Name: isolation of intrapulmonary artery and smooth muscle cells to investigate vascular responses
Uploaded: 2022-06-08T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Intrapulmonary Artery and Smooth Muscle Cells to Investigate Vascular Responses at JoVE.com

يود المؤلفون أن ينحبوا بالمجلس الوطني للبحوث في تايلاند ، ومركز التميز للابتكار في الكيمياء (PERCH-CIC) ، وشبكة البحوث الدولية (IRN61W0005) لتقديمهم الدعم المالي ، وقسم علم وظائف الأعضاء كلية العلوم الطبية ، جامعة ناريسوان ، لدعم مرفق البحوث.

تمت الموافقة على التجارب التي أجريت في هذه الدراسة من قبل لجنة الأخلاقيات التابعة للجنة رعاية واستخدام الحيوانات بجامعة ناريسوان (NUACUC) ، رقم البروتوكول NU-AE620921 ، لرعاية واستخدام الحيوانات للأغراض العلمية.
1. تكوين الحلول الفسيولوجية
<ol><li>قم بصياغة محلول كريبس عن ط?...

<ol>
	<li>Lyle, M. A., Davis, J. P., Brozovich, F. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+pulmonary+vascular+smooth+muscle+contractility+in+pulmonary+arterial+hypertension:+Implications+for+therapy.">Regulation of pulmonary vascular smooth muscle contractility in pulmonary arterial hypertension: Implications for therapy.</a> Frontiers in Physiology. 8, 614 (2017).</li><li>Cyr, A. R., Huckaby, L. V., Shiva, S. S., Zuckerbraun, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nitric+oxide+and+endothelial+dysfunction.">Nitric oxide and endothelial dysfunction.</a> Critical Care Clinics. 36 (2), 307-321 (2020).</li><li>Ruan, K. -. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advance+in+understanding+the+biosynthesis+of+prostacyclin+and+thromboxane+A2+in+the+endoplasmic+reticulum+membrane+via+the+cyclo-oxygenase+pathway.">Advance in understanding the biosynthesis of prostacyclin and thromboxane A2 in the endoplasmic reticulum membrane via the cyclo-oxygenase pathway.</a> Mini Reviews in Medicinal Chemistry. 4 (6), 639-647 (2004).</li><li>Del Pozo, R., Hernandez Gonzalez, I., Escribano-Subias, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+prostacyclin+pathway+in+pulmonary+arterial+hypertension:+A+clinical+review.">The prostacyclin pathway in pulmonary arterial hypertension: A clinical review.</a> Expert Review of Respiratory Medicine. 11 (6), 491-503 (2017).</li><li>Morgado, M., Cairr&#227;o, E., Santos-Silva, A. J., Verde, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cyclic+nucleotide-dependent+relaxation+pathways+in+vascular+smooth+muscle.">Cyclic nucleotide-dependent relaxation pathways in vascular smooth muscle.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 69 (2), 247-266 (2012).</li><li>Schmidt, K., de Wit, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelium-derived+hyperpolarizing+factor+and+myoendothelial+coupling:+The+in+vivo+perspective.">Endothelium-derived hyperpolarizing factor and myoendothelial coupling: The in vivo perspective.</a> Frontiers in Physiology. 11, (2020).</li><li>Fan, G., Cui, Y., Gollasch, M., Kassmann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elementary+calcium+signaling+in+arterial+smooth+muscle.">Elementary calcium signaling in arterial smooth muscle.</a> Channels. 13 (1), 505-519 (2019).</li><li>Wisutthathum, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extract+of+Aquilaria+crassna+leaves+and+mangiferin+are+vasodilators+while+showing+no+cytotoxicity.">Extract of Aquilaria crassna leaves and mangiferin are vasodilators while showing no cytotoxicity.</a> Journal of Traditional and Complementary Medicine. 9 (4), 237-242 (2019).</li><li>Kamkaew, N., Paracha, T. U., Ingkaninan, K., Waranuch, N., Chootip, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vasodilatory+effects+and+mechanisms+of+action+of+Bacopa+monnieri+active+compounds+on+rat+mesenteric+arteries.">Vasodilatory effects and mechanisms of action of Bacopa monnieri active compounds on rat mesenteric arteries.</a> Molecules. 24 (12), 2243 (2019).</li><li>Chootip, K., Kennedy, C., Gurney, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+P2+receptors+mediating+contraction+of+the+rat+isolated+pulmonary+vasculature.">Characterization of P2 receptors mediating contraction of the rat isolated pulmonary vasculature.</a> British Journal of Pharmacology. 131, 167 (2000).</li><li>Paracha, T. U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elucidation+of+vasodilation+response+and+structure+activity+relationships+of+N2,+N4-disubstituted+quinazoline+2,+4-diamines+in+a+rat+pulmonary+artery+model.">Elucidation of vasodilation response and structure activity relationships of N2, N4-disubstituted quinazoline 2, 4-diamines in a rat pulmonary artery model.</a> Molecules. 24 (2), 281 (2019).</li><li>Chootip, K., Gurney, A. M., Kennedy, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+P2Y+receptors+couple+to+calcium-dependent,+chloride+channels+in+smooth+muscle+cells+of+the+rat+pulmonary+artery.">Multiple P2Y receptors couple to calcium-dependent, chloride channels in smooth muscle cells of the rat pulmonary artery.</a> Respiratory Research. 6 (1), 1-10 (2005).</li><li>Wisutthathum, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Eulophia+macrobulbon+extract+relaxes+rat+isolated+pulmonary+artery+and+protects+against+monocrotaline-induced+pulmonary+arterial+hypertension.">Eulophia macrobulbon extract relaxes rat isolated pulmonary artery and protects against monocrotaline-induced pulmonary arterial hypertension.</a> Phytomedicine. 50, 157-165 (2018).</li><li>Kruangtip, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Curcumin+analogues+inhibit+phosphodiesterase-5+and+dilate+rat+pulmonary+arteries.">Curcumin analogues inhibit phosphodiesterase-5 and dilate rat pulmonary arteries.</a> Journal of Pharmacy and Pharmacology. 67 (1), 87-95 (2015).</li></ol>

