Name: isolation of intrapulmonary artery and smooth muscle cells to investigate vascular responses
Uploaded: 2022-06-08T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Intrapulmonary Artery and Smooth Muscle Cells to Investigate Vascular Responses at JoVE.com

Forfatterne vil gerne anerkende National Research Council of Thailand, Center of Excellence for Innovation in Chemistry (PERCH-CIC) og International Research Network (IRN61W0005) for at yde økonomisk støtte og Institut for Fysiologi Fakultet for Medicinsk Videnskab, Naresuan University, for støtte til forskningsfaciliteter.

Forsøgene udført i denne undersøgelse blev godkendt af den etiske komité ved Naresuan University Animal Care and Use Committee (NUACUC), protokolnummer NU-AE620921, til pleje og brug af dyr til videnskabelige formål.
1. Sammensætning af fysiologiske opløsninger
<ol><li>Krebs-opløsning formuleres ved at opløse kemikalier i destilleret vand for at opnå de endelige koncentrationer som følger: 122 mM NaCl, 10 mM HEPES, 5 mM KCl, 0,5 mM KH2PO 4, 0,5 mM NaHPO...

<ol>
	<li>Lyle, M. A., Davis, J. P., Brozovich, F. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+pulmonary+vascular+smooth+muscle+contractility+in+pulmonary+arterial+hypertension:+Implications+for+therapy.">Regulation of pulmonary vascular smooth muscle contractility in pulmonary arterial hypertension: Implications for therapy.</a> Frontiers in Physiology. 8, 614 (2017).</li><li>Cyr, A. R., Huckaby, L. V., Shiva, S. S., Zuckerbraun, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nitric+oxide+and+endothelial+dysfunction.">Nitric oxide and endothelial dysfunction.</a> Critical Care Clinics. 36 (2), 307-321 (2020).</li><li>Ruan, K. -. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advance+in+understanding+the+biosynthesis+of+prostacyclin+and+thromboxane+A2+in+the+endoplasmic+reticulum+membrane+via+the+cyclo-oxygenase+pathway.">Advance in understanding the biosynthesis of prostacyclin and thromboxane A2 in the endoplasmic reticulum membrane via the cyclo-oxygenase pathway.</a> Mini Reviews in Medicinal Chemistry. 4 (6), 639-647 (2004).</li><li>Del Pozo, R., Hernandez Gonzalez, I., Escribano-Subias, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+prostacyclin+pathway+in+pulmonary+arterial+hypertension:+A+clinical+review.">The prostacyclin pathway in pulmonary arterial hypertension: A clinical review.</a> Expert Review of Respiratory Medicine. 11 (6), 491-503 (2017).</li><li>Morgado, M., Cairr&#227;o, E., Santos-Silva, A. J., Verde, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cyclic+nucleotide-dependent+relaxation+pathways+in+vascular+smooth+muscle.">Cyclic nucleotide-dependent relaxation pathways in vascular smooth muscle.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 69 (2), 247-266 (2012).</li><li>Schmidt, K., de Wit, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelium-derived+hyperpolarizing+factor+and+myoendothelial+coupling:+The+in+vivo+perspective.">Endothelium-derived hyperpolarizing factor and myoendothelial coupling: The in vivo perspective.</a> Frontiers in Physiology. 11, (2020).</li><li>Fan, G., Cui, Y., Gollasch, M., Kassmann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elementary+calcium+signaling+in+arterial+smooth+muscle.">Elementary calcium signaling in arterial smooth muscle.</a> Channels. 13 (1), 505-519 (2019).</li><li>Wisutthathum, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extract+of+Aquilaria+crassna+leaves+and+mangiferin+are+vasodilators+while+showing+no+cytotoxicity.">Extract of Aquilaria crassna leaves and mangiferin are vasodilators while showing no cytotoxicity.</a> Journal of Traditional and Complementary Medicine. 9 (4), 237-242 (2019).</li><li>Kamkaew, N., Paracha, T. U., Ingkaninan, K., Waranuch, N., Chootip, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vasodilatory+effects+and+mechanisms+of+action+of+Bacopa+monnieri+active+compounds+on+rat+mesenteric+arteries.">Vasodilatory effects and mechanisms of action of Bacopa monnieri active compounds on rat mesenteric arteries.</a> Molecules. 24 (12), 2243 (2019).</li><li>Chootip, K., Kennedy, C., Gurney, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+P2+receptors+mediating+contraction+of+the+rat+isolated+pulmonary+vasculature.">Characterization of P2 receptors mediating contraction of the rat isolated pulmonary vasculature.</a> British Journal of Pharmacology. 131, 167 (2000).</li><li>Paracha, T. U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elucidation+of+vasodilation+response+and+structure+activity+relationships+of+N2,+N4-disubstituted+quinazoline+2,+4-diamines+in+a+rat+pulmonary+artery+model.">Elucidation of vasodilation response and structure activity relationships of N2, N4-disubstituted quinazoline 2, 4-diamines in a rat pulmonary artery model.</a> Molecules. 24 (2), 281 (2019).</li><li>Chootip, K., Gurney, A. M., Kennedy, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+P2Y+receptors+couple+to+calcium-dependent,+chloride+channels+in+smooth+muscle+cells+of+the+rat+pulmonary+artery.">Multiple P2Y receptors couple to calcium-dependent, chloride channels in smooth muscle cells of the rat pulmonary artery.</a> Respiratory Research. 6 (1), 1-10 (2005).</li><li>Wisutthathum, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Eulophia+macrobulbon+extract+relaxes+rat+isolated+pulmonary+artery+and+protects+against+monocrotaline-induced+pulmonary+arterial+hypertension.">Eulophia macrobulbon extract relaxes rat isolated pulmonary artery and protects against monocrotaline-induced pulmonary arterial hypertension.</a> Phytomedicine. 50, 157-165 (2018).</li><li>Kruangtip, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Curcumin+analogues+inhibit+phosphodiesterase-5+and+dilate+rat+pulmonary+arteries.">Curcumin analogues inhibit phosphodiesterase-5 and dilate rat pulmonary arteries.</a> Journal of Pharmacy and Pharmacology. 67 (1), 87-95 (2015).</li></ol>

