single-Cell Drug Uptake, Metabolism, and Effects

Tek Hücreli İlaç Alımı, Metabolizması ve Etkileri Üzerine Entegre Raman Spektroskopisi ve Kütle Spektrometresi Platformu

Cells are known to be inherently heterogeneous in their responses to drugs. Therefore, it is essential that single-cell heterogeneity is accounted for in ...

Using an Extracellular Flux Analyzer to Measure Changes in Glycolysis and Oxidative Phosphorylation during Mouse Sperm Capacitation

Fare Sperm Kapasasyonu Sırasında Glikoliz ve Oksidatif Fosforilasyondaki Değişiklikleri Ölçmek için Hücre Dışı Akı Analizörü Kullanma

Mammalian sperm acquire fertilization capacity in the female reproductive tract in a process known as capacitation. Capacitation-associated processes ...

Ex Vivo Hepatic Perfusion Through the Portal Vein in Mouse

Ex Vivo Hepatic Perfusion Through the Portal Vein in Mouse

Eski Vivo Farede Portal Damarından Hepatik Perfüzyon

Metabolic diseases such as diabetes, pre-diabetes, non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD), and nonalcoholic steatohepatitis (NASH) are becoming ...

Stable Isotope Tracing & LC-MS Analysis to Measure DHODH and SDH Activities

Oxygen-Independent Assays to Measure Mitochondrial Function in Mammals

Oxygen-Independent Assays to Measure Mitochondrial Function in Mammals (Video) | JoVE 

Memelilerde Mitokondriyal Fonksiyonu Ölçmek için Oksijenden Bağımsız Tahliller

The flow of electrons in the mitochondrial electron transport chain (ETC) supports multifaceted biosynthetic, bioenergetic, and signaling functions in ...