في هذه المخطوطة ، نصف تقنية عزل IPA و VSMCs الفئران. تم استخدام العديد من البروتوكولات التجريبية للتحقيق في الاستجابة الوعائية ل IPA في المختبر ، والتي يمكن استخدامها لتوصيف التأثير الدوائي والأساس الميكانيكي ل IPA للأوعية الدموية الناجم عن المستخلصات النباتية.
فيما يتعلق ب?...

الأوعية الدموية الرئوية هي نظام وعائي منخفض الضغط تتمثل وظيفته الرئيسية في توصيل الدم غير المؤكسج إلى منطقة تبادل الغاز في الرئتين. يتم ترتيب الشرايين الرئوية في الرئتين في فروع موازية لشجرة الشعب الهوائية ، مما يشكل في النهاية شبكة واسعة من الشعيرات الدموية المستمرة على عدة حويصلات هوائية ، وأخيرا ، تجتمع معا في الأوردة والأوردة. يتم التحكم في نغمة الأوعية الدموية للشريان الرئوي من خلال عدة عوامل، بما في ذلك التفاعل بين البطانة وخلايا العضلات الملساء الوعائية (VSMCs)1.
في هذه الدراسة ، نركز على الاسترخاء الوعائي المعتمد على البطانة والمستقلة للشريان داخل الرئة (IPA). فيما يتعلق باسترخاء الأوعية المعتمد على البطانة، يمكن للآليات المختلفة التي تحدث على سطح الخلايا البطانية أن تزيد من تركيز Ca2+ داخل الخلايا (على سبيل المثال، يرتبط الأسيتيل كولين [ACh] بمستقبلات المسكارينية [M3])، مما يؤدي إلى تكوين أكسيد النيتريك (NO) والبروستاسيكلين (PGl2) وعامل فرط الاستقطاب المشتق من البطانة (EDHF) (الشكل 1) ). NO هو عامل الاسترخاء الرئيسي المشتق من البطانة والذي يتم تصنيعه من L-arginine بواسطة سينثاز أكسيد النيتريك البطاني (eNOS)2 ، والذي ينفصل بعد ذلك عن الخلايا البطانية إلى VSMCs (الشكل 1) ويحفز إنزيم guanylyl cyclase (sGC) القابل للذوبان ؛ يغير هذا الإنزيم الجوانوزين ثلاثي الفوسفات (GTP) إلى أحادي فوسفات غوانوزين دوري (cGMP) ، مما ينشط بروتين كيناز G (PKG) ويقلل من مستويات Ca2+ الخلوية ، مما يسبب استرخاء الأوعية (الشكل 1). يتم تصنيع PGl2 بواسطة الخلايا البطانية عبر مسار سيكلو-أوكسيجيناز (COX) 3,4. يرتبط بمستقبلات البروستاسيكلين (IP) على VSMCs ويحفز إنزيم أدينيل سيكلاز (AC) ، الذي يحول بعد ذلك الأدينوسين ثلاثي الفوسفات (ATP) إلى أحادي فوسفات الأدينوسين الدوري (cAMP) (الشكل 1) 3,4. ينشط cAMP بروتين كيناز A (PKA) ، مما يقلل من مستويات Ca2+ الخلوية ويسبب استرخاء الأوعية5 (الشكل 1). يشارك مسار EDHF أيضا في استرخاء الأوعية المعتمد على البطانة من خلال العديد من الوسطاء البطانيين والأحداث الكهربائية. يؤدي تنشيط مسار EDHF إلى فرط استقطاب VSMCs ، وبالتالي إغلاق قنوات Ca 2 + التي تعمل بالجهد (VOCCs) ، وتقليل مستويات Ca2 + داخل الخلايا ، وتحفيز استرخاء الأوعية6. يحدث استرخاء الأوعية المستقل عن البطانة مباشرة على VSMCs عبر عدة آليات ، مثل تقليل مستوى Ca 2 + داخل الخلايا ، وتثبيط كيناز سلسلة ضوء الميوسين (MLCK) ، وتنشيط فوسفاتيز سلسلة ضوء الميوسين (MLCP) ، والحد من حساسية Ca2 + للآلات الانقباضية ل VSMCs. في هذه الدراسة ، نركز على استرخاء الأوعية الناجم عن فتح قنوات K + المختلفة ، وحصار المركبات العضوية المتطايرة ، وتثبيط إطلاق Ca 2 + من الشبكة الساركوبلازمية7 ، مما يؤدي إلى تقليل مستويات Ca 2 + داخل الخلايا ، وبالتالي تقليل فسفرة سلسلة ضوء VSMC myosin وربط الميوسين أكتين أو تكوين عبر الجسور ، على التوالي ، مما يؤدي في نهاية المطاف إلى استرخاء الأوعية.
إن تقنية تقييم قياسات تضيق الأوعية واسترخاء الأوعية في IPA المعزولة راسخة جيدا للقوارض ، لكن البيانات تختلف اعتمادا على البروتوكولات التجريبية. تصف هذه الدراسة الطريقة المستخدمة لتقييم التفاعلات الوعائية لمستحضرات IPA للفئران في المختبر ، والتي تم إجراؤها في غياب عوامل خارجية تعدل استجابة الأوعية الدموية في الجسم الحي ، مثل الإشارات العصبية والهرمونات والسيتوكينات وضغط الدم ، إلخ.
استخدمنا العديد من البروتوكولات التجريبية باستخدام المستخلص النباتي كمثال لدراسة التفاعلات الوعائية ل IPA. تم استخدام حاصرات مختلفة (الشكل 1) لتحديد آليات استرخاء الأوعية المعتمد على البطانة والمستقلة التي يسببها المستخلص النباتي. ومع ذلك ، يمكن تكييف نفس البروتوكولات لتقييم استجابات الأوعية الدموية ل IPA لأي أدوية أو مستخلصات أو مواد كيميائية نباتية تستخدم لعلاج الأمراض الرئوية المختلفة.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1,4-dithiothreitol (DTT)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D0632 
			CAS NO. 348-12-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-aminopyridine (4-AP)</td>
			<td>Aldrich Chemical</td>
			<td>A78403 
			CAS NO. 504-24-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetylcholine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A6625 
			CAS NO. 60-31-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Apamin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9459 
			CAS NO. 24345-16-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A2153 
			CAS NO. 9048-46-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium choride</td>
			<td>Ajax Finechem</td>
			<td>AJA960 
			CAS NO. 1707055184</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Charybdotoxin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C7802 