I dette manuskript beskriver vi teknikken til isolering af rotte IPA og VSMC'er. Flere eksperimentelle protokoller er blevet anvendt til at undersøge det vaskulære respons af IPA in vitro, som kan bruges til at karakterisere den farmakologiske virkning og mekanistiske grundlag for IPA-vasorelaxation induceret af planteekstrakt.
Med hensyn til planteekstraktets endotelafhængige vasodilatorvirkning blev forskellige blokkere såsom L-NAME (eNOS), indomethacin (COX) og apamin + charybd...

Den pulmonale vaskulatur er et lavtryks vaskulært system, hvor hovedfunktionen er at levere deoxygeneret blod til lungernes gasudvekslingsområde. Lungearterierne i lungerne er arrangeret i grene parallelt med bronchialtræet, hvilket i sidste ende danner et omfattende netværk af kapillærer, der er kontinuerligt over flere alveoler og endelig kommer sammen i venler og vener. Den vaskulære tone i lungearterien styres af flere faktorer, der involverer interaktionen mellem endotelet og vaskulære glatte muskelceller (VSMC'er)1.
I denne undersøgelse fokuserer vi på den endotelafhængige og -uafhængige vasorelaxation af den intrapulmonale arterie (IPA). Med hensyn til den endotelafhængige vasorelaxation kan forskellige mekanismer, der forekommer på overfladen af endotelceller, øge intracellulær Ca2+ koncentration (f.eks. acetylcholin [ACh] binder med muskarinreceptor [M3]), hvilket fører til dannelse af nitrogenoxid (NO), prostacyclin (PGl2) og endotelafledt hyperpolariserende faktor (EDHF) (figur 1 ). NO er den vigtigste endotelafledte afslappende faktor syntetiseret fra L-arginin ved endotelnitrogenoxidsyntase (eNOS)2, som derefter dissocierer ud af endotelcellerne til VSMC'er (figur 1) og stimulerer det opløselige guanylylcyklase (sGC) enzym; dette enzym ændrer guanosintrifosfat (GTP) til cyklisk guanosinmonophosphat (cGMP), som aktiverer proteinkinase G (PKG) og reducerer cytosoliske Ca2+ niveauer og dermed forårsager vasorelaxation (figur 1). PGl2 syntetiseres af endotelceller via cyclo-oxygenase (COX) vejen 3,4. Det binder med prostacyclinreceptoren (IP) på VSMC'er og stimulerer adenylcyklase (AC) enzymet, som derefter omdanner adenosintrifosfat (ATP) til cyklisk adenosinmonophosphat (cAMP) (figur 1)3,4. cAMP aktiverer proteinkinase A (PKA), hvilket reducerer cytosoliske Ca2+ niveauer og forårsager vasorelaxation5 (figur 1). EDHF-stien deltager også i endotelafhængig vasorelaxation via forskellige endotelmediatorer og elektriske begivenheder. Aktiveringen af EDHF-vejen fører til hyperpolarisering af VSMC'er, hvorved spændingsstyrede Ca 2+ kanaler (VOCC'er) lukkes, hvilket reducerer intracellulære Ca 2+ niveauer og inducerer vasorelaxation 6. Den endoteluafhængige vasorelaxation forekommer direkte på VSMC'er via flere mekanismer, såsom reduktion af intracellulært Ca 2+ niveau, hæmning af myosin lyskædekinase (MLCK), aktivering af myosin lyskædephosphatase (MLCP) og reduktion af Ca2+ følsomhed over for det kontraktile maskineri af VSMC'er. I denne undersøgelse fokuserer vi på vasorelaxation forårsaget af åbningen af forskellige K + -kanaler, blokaden af VOCC'er og inhiberingen af Ca 2+ frigivelse fra det sarkoplasmatiske retikulum7, hvilket fører til reduktion af intracellulære Ca2+ niveauer og dermed reducerer VSMC myosin lyskædephosphorylering og myosin-actinbinding eller krydsbrodannelse, henholdsvis, i sidste ende resulterer i vasorelaxation.
Teknikken til evaluering af vasokonstriktions- og vasoafslapningsmålinger i isoleret IPA er veletableret for gnavere, men dataene varierede afhængigt af de eksperimentelle protokoller. Denne undersøgelse beskriver den metode, der anvendes til at evaluere de vaskulære reaktiviteter af rotte IPA-præparater in vitro, som blev foretaget i mangel af eksterne faktorer, der modulerede vaskulær respons in vivo, såsom nervesignaler, hormoner, cytokiner, blodtryk osv.
Vi anvendte flere eksperimentelle protokoller ved hjælp af planteekstraktet som et eksempel til at studere IPA's vaskulære reaktiviteter. Forskellige blokkere (figur 1) blev brugt til at identificere mekanismerne for endotelafhængig og -uafhængig vasorelaxation induceret af planteekstraktet. Ikke desto mindre kan de samme protokoller tilpasses til at evaluere IPA's vaskulære reaktioner på lægemidler, ekstrakter eller fytokemikalier, der anvendes til behandling af forskellige lungepatologier.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1,4-dithiothreitol (DTT)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D0632 
			CAS NO. 348-12-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-aminopyridine (4-AP)</td>
			<td>Aldrich Chemical</td>
			<td>A78403 
			CAS NO. 504-24-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetylcholine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A6625 
			CAS NO. 60-31-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Apamin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9459 
