Name: isolation of intrapulmonary artery and smooth muscle cells to investigate vascular responses
Uploaded: 2022-06-08T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Intrapulmonary Artery and Smooth Muscle Cells to Investigate Vascular Responses at JoVE.com

De auteurs willen graag de National Research Council of Thailand, het Center of Excellence for Innovation in Chemistry (PERCH-CIC) en het International Research Network (IRN61W0005) erkennen voor het verlenen van financiële steun, en de afdeling Fysiologie Faculteit medische Wetenschappen, Naresuan University, voor ondersteuning van onderzoeksfaciliteiten.

De experimenten die in deze studie zijn uitgevoerd, zijn goedgekeurd door de Ethische Commissie van de Naresuan University Animal Care and Use Committee (NUACUC), protocolnummer NU-AE620921, voor de verzorging en het gebruik van dieren voor wetenschappelijke doeleinden.
1. Samenstelling van fysiologische oplossingen
<ol><li>Formuleer Krebs-oplossing door chemicaliën op te lossen in gedestilleerd water om de uiteindelijke concentraties als volgt te bereiken: 122 mM NaCl, 10 ...

<ol>
	<li>Lyle, M. A., Davis, J. P., Brozovich, F. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+pulmonary+vascular+smooth+muscle+contractility+in+pulmonary+arterial+hypertension:+Implications+for+therapy.">Regulation of pulmonary vascular smooth muscle contractility in pulmonary arterial hypertension: Implications for therapy.</a> Frontiers in Physiology. 8, 614 (2017).</li><li>Cyr, A. R., Huckaby, L. V., Shiva, S. S., Zuckerbraun, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nitric+oxide+and+endothelial+dysfunction.">Nitric oxide and endothelial dysfunction.</a> Critical Care Clinics. 36 (2), 307-321 (2020).</li><li>Ruan, K. -. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advance+in+understanding+the+biosynthesis+of+prostacyclin+and+thromboxane+A2+in+the+endoplasmic+reticulum+membrane+via+the+cyclo-oxygenase+pathway.">Advance in understanding the biosynthesis of prostacyclin and thromboxane A2 in the endoplasmic reticulum membrane via the cyclo-oxygenase pathway.</a> Mini Reviews in Medicinal Chemistry. 4 (6), 639-647 (2004).</li><li>Del Pozo, R., Hernandez Gonzalez, I., Escribano-Subias, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+prostacyclin+pathway+in+pulmonary+arterial+hypertension:+A+clinical+review.">The prostacyclin pathway in pulmonary arterial hypertension: A clinical review.</a> Expert Review of Respiratory Medicine. 11 (6), 491-503 (2017).</li><li>Morgado, M., Cairr&#227;o, E., Santos-Silva, A. J., Verde, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cyclic+nucleotide-dependent+relaxation+pathways+in+vascular+smooth+muscle.">Cyclic nucleotide-dependent relaxation pathways in vascular smooth muscle.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 69 (2), 247-266 (2012).</li><li>Schmidt, K., de Wit, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelium-derived+hyperpolarizing+factor+and+myoendothelial+coupling:+The+in+vivo+perspective.">Endothelium-derived hyperpolarizing factor and myoendothelial coupling: The in vivo perspective.</a> Frontiers in Physiology. 11, (2020).</li><li>Fan, G., Cui, Y., Gollasch, M., Kassmann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elementary+calcium+signaling+in+arterial+smooth+muscle.">Elementary calcium signaling in arterial smooth muscle.</a> Channels. 13 (1), 505-519 (2019).</li><li>Wisutthathum, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extract+of+Aquilaria+crassna+leaves+and+mangiferin+are+vasodilators+while+showing+no+cytotoxicity.">Extract of Aquilaria crassna leaves and mangiferin are vasodilators while showing no cytotoxicity.</a> Journal of Traditional and Complementary Medicine. 9 (4), 237-242 (2019).</li><li>Kamkaew, N., Paracha, T. U., Ingkaninan, K., Waranuch, N., Chootip, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vasodilatory+effects+and+mechanisms+of+action+of+Bacopa+monnieri+active+compounds+on+rat+mesenteric+arteries.">Vasodilatory effects and mechanisms of action of Bacopa monnieri active compounds on rat mesenteric arteries.</a> Molecules. 24 (12), 2243 (2019).</li><li>Chootip, K., Kennedy, C., Gurney, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+P2+receptors+mediating+contraction+of+the+rat+isolated+pulmonary+vasculature.">Characterization of P2 receptors mediating contraction of the rat isolated pulmonary vasculature.</a> British Journal of Pharmacology. 131, 167 (2000).</li><li>Paracha, T. U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elucidation+of+vasodilation+response+and+structure+activity+relationships+of+N2,+N4-disubstituted+quinazoline+2,+4-diamines+in+a+rat+pulmonary+artery+model.">Elucidation of vasodilation response and structure activity relationships of N2, N4-disubstituted quinazoline 2, 4-diamines in a rat pulmonary artery model.</a> Molecules. 24 (2), 281 (2019).</li><li>Chootip, K., Gurney, A. M., Kennedy, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+P2Y+receptors+couple+to+calcium-dependent,+chloride+channels+in+smooth+muscle+cells+of+the+rat+pulmonary+artery.">Multiple P2Y receptors couple to calcium-dependent, chloride channels in smooth muscle cells of the rat pulmonary artery.</a> Respiratory Research. 6 (1), 1-10 (2005).</li><li>Wisutthathum, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Eulophia+macrobulbon+extract+relaxes+rat+isolated+pulmonary+artery+and+protects+against+monocrotaline-induced+pulmonary+arterial+hypertension.">Eulophia macrobulbon extract relaxes rat isolated pulmonary artery and protects against monocrotaline-induced pulmonary arterial hypertension.</a> Phytomedicine. 50, 157-165 (2018).</li><li>Kruangtip, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Curcumin+analogues+inhibit+phosphodiesterase-5+and+dilate+rat+pulmonary+arteries.">Curcumin analogues inhibit phosphodiesterase-5 and dilate rat pulmonary arteries.</a> Journal of Pharmacy and Pharmacology. 67 (1), 87-95 (2015).</li></ol>