			CAS NO. 95751-30-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase type 1A</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C9891 
			CAS NO. 9001-12-1</td>
			<td>From Clostridium histolyticum</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D(+)-Glucose monohydrate</td>
			<td>Millipore Corporation</td>
			<td>K50876942 924 
			CAS NO. 14431-43-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D4540 
			CAS NO. 67-68-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylene glycol-bis (2-aminoethylether)-N,N,N&#8217;,N&#8217;-tetraacetic acid (EGTA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E3889 
			CAS NO. 67-42-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E9884 
			CAS NO. 60-00-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps 11 cm.</td>
			<td>Rustless Dumoxel</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps 14 cm.</td>
			<td>Rustless Dumoxel</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glibenclamide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G6039 
			CAS NO. 16673-34-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GraphPad Prism program</td>
			<td>Software version 5.0 (San Diego, CA, USA)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H3375 
			CAS NO. 7365-45-9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iberiotoxin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I5904 
			CAS NO. 1002546960</td>
			<td>recombinant from Mesobuthus tamulus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Indomethacin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I7378 
			CAS NO. 53-86-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Labchart Program</td>
			<td>Software version 7.0 (A.D. Instrument, Castle Hill, Australia).</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride</td>
			<td>Ajax Finechem</td>
			<td>296 
			CAS NO. 1506254995</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Male Wistar rats</td>
			<td>Nomura Siam International Co. Ltd., Bangkok, Thailand</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NG-nitro-L-arginine methyl ester (L-NAME)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>N5751 
			CAS NO. 51298-62-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nicardipine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>N7510 
			CAS NO. 54527-84-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Organ bath 15 mL.</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Specific order by the researchers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Papain</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4762 
			CAS NO. 9001-73-4</td>
			<td>FromPapaya Latex</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenal red</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5530 
			CAS NO. 34487-61-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenylephrine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P6126 
			CAS NO. 61-76-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>Kemaus</td>
			<td>KA383 
			CAS NO. 7447-40-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium dihydrogenphosphate</td>
			<td>Aldrich Chemical</td>
			<td>EC231-913-4 
			CAS NO. 7778-77-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>S+A2:E36odium chloride</td>
			<td>Kemaus</td>
			<td>KA465 
			CAS NO. 7647-14-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissors 11 cm.</td>
			<td>Spall Stainless</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissors 14 cm.</td>
			<td>Spall Stainless</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium bicarbonate</td>
			<td>Ajax Finechem</td>
			<td>475 
			CAS NO. 912466</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dihydrogenphosphate</td>
			<td>Aldrich Chemical</td>
			<td>33,198-8 
			CAS NO. 7558-80-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide</td>
			<td>Ajax Finechem</td>
			<td>482 
			CAS NO. 1506196602</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium thiopental</td>
			<td>Anesthal</td>
			<td>JPN3010002 
			CAS NO. 1C 314/47</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taurine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T0625 
			CAS NO. 107-35-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Waterbath WBU 45</td>
			<td>Memmert</td>
			<td>2766 
			CAS NO. -</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of intrapulmonary artery and smooth muscle cells to investigate vascular responses