			CAS NO. 24345-16-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A2153 
			CAS NO. 9048-46-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium choride</td>
			<td>Ajax Finechem</td>
			<td>AJA960 
			CAS NO. 1707055184</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Charybdotoxin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C7802 
			CAS NO. 95751-30-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase type 1A</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C9891 
			CAS NO. 9001-12-1</td>
			<td>From Clostridium histolyticum</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D(+)-Glucose monohydrate</td>
			<td>Millipore Corporation</td>
			<td>K50876942 924 
			CAS NO. 14431-43-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D4540 
			CAS NO. 67-68-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylene glycol-bis (2-aminoethylether)-N,N,N&#8217;,N&#8217;-tetraacetic acid (EGTA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E3889 
			CAS NO. 67-42-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E9884 
			CAS NO. 60-00-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps 11 cm.</td>
			<td>Rustless Dumoxel</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps 14 cm.</td>
			<td>Rustless Dumoxel</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glibenclamide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G6039 
			CAS NO. 16673-34-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GraphPad Prism program</td>
			<td>Software version 5.0 (San Diego, CA, USA)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H3375 
			CAS NO. 7365-45-9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iberiotoxin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I5904 
			CAS NO. 1002546960</td>
			<td>recombinant from Mesobuthus tamulus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Indomethacin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I7378 
			CAS NO. 53-86-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Labchart Program</td>
			<td>Software version 7.0 (A.D. Instrument, Castle Hill, Australia).</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride</td>
			<td>Ajax Finechem</td>
			<td>296 
			CAS NO. 1506254995</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Male Wistar rats</td>
			<td>Nomura Siam International Co. Ltd., Bangkok, Thailand</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NG-nitro-L-arginine methyl ester (L-NAME)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>N5751 
			CAS NO. 51298-62-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nicardipine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>N7510 
			CAS NO. 54527-84-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Organ bath 15 mL.</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Specific order by the researchers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Papain</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4762 
			CAS NO. 9001-73-4</td>
			<td>FromPapaya Latex</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenal red</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5530 
			CAS NO. 34487-61-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenylephrine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P6126 
			CAS NO. 61-76-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>Kemaus</td>
			<td>KA383 
			CAS NO. 7447-40-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium dihydrogenphosphate</td>
			<td>Aldrich Chemical</td>
			<td>EC231-913-4 
			CAS NO. 7778-77-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>S+A2:E36odium chloride</td>
			<td>Kemaus</td>
			<td>KA465 
			CAS NO. 7647-14-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissors 11 cm.</td>
			<td>Spall Stainless</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissors 14 cm.</td>
			<td>Spall Stainless</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium bicarbonate</td>
			<td>Ajax Finechem</td>
			<td>475 
			CAS NO. 912466</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dihydrogenphosphate</td>
			<td>Aldrich Chemical</td>
			<td>33,198-8 
			CAS NO. 7558-80-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide</td>
			<td>Ajax Finechem</td>
			<td>482 
			CAS NO. 1506196602</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium thiopental</td>
			<td>Anesthal</td>
			<td>JPN3010002 
			CAS NO. 1C 314/47</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taurine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T0625 
			CAS NO. 107-35-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Waterbath WBU 45</td>
			<td>Memmert</td>
			<td>2766 
			CAS NO. -</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of intrapulmonary artery and smooth muscle cells to investigate vascular responses