In dit manuscript beschrijven we de techniek voor de isolatie van ratten IPA en VSMC's. Verschillende experimentele protocollen zijn gebruikt om de vasculaire respons van IPA in vitro te onderzoeken, die kan worden gebruikt om het farmacologische effect en de mechanistische basis van IPA-vasorelaxatie geïnduceerd door plantenextract te karakteriseren.
Met betrekking tot de endotheelafhankelijke vaatverwijdende werking van het plantenextract werden verschillende blokkers zoals L-NAME ...

De pulmonale vasculatuur is een vasculair systeem onder lage druk waarbij de belangrijkste functie is om zuurstofarm bloed af te leveren aan het gasuitwisselingsgebied van de longen. De longslagaders in de longen zijn gerangschikt in takken parallel aan de bronchiale boom, waardoor uiteindelijk een uitgebreid netwerk van haarvaten wordt gevormd dat continu is over verschillende longblaasjes en uiteindelijk samenkomt in venules en aderen. De vasculaire tonus van de longslagader wordt gecontroleerd door verschillende factoren, waarbij de interactie tussen het endotheel en vasculaire gladde spiercellen (VSMC's)1 betrokken is.
In deze studie richten we ons op de endotheelafhankelijke en -onafhankelijke vasorelaxatie van de intrapulmonale slagader (IPA). Met betrekking tot de endotheelafhankelijke vasorelaxatie kunnen verschillende mechanismen die optreden op het oppervlak van endotheelcellen de intracellulaire Ca2+ concentratie verhogen (bijv. acetylcholine [ACh] bindt met muscarinereceptor [M3]), wat leidt tot de vorming van stikstofmonoxide (NO), prostacycline (PGl2) en van endotheel afgeleide hyperpolarisatiefactor (EDHF) (figuur 1 ). NO is de belangrijkste van endotheel afgeleide ontspannende factor gesynthetiseerd uit L-arginine door endotheel stikstofmonoxidesynthase (eNOS)2, die vervolgens uit de endotheelcellen dissocieert naar VSMC's (figuur 1) en het oplosbare guanylcyclase (sGC) enzym stimuleert; dit enzym verandert guanosinetrifosfaat (GTP) in cyclisch guanosinemonofosfaat (cGMP), dat eiwitkinase G (PKG) activeert en cytosolische Ca2+ niveaus verlaagt, waardoor vasorelaxatie ontstaat (figuur 1). PGl2 wordt gesynthetiseerd door endotheelcellen via de cyclo-oxygenase (COX) route 3,4. Het bindt met de prostacyclinereceptor (IP) op VSMC's en stimuleert het adenylcyclase (AC) enzym, dat vervolgens adenosinetrifosfaat (ATP) omzet in cyclisch adenosinemonofosfaat (cAMP) (figuur 1)3,4. cAMP activeert eiwitkinase A (PKA), waardoor cytosolische Ca2+ niveaus worden verlaagd en vasorelaxatie5 wordt veroorzaakt (figuur 1). De EDHF-route neemt ook deel aan endotheelafhankelijke vasorelaxatie via verschillende endotheelmediatoren en elektrische gebeurtenissen. De activering van de EDHF-route leidt tot de hyperpolarisatie van VSMC's, waardoor spanningsgestuurde Ca2+ kanalen (VOCCs) worden gesloten, intracellulaire Ca2+ niveaus worden verlaagd en vasorelaxatie6 wordt geïnduceerd. De endotheelonafhankelijke vasorelaxatie vindt direct op VSMC's plaats via verschillende mechanismen, zoals de verlaging van het intracellulaire Ca2+ niveau, de remming van myosine light chain kinase (MLCK), de activering van myosine light chain phosphatase (MLCP) en de vermindering van Ca2+ gevoeligheid voor de contractiele machinerie van VSMC's. In deze studie richten we ons op de vasorelaxatie veroorzaakt door het openen van verschillende K + -kanalen, de blokkade van VOCC's en de remming van Ca2 + -afgifte van het sarcoplasmatisch reticulum7, wat leidt tot de vermindering van intracellulaire Ca2 + -niveaus, waardoor VSMC-myosine lichte ketenfosforylering en myosine-actinebinding of dwarsbrugvorming respectievelijk afnemen, uiteindelijk resulterend in vasorelaxatie.
De techniek voor het evalueren van vasoconstrictie- en vasorelaxatiemetingen in geïsoleerde IPA is goed ingeburgerd voor knaagdieren, maar de gegevens varieerden afhankelijk van de experimentele protocollen. De huidige studie beschrijft de methode die wordt gebruikt om de vasculaire reactiviteit van IPA-preparaten van ratten in vitro te evalueren, die werden gemaakt in afwezigheid van externe factoren die de vasculaire respons in vivo moduleren, zoals zenuwsignalen, hormonen, cytokines, bloeddruk, enz.
We gebruikten verschillende experimentele protocollen met het plantenextract als voorbeeld voor het bestuderen van de vasculaire reactiviteit van IPA. Verschillende blokkers (figuur 1) werden gebruikt om de mechanismen van endotheelafhankelijke en -onafhankelijke vasorelaxatie geïnduceerd door het plantenextract te identificeren. Niettemin kunnen dezelfde protocollen worden aangepast om de vasculaire reacties van IPA op geneesmiddelen, extracten of fytochemicaliën te evalueren die worden gebruikt voor de behandeling van verschillende pulmonale pathologieën.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1,4-dithiothreitol (DTT)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D0632 
			CAS NO. 348-12-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-aminopyridine (4-AP)</td>
			<td>Aldrich Chemical</td>
			<td>A78403 