يمكن استخدام الشريان الرئوي (IPA) وخلايا العضلات الملساء الوعائية (VSMCs) المعزولة من رئتي الفئران لدراسة الآليات الأساسية لتضيق الأوعية واسترخاء الأوعية. بعد عزل IPA و VSMCs ، يمكن تقييم خصائص الاستجابات الوعائية في الحالات الفسيولوجية والمرضية في غياب العوامل الخارجية مثل الإشارات العصبية والهرمونات والسيتوكينات ، إلخ. وبالتالي ، فإن IPA و VSMCs بمثابة نماذج ممتازة لدراسة فسيولوجيا الأوعية الدموية / الفيزيولوجيا المرضية ، إلى جانب العديد من التحقيقات التجريبية ، مثل التعديل بواسطة العوامل الدوائية ، والتحليل الكهروفسيولوجي المشبك الرقعة ، وتصوير الكالسيوم ، وما إلى ذلك. هنا ، استخدمنا تقنية لعزل IPA للتحقيق في استجابات الأوعية الدموية في إعداد حمام الأعضاء. تم تركيب أجزاء IPA على غرفة حمام الأعضاء عبر أسلاك داخل اللمعان وتحفيزها بواسطة عوامل دوائية مختلفة. تم تسجيل التغيرات في نغمة الأوعية الدموية IPA (أي تضيق الأوعية واسترخاء الأوعية) ، باستخدام محول طاقة متساوي القياس وبرنامج تحليل البيانات الفسيولوجية. قمنا بتنفيذ العديد من البروتوكولات التجريبية ، والتي يمكن تكييفها للتحقيق في آليات استرخاء الأوعية / تضيق الأوعية لدراسة الأنشطة الدوائية للعقاقير الكيميائية النباتية أو الاصطناعية. ويمكن أيضا استخدام البروتوكولات لتقييم أدوار الأدوية في تعديل الأمراض المختلفة، بما في ذلك ارتفاع ضغط الدم الشرياني الرئوي. يسمح لنا نموذج IPA بالتحقيق في منحنى التركيز والاستجابة ، وهو أمر بالغ الأهمية في تقييم المعلمات الدوائية الديناميكية للأدوية.