Den intrapulmonale arterie (IPA) og vaskulære glatte muskelceller (VSMC'er) isoleret fra rottelunger kan bruges til at studere de underliggende mekanismer for vasokonstriktion og vasorelaxation. Efter isolering af IPA og VSMC'er kan egenskaberne ved vaskulære reaktioner under fysiologiske og patologiske tilstande vurderes i fravær af ydre faktorer såsom nervesignaler, hormoner, cytokiner osv. IPA- og VSMC'erne tjener således som fremragende modeller til undersøgelse af vaskulær fysiologi / patofysiologi sammen med forskellige eksperimentelle undersøgelser, såsom modulering af farmakologiske midler, patch-clamp elektrofysiologisk analyse, calciumbilleddannelse osv. Her har vi brugt en teknik til at isolere IPA til at undersøge vaskulære reaktioner i et orgelbadsopsætning. IPA-segmenter blev monteret på organbadkammeret via intraluminale ledninger og stimuleret af forskellige farmakologiske midler. Ændringerne i IPA vaskulær tone (dvs. vasokonstriktion og vasorelaxation) blev registreret ved hjælp af et isometrisk krafttransducer og fysiologisk dataanalysesoftwareprogram. Vi implementerede flere eksperimentelle protokoller, som kan tilpasses til at undersøge mekanismerne for vasorelaxation / vasokonstriktion til undersøgelse af de farmakologiske aktiviteter af fytokemiske eller syntetiske lægemidler. Protokollerne kan også bruges til at evaluere lægemidlernes roller i modulering af forskellige sygdomme, herunder pulmonal arteriel hypertension. IPA-modellen giver os mulighed for at undersøge koncentrations-responskurven, som er afgørende for vurderingen af lægemidlers farmakodynamiske parametre.