			CAS NO. 504-24-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetylcholine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A6625 
			CAS NO. 60-31-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Apamin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9459 
			CAS NO. 24345-16-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A2153 
			CAS NO. 9048-46-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium choride</td>
			<td>Ajax Finechem</td>
			<td>AJA960 
			CAS NO. 1707055184</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Charybdotoxin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C7802 
			CAS NO. 95751-30-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase type 1A</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C9891 
			CAS NO. 9001-12-1</td>
			<td>From Clostridium histolyticum</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D(+)-Glucose monohydrate</td>
			<td>Millipore Corporation</td>
			<td>K50876942 924 
			CAS NO. 14431-43-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D4540 
			CAS NO. 67-68-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylene glycol-bis (2-aminoethylether)-N,N,N&#8217;,N&#8217;-tetraacetic acid (EGTA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E3889 
			CAS NO. 67-42-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E9884 
			CAS NO. 60-00-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps 11 cm.</td>
			<td>Rustless Dumoxel</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps 14 cm.</td>
			<td>Rustless Dumoxel</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glibenclamide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G6039 
			CAS NO. 16673-34-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GraphPad Prism program</td>
			<td>Software version 5.0 (San Diego, CA, USA)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H3375 
			CAS NO. 7365-45-9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iberiotoxin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I5904 
			CAS NO. 1002546960</td>
			<td>recombinant from Mesobuthus tamulus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Indomethacin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I7378 
			CAS NO. 53-86-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Labchart Program</td>
			<td>Software version 7.0 (A.D. Instrument, Castle Hill, Australia).</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride</td>
			<td>Ajax Finechem</td>
			<td>296 
			CAS NO. 1506254995</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Male Wistar rats</td>
			<td>Nomura Siam International Co. Ltd., Bangkok, Thailand</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NG-nitro-L-arginine methyl ester (L-NAME)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>N5751 
			CAS NO. 51298-62-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nicardipine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>N7510 
			CAS NO. 54527-84-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Organ bath 15 mL.</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Specific order by the researchers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Papain</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4762 
			CAS NO. 9001-73-4</td>
			<td>FromPapaya Latex</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenal red</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5530 
			CAS NO. 34487-61-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenylephrine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P6126 
			CAS NO. 61-76-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>Kemaus</td>
			<td>KA383 
			CAS NO. 7447-40-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium dihydrogenphosphate</td>
			<td>Aldrich Chemical</td>
			<td>EC231-913-4 
			CAS NO. 7778-77-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>S+A2:E36odium chloride</td>
			<td>Kemaus</td>
			<td>KA465 
			CAS NO. 7647-14-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissors 11 cm.</td>
			<td>Spall Stainless</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissors 14 cm.</td>
			<td>Spall Stainless</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium bicarbonate</td>
			<td>Ajax Finechem</td>
			<td>475 
			CAS NO. 912466</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dihydrogenphosphate</td>
			<td>Aldrich Chemical</td>
			<td>33,198-8 
			CAS NO. 7558-80-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide</td>
			<td>Ajax Finechem</td>
			<td>482 
			CAS NO. 1506196602</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium thiopental</td>
			<td>Anesthal</td>
			<td>JPN3010002 
			CAS NO. 1C 314/47</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taurine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T0625 
			CAS NO. 107-35-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Waterbath WBU 45</td>
			<td>Memmert</td>
			<td>2766 
			CAS NO. -</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of intrapulmonary artery and smooth muscle cells to investigate vascular responses