تم تطوير البروتوكول في هذه الدراسة لتحديد الظروف التجريبية المثلى لقياس الظواهر الفسيولوجية التي لوحظت في الاستجابات الوعائية لمستحضرات IPA المعزولة. تم إجراء التجارب التجريبية لوصف النتائج المحتملة التي تساعد على فهم التأثيرات الوعائية والأساس الميكانيكي للعمل المرخي للأوعية الدموية ...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Intrapulmonary Artery and Smooth Muscle Cells to Investigate Vascular Responses at JoVE.com

Isolation of Intrapulmonary Artery and Smooth Muscle Cells to Investigate Vascular Responses

يمكن استكشاف الاستجابات الوعائية للدورة الدموية الرئوية الشريانية باستخدام الشريان الرئوي (IPA) وخلايا العضلات الملساء الوعائية (VSMCs). تصف هذه الدراسة عزل IPA بالتفصيل والبروتوكولات المستخدمة للتحقيق في استرخاء الأوعية استجابة للمحفزات الفسيولوجية.

عزل الشريان الرئوي وخلايا العضلات الملساء للتحقيق في استجابات الأوعية الدموية

The intrapulmonary artery (IPA) and vascular smooth muscle cells (VSMCs) isolated from rat lungs can be used to study the underlying mechanisms of ...