Protokollen i denne undersøgelse er udviklet til at bestemme de optimale eksperimentelle betingelser for måling af fysiologiske fænomener observeret i de vaskulære reaktioner af isolerede IPA-præparater. Pilotforsøgene blev udført for at beskrive de potentielle resultater, der hjælper forståelsen af de vaskulære virkninger og det mekaniske grundlag for planteekstraktets vasorelaxante virkning, som følger.
Vasorelaxant virkning af planteekstraktet Som vist i figur...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Intrapulmonary Artery and Smooth Muscle Cells to Investigate Vascular Responses at JoVE.com

Isolation of Intrapulmonary Artery and Smooth Muscle Cells to Investigate Vascular Responses

Vaskulære reaktioner af arteriel lungecirkulation kan undersøges ved hjælp af intrapulmonal arterie (IPA) og vaskulære glatte muskelceller (VSMC'er). Denne undersøgelse beskriver isolationen af IPA i detaljer og de protokoller, der anvendes til undersøgelse af vasorelaxation som reaktion på fysiologiske stimuli.

Isolering af intrapulmonale arterier og glatte muskelceller for at undersøge vaskulære reaktioner

The intrapulmonary artery (IPA) and vascular smooth muscle cells (VSMCs) isolated from rat lungs can be used to study the underlying mechanisms of ...