De intrapulmonale slagader (IPA) en vasculaire gladde spiercellen (VSMC's) geïsoleerd uit rattenlongen kunnen worden gebruikt om de onderliggende mechanismen van vasoconstrictie en vasorelaxatie te bestuderen. Na het isoleren van de IPA en VSMC's kunnen de kenmerken van vasculaire reacties in fysiologische en pathologische omstandigheden worden beoordeeld in afwezigheid van extrinsieke factoren zoals zenuwsignalen, hormonen, cytokines, enz. De IPA en VSMC's dienen dus als uitstekende modellen voor het bestuderen van vasculaire fysiologie / pathofysiologie, samen met verschillende experimentele onderzoeken, zoals modulatie door farmacologische middelen, patch-clamp elektrofysiologische analyse, calciumbeeldvorming, enz. Hier hebben we een techniek gebruikt voor het isoleren van de IPA om vasculaire reacties in een orgaanbadopstelling te onderzoeken. IPA-segmenten werden via intraluminale draden op de orgelbadkamer gemonteerd en gestimuleerd door verschillende farmacologische middelen. De veranderingen in de IPA vasculaire tonus (d.w.z. vasoconstrictie en vasorelaxatie) werden geregistreerd met behulp van een isometrische krachttransducer en fysiologische data-analysesoftwareprogramma. We hebben verschillende experimentele protocollen geïmplementeerd, die kunnen worden aangepast om de mechanismen van vasorelaxatie / vasoconstrictie te onderzoeken voor het bestuderen van de farmacologische activiteiten van fytochemische of synthetische geneesmiddelen. De protocollen kunnen ook worden gebruikt om de rol van geneesmiddelen bij het moduleren van verschillende ziekten, waaronder pulmonale arteriële hypertensie, te evalueren. Het IPA-model stelt ons in staat om de concentratie-responscurve te onderzoeken, die cruciaal is bij het beoordelen van de farmacodynamische parameters van geneesmiddelen.