تصف هذه الدراسة عزل الشريان الرئوي للفئران وخلايا العضلات الملساء الوعائية. تم استخدام العديد من البروتوكولات التجريبية ، مثل استخدام تقنية حمام الأعضاء للتحقيق في استجابة الأوعية الدموية للشريان داخل الرئة. الشرايين داخل الرئة وخلايا العضلات الملساء الوعائية هي نماذج ممتازة لدراسة فسيولوجيا الأوعية الدموية والفيزيولوجيا المرضية.يمكن لتعديلات هذه التقنية تقييم استجابات الأوعية الدموية لأي أدوية أو مستخلصات أو مواد كيميائية نباتية. يتيح تركيب الحلقة الشريانية داخل الرئة المعزولة في حمام الأعضاء استخدام الشرايين المعزولة داخل الرئة لتقييم دور الدواء في تعديل الأمراض المختلفة ، بما في ذلك ارتفاع ضغط الدم الرئوي. البروتوكولات التجريبية ممكنة تقنيا ، لكن الخطوات الحاسمة معقدة وضرورية للنجاح ، لذا فإن وجود عرض مرئي يجعل من السهل فهمها ومتابعتها.ومن بين المشاركين في هذا الإجراء Kittiwoot To-on، وهو طالب ماجستير في علم وظائف الأعضاء من مختبر وحدة أبحاث القلب والأوعية الدموية، قسم علم وظائف الأعضاء، كلية العلوم الطبية، جامعة ناريسوان. ابدأ بتقطيع فص واحد من الرئة بمقص طوله 11 سم ووضعه على طبق بتري بطول تسعة سنتيمترات مع الجانب الإنسي ، أو جذر الرئة ، متجها لأعلى. مراقبة وتحديد محاذاة الوريد والشعب الهوائية والشريان من أعلى إلى أسفل.قطع فتح الشعب الهوائية طوليا مع مقص. ثم استخدم ملقط 11 سم للاستيلاء على طرف الشعب الهوائية. تشريح بلطف وإزالة الشعب الهوائية والأوردة من الرئة.استخدم الملقط للاستيلاء على طرف الشريان داخل الرئة وتشريحه بعناية من أنسجة الرئة باستخدام المقص. احتفظ بالشريان الرئوي المعزول في محلول كريبس البارد حتى يتم إعداد مجموعة حمام الأعضاء. بعد عزل الشريان داخل الرئة ، قم بقطع الفرع الرئيسي للشريان داخل الرئة طوليا باستخدام مقص 11 سم وقطعه إلى شرائط بمليمترين.اغمر شرائط الشريان داخل الرئة في DM ، ثم احتضن الشرائط لمدة ساعة واحدة عند أربع درجات مئوية في DM تحتوي على ملليغرام واحد لكل ملليلتر غراء ، 0.04٪ BSA و 0.4 ملليمول DTT. ثم احتضن عند 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة. أضف ملليغرام واحد لكل ملليلتر من الكولاجيناز من النوع IA في DM ، واحتضان مرة أخرى عند 37 درجة مئوية لمدة خمس دقائق.انقل الأنسجة إلى DM طازجة وتشتت عن طريق التريتور اللطيف باستخدام ماصة باستور زجاجية. استمر في التتبع حتى تصبح خلايا العضلات الملساء الوعائية المعزولة مرئية في محلول الاستحمام تحت المجهر. عزل الشريان داخل الرئة كما هو موضح سابقا وقطع الفرع الرئيسي للشريان داخل الرئة إلى حلقات يبلغ طولها حوالي مليمترين.قم بتثبيت حلقات الشريان داخل الرئة في غرف حمام الأعضاء عن طريق ربطها بسلكين من الفولاذ المقاوم للصدأ قطرهما 40 ميكرومتر. قم بتوصيل أسلاك الفولاذ المقاوم للصدأ المثبتة بحلقات الشريان داخل الرئة بمحولات القوة متساوي القياس المتصلة بجهاز الحصول على البيانات ونظام الكمبيوتر المثبت بالبرنامج الفسيولوجي المناسب لتسجيل البيانات وتحليلها. ثم ارفع بلطف توتر حلقة الشريان داخل الرئة إلى غرام واحد.