Denne undersøgelse beskriver isolering af intrapulmonale arterier og vaskulære glatte muskelceller. Flere eksperimentelle protokoller blev anvendt, såsom at bruge organbadteknikken til at undersøge vaskulær respons af den intrapulmonale arterie. Intrapulmonale arterier og vaskulære glatte muskelceller er fremragende modeller til at studere vaskulær fysiologi og patofysiologi.Tilpasninger af denne teknik kan evaluere vaskulære reaktioner af lægemidler, ekstrakter eller fytokemikalier. Montering af den isolerede intrapulmonale arterielle ring i et organbad muliggør brugen af isolerede intrapulmonale arterier til at evaluere et lægemiddels rolle i modulering af forskellige sygdomme, herunder pulmonal hypertension. De eksperimentelle protokoller er teknisk gennemførlige, men de afgørende trin er komplicerede og afgørende for succes, så at have en visuel demonstration gør det lettere at forstå og følge.Demonstration af proceduren vil være Kittiwoot To-on, en kandidatstuderende i fysiologi fra Cardiovascular Research Unit Laboratory, Institut for Fysiologi, Det Medicinske Fakultet, Naresuan University. Begynd med at skære en enkelt lungelap med en saks på 11 centimeter og læg den på en ni centimeter petriskål med den mediale side eller lungerod vendt opad. Overhold og identificer justeringen af venen, bronkierne og arterien fra top til bund.Skær bronchus i længderetningen op med en saks. Brug derefter de 11 centimeter tang til at få fat i spidsen af bronchus. Insekter forsigtigt og fjern bronchus og vener ud af lungen.Brug tangen til at gribe spidsen af den intrapulmonale arterie og disseker den forsigtigt ud af lungevævet med en saks. Opbevar den isolerede intrapulmonale arterie i kold Krebs-opløsning, indtil organbadsenheden er oprettet. Efter isolering af den intrapulmonale arterie skal du skære hovedgrenen af den intrapulmonale arterie i længderetningen med 11 centimeter saksen og skæres i to millimeter strimler.Nedsænk de intrapulmonale arteriestrimler i DM, og inkuber derefter strimlerne i en time ved fire grader Celsius i DM indeholdende et milligram pr. milliliter papain, 0,04% BSA og 0,4 millimolar DTT. Derefter inkuberes ved 37 grader Celsius i 15 minutter. Tilsæt et milligram pr. milliliter collagenase Type IA i DM, og inkuber igen ved 37 grader Celsius i fem minutter.Overfør vævene til frisk DM og spred ved blid trituration ved hjælp af en glas Pasteur-pipette. Bliv ved med at triturere, indtil isolerede vaskulære glatte muskelceller bliver synlige i badeopløsningen under mikroskopet. Isoler intrapulmonal arterie som vist tidligere og skær hovedgrenen af den intrapulmonale arterie i ringe på cirka to millimeter i længden.Fastgør de intrapulmonale arterieringe i orgelbadskamre ved at gevind dem på to tråde med en diameter på 40 mikrometer rustfrit stål. Fastgør ledninger i rustfrit stål monteret med intrapulmonale arterieringe til de isometriske krafttransducere, der er forbundet til dataindsamlingsanordningen og computersystemet installeret med den passende fysiologiske software til dataregistrering og analyse. Derefter hæves forsigtigt spændingen af den intrapulmonale arteriering til et gram.Lad fartøjssegmenterne balancere i ca. 45 minutter ved en hvilespænding på et gram. I løbet af ækvilibreringsperioden skal du sikre dig, at Krebs-opløsningen udskiftes regelmæssigt hvert 15. minut. Efter ækvilibrering testes skibenes levedygtighed ved at måle deres vasokonstriktion til høj ekstracellulær kaliumopløsning.Vurder tilstedeværelsen eller fraværet af endotel ved at beregne afslapningsresponset på acetylcholin i ringe, der er indgået på forhånd med PE. Fjern endotelet mekanisk ved forsigtigt at gnide indersiden af beholderen med en lille ledning for at fremkalde denudation. Derefter ækvilibreres arterieringene i 30 minutter før testforsøgenes start. Undersøg den afslappende virkning af planteekstraktet ved at indgå intrapulmonale arterieringe med PE. Derefter tilsættes forsigtigt 0,1 til 1000 mikrogram pr. milliliter planteekstrakt kumulativt til endotel intakte ringe og endoteldenuderede ringe for at inducere vasorelaxation og erhverve en koncentrationsafhængig responskurve.Sørg for, at den effektive DMSO, der anvendes som opløsningsmiddel, også vurderes på samme måde som en negativ kontrol. Evaluer den vasorelaxante virkningsmekanisme for planteekstraktet som nævnt i tekstmanuskriptet. Derefter efter sammentrækningerne til PE stabiliseres, tilsættes kumulative koncentrationer af planteekstraktet.Præsenter virkningerne af planteekstrakt som procentvis afslapning af de intrapulmonale arterieringe i nærvær af hæmmere sammenlignet med responsen af de intrapulmonale arterieringe uden hæmmere, og konstruer koncentrationsresponskurven. I endotel intakt intrapulmonal arterie fremkaldte planteekstraktet et koncentrationsafhængigt respons af vasorelaxation. Udryddelse af endotel reducerede dybt vasorelaxation induceret af planteekstraktet som afspejlet ved stigningen i EC50 med 2,2 gange, hæmning af eNOS og EDHF reducerede åbenbart vasorelaxantresponsen på planteekstraktet.Dette forskubbede koncentrationsresponskurven til højre og øgede EC50 uden at ændre E-max-værdierne. Tværtimod viste Indomethacin ingen effekt på det vasorelaxante respons på planteekstraktet. I de endotel-denuderede intrapulmonale arterieringe reducerede calciumaktiverede kaliumkanalblokkere det vasorelaxante respons på planteekstraktet.Mens blokkere af spændingsstyrede eller ATP-følsomme kaliumkanaler ikke viste nogen afvigelse. Preinkubation med planteekstraktet hæmmede calciumchloridinduceret sammentrækning. De endotel-denuderede intrapulmonale arterieringe præinkuberet med calciumfri Krebs-opløsning og PE gav en forbigående sammentrækning.I sammenligning med køretøjet reducerede planteekstrakterne signifikant sammentrækningen induceret af PE. Under proceduren skal man tydeligt identificere vene, bronkier og arterie tidligt. Skæring eller beskadigelse af arterien vil reducere dens længde og påvirke de vaskulære reaktioner. Denne teknik kan tilpasses til at undersøge forbindelser, der kan tjene som prototyper til behandling af pulmonale vaskulære sygdomme såsom pulmonal arteriel hypertension.