اسمح لأجزاء السفينة بالتوازن لمدة 45 دقيقة تقريبا عند توتر الراحة يبلغ جراما واحدا. خلال فترة التوازن ، تأكد من تغيير محلول Krebs بانتظام كل 15 دقيقة. بعد التوازن ، اختبر صلاحية الأوعية عن طريق قياس تضيق الأوعية إلى محلول البوتاسيوم العالي خارج الخلية.تقييم وجود أو عدم وجود البطانة عن طريق حساب استجابة الاسترخاء للأسيتيل كولين في الحلقات المتعاقد عليها مسبقا مع PE. قم بإزالة البطانة ميكانيكيا عن طريق فرك الجزء الداخلي من الوعاء بلطف بسلك صغير للحث على التعري. ثم قم بموازنة الحلقات الشريانية لمدة 30 دقيقة قبل بدء تجارب الاختبار. التحقيق في تأثير الاسترخاء من المستخلص النباتي عن طريق التعاقد المسبق على حلقات الشريان داخل الرئة مع PE. ثم أضف بعناية 0.1 إلى 1000 ميكروغرام لكل ملليلتر من المستخلص النباتي بشكل تراكمي إلى حلقات البطانة السليمة والحلقات العارية البطانية للحث على استرخاء الأوعية والحصول على منحنى استجابة يعتمد على التركيز.تأكد من أن DMSO الفعال المستخدم كمذيب يتم تقييمه أيضا بالمثل ليكون بمثابة عنصر تحكم سلبي. تقييم آلية عمل المستخلص النباتي كما هو مذكور في مخطوطة النص. ثم بعد أن تستقر الانقباضات إلى PE ، أضف تركيزات تراكمية من المستخلص النباتي.عرض آثار المستخلصات النباتية كنسبة مئوية من استرخاء حلقات الشريان داخل الرئة في وجود مثبطات مقارنة باستجابة حلقات الشريان داخل الرئة بدون مثبطات وبناء منحنى استجابة التركيز. في الشريان داخل الرئة السليم ، أثار المستخلص النباتي استجابة تعتمد على التركيز من استرخاء الأوعية. أدى القضاء على البطانة البطانية إلى تقليل عميق من استرخاء الأوعية الناجم عن المستخلص النباتي كما يتضح من الزيادة في EC50 بمقدار 2.2 ضعف ، ومن الواضح أن تثبيط eNOS و EDHF قلل من استجابة الأوعية الدموية للمستخلص النباتي.أدى ذلك إلى تحويل منحنى استجابة التركيز إلى اليمين وزيادة EC50 دون تغيير قيم E القصوى. على العكس من ذلك ، لم يظهر الإندوميتاسين أي تأثير على استجابة الأوعية الدموية للمستخلص النباتي. في حلقات الشريان داخل الرئة العارية بالبطانة ، قللت حاصرات قنوات البوتاسيوم المنشطة بالكالسيوم من استجابة الأوعية الدموية للمستخلص النباتي.في حين أن حاصرات قنوات البوتاسيوم ذات بوابات الجهد أو ATP الحساسة لم تظهر أي انحراف. الحضانة المسبقة مع المستخلص النباتي منعت الانكماش الناجم عن كلوريد الكالسيوم. حلقات الشريان داخل الرئة العارية البطانية المحتضنة مسبقا بمحلول كريبس الخالي من الكالسيوم و PE جعلت انكماشا عابرا.بالمقارنة مع السيارة ، فإن المستخلصات النباتية قللت بشكل كبير من الانكماش الناجم عن PE. أثناء الإجراء ، يجب على المرء أن يحدد بوضوح الوريد والشعب الهوائية والشريان في وقت مبكر. قطع أو إتلاف الشريان سيقلل من طوله ويؤثر على استجابات الأوعية الدموية. يمكن تكييف هذه التقنية للتحقيق في المركبات التي قد تكون بمثابة نماذج أولية لعلاج أمراض الأوعية الدموية الرئوية مثل ارتفاع ضغط الدم الشرياني الرئوي.

Research

JoVE Journal

Medicine

Mesenteric Artery Contraction and Relaxation Studies Using Automated Wire Myography

الشريان المساريقي تقلص والاسترخاء عن طريق الدراسات الآلي Myography أسلاك

Proximal resistance vessels, such as the mesenteric arteries, contribute substantially to the peripheral resistance. These small vessels of between ...

Training a Sophisticated Microsurgical Technique: Interposition of External Jugular Vein Graft in the Common Carotid Artery in Rats

تدريب تقنية متطورة المجهرية: مداخلة من حبل الوريد الخارجية الكسب غير المشروع في الشريان السباتي المشترك في الجرذان

Neointimal hyperplasia is one the primary causes of stenosis in arterialized veins that are of great importance in arterial coronary bypass surgery, in ...

Assessment of Right Ventricular Structure and Function in Mouse Model of Pulmonary Artery Constriction by Transthoracic Echocardiography

تقييم البطين الأيمن هيكل وظيفة في نموذج الفأر من الشريان الرئوي عبر الصدر عن طريق انقباض ضربات القلب

Emerging clinical data support the notion that RV dysfunction is critical to the pathogenesis of cardiovascular disease and heart failure1-3. Moreover, ...

Bladder Smooth Muscle Strip Contractility as a Method to Evaluate Lower Urinary Tract Pharmacology

المثانة العضلات الملساء قطاع انقباض كوسيلة لتقييم المسالك البولية السفلى الصيدلة

We describe an in vitro method to measure bladder smooth muscle contractility, and its use for investigating physiological and pharmacological properties ...

Embolic Middle Cerebral Artery Occlusion (MCAO) for Ischemic Stroke with Homologous Blood Clots in Rats

Embolic Middle Cerebral Artery Occlusion MCAO for Ischemic Stroke with Homologous Blood Clots in Rats

صمي الأوسط انسداد الشريان الدماغي (MCAO) لالدماغية السكتة الدماغية مع مثلي تجلط الدم في الجرذان

Clinically, thrombolytic therapy with use of recombinant tissue plasminogen activator (tPA) remains the most effective treatment for acute ischemic ...

Vascular Balloon Injury and Intraluminal Administration in Rat Carotid Artery

إصابة الأوعية الدموية بالون والإدارة داخل اللمعة في الجرذ الشريان السباتي

The carotid artery balloon injury model in rats has been well established for over two decades. It remains an important method to study the molecular and ...

Permanent Ligation of the Left Anterior Descending Coronary Artery in Mice: A Model of Post-myocardial Infarction Remodelling and Heart Failure

ربط دائم في الشريان التاجي الأيسر الأمامي تنازلي في الفئران: نموذج ما بعد إعادة تشكيل عضلة القلب احتشاء وقصور القلب

Heart failure is a syndrome in which the heart fails to pump blood at a rate commensurate with cellular oxygen requirements at rest or during stress. It ...

Ultrasound Based Assessment of Coronary Artery Flow and Coronary Flow Reserve Using the Pressure Overload Model in Mice

تقييم الموجات فوق الصوتية وبناء من الشريان التاجي تدفق وتدفق التاجي الاحتياطي باستخدام نموذج الزائد الضغط في الفئران

Transthoracic Doppler echocardiography (TTDE) is a clinically useful, noninvasive tool for studying coronary artery flow velocity and coronary flow ...

Ferric Chloride-induced Thrombosis Mouse Model on Carotid Artery and Mesentery Vessel

الحديديك تخثر نموذج الفأر على الشريان السباتي ومساريق السفينة التي يسببها كلوريد

Severe thrombosis and its ischemic consequences such as myocardial infarction, pulmonary embolism and stroke are major worldwide health issues. The ferric ...

Calcification of Vascular Smooth Muscle Cells and Imaging of Aortic Calcification and Inflammation

تكلس الأوعية الدموية خلايا العضلات الملساء والتصوير من الأورطي تكلس والتهاب

Cardiovascular disease is the leading cause of morbidity and mortality in the world.  Atherosclerotic plaques, consisting of lipid-laden macrophages and ...