Research

JoVE Journal

Medicine

Mesenteric Artery Contraction and Relaxation Studies Using Automated Wire Myography

Proximal resistance vessels, such as the mesenteric arteries, contribute substantially to the peripheral resistance. These small vessels of between ...

Training a Sophisticated Microsurgical Technique: Interposition of External Jugular Vein Graft in the Common Carotid Artery in Rats

Træning en Sofistikeret Microsurgical Teknik: indskydning af ydre halsvene Graft i den fælles halspulsåre i rotter

Neointimal hyperplasia is one the primary causes of stenosis in arterialized veins that are of great importance in arterial coronary bypass surgery, in ...

Assessment of Right Ventricular Structure and Function in Mouse Model of Pulmonary Artery Constriction by Transthoracic Echocardiography

Vurdering af Højre ventrikels struktur og funktion i musemodel med lungepulsåren Konstriktion af Transtorakal Ekkokardiografi

Emerging clinical data support the notion that RV dysfunction is critical to the pathogenesis of cardiovascular disease and heart failure1-3. Moreover, ...

Bladder Smooth Muscle Strip Contractility as a Method to Evaluate Lower Urinary Tract Pharmacology

Glat muskulatur i blæren Strip Kontraktilitet som en metode til at evaluere nedre urinveje Farmakologi

We describe an in vitro method to measure bladder smooth muscle contractility, and its use for investigating physiological and pharmacological properties ...

Embolic Middle Cerebral Artery Occlusion (MCAO) for Ischemic Stroke with Homologous Blood Clots in Rats

Embolic Middle Cerebral Artery Occlusion MCAO for Ischemic Stroke with Homologous Blood Clots in Rats

Embolisk cerbri arterieokklusion (MCAO) for iskæmisk slagtilfælde med Homologe Blodpropper i rotter

Clinically, thrombolytic therapy with use of recombinant tissue plasminogen activator (tPA) remains the most effective treatment for acute ischemic ...

Vascular Balloon Injury and Intraluminal Administration in Rat Carotid Artery

Vascular Balloon Skade og intraluminal Administration i Rat Arteria carotis

The carotid artery balloon injury model in rats has been well established for over two decades. It remains an important method to study the molecular and ...

Permanent Ligation of the Left Anterior Descending Coronary Artery in Mice: A Model of Post-myocardial Infarction Remodelling and Heart Failure

Permanent ligering af venstre forreste nedadgående kranspulsåre i mus: En Model af Post-myokardieinfarkt Ombygning og hjertesvigt

Heart failure is a syndrome in which the heart fails to pump blood at a rate commensurate with cellular oxygen requirements at rest or during stress. It ...

Ultrasound Based Assessment of Coronary Artery Flow and Coronary Flow Reserve Using the Pressure Overload Model in Mice

Ultralyd funderet vurdering af koronararterie Flow og koronar Flow Reserve Brug af trykoverbelastning Model i mus

Transthoracic Doppler echocardiography (TTDE) is a clinically useful, noninvasive tool for studying coronary artery flow velocity and coronary flow ...

Ferric Chloride-induced Thrombosis Mouse Model on Carotid Artery and Mesentery Vessel

Ferric Chloride-induceret Trombose Mouse Model på Arteria carotis og mesenterium Vessel

Severe thrombosis and its ischemic consequences such as myocardial infarction, pulmonary embolism and stroke are major worldwide health issues. The ferric ...

Calcification of Vascular Smooth Muscle Cells and Imaging of Aortic Calcification and Inflammation

Forkalkning af vaskulære glatte muskelceller og billeddannelse af aorta Forkalkning og Inflammation

Cardiovascular disease is the leading cause of morbidity and mortality in the world.  Atherosclerotic plaques, consisting of lipid-laden macrophages and ...