Het protocol in deze studie is ontwikkeld om de optimale experimentele omstandigheden te bepalen voor het meten van fysiologische verschijnselen waargenomen in de vasculaire reacties van geïsoleerde IPA-preparaten. De proefexperimenten werden uitgevoerd om de mogelijke uitkomsten te beschrijven die helpen bij het begrijpen van de vasculaire effecten en de mechanistische basis van de vasorelaxante werking van het plantenextract, als volgt.
Vasorelaxant effect van het plantenextract</st...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Intrapulmonary Artery and Smooth Muscle Cells to Investigate Vascular Responses at JoVE.com

Isolation of Intrapulmonary Artery and Smooth Muscle Cells to Investigate Vascular Responses

Vasculaire reacties van arteriële pulmonale circulatie kunnen worden onderzocht met behulp van intrapulmonale slagader (IPA) en vasculaire gladde spiercellen (VSMC's). De huidige studie beschrijft de isolatie van IPA in detail en de protocollen die worden gebruikt voor het onderzoeken van vasorelaxatie als reactie op fysiologische stimuli.

Isolatie van intrapulmonale slagader en gladde spiercellen om vasculaire reacties te onderzoeken

The intrapulmonary artery (IPA) and vascular smooth muscle cells (VSMCs) isolated from rat lungs can be used to study the underlying mechanisms of ...

Deze studie beschrijft het isoleren van intrapulmonale slagader- en vasculaire gladde spiercellen van ratten. Verschillende experimentele protocollen werden gebruikt, zoals het gebruik van de orgaanbadtechniek om de vasculaire respons van de intrapulmonale slagader te onderzoeken. Intrapulmonale slagaders en vasculaire gladde spiercellen zijn uitstekende modellen om vasculaire fysiologie en pathofysiologie te bestuderen.Aanpassingen van deze techniek kunnen vasculaire reacties van geneesmiddelen, extracten of fytochemicaliën evalueren. Het monteren van de geïsoleerde intrapulmonale arteriële ring in een orgaanbad maakt het gebruik van geïsoleerde intrapulmonale slagaders mogelijk om de rol van een geneesmiddel bij het moduleren van verschillende ziekten, waaronder pulmonale hypertensie, te evalueren. De experimentele protocollen zijn technisch haalbaar, maar de cruciale stappen zijn ingewikkeld en essentieel voor succes, dus het hebben van een visuele demonstratie maakt het gemakkelijker te begrijpen en te volgen.De procedure wordt gedemonstreerd door Kittiwoot To-on, een masterstudent in fysiologie van het Cardiovascular Research Unit Laboratory, Department of Physiology, Faculty of Medical Science, Naresuan University. Begin met het snijden van een enkele kwab van de long met een schaar van 11 centimeter en plaats deze op een petrischaal van negen centimeter met de mediale kant, of wortel van de long, naar boven gericht. Observeer en identificeer de uitlijning van de ader, bronchia en slagader van boven naar beneden.Knip de bronchus in de lengterichting open met een schaar. Gebruik vervolgens de tang van 11 centimeter om de punt van de bronchus te pakken. Ontleed en verwijder voorzichtig de bronchus en aderen uit de long.Gebruik de tang om de punt van de intrapulmonale slagader te pakken en ontleed deze voorzichtig uit het longweefsel met een schaar. Bewaar de geïsoleerde intrapulmonale slagader in koude Krebs-oplossing totdat het orgaanbad is opgezet. Na het isoleren van de intrapulmonale slagader, knipt u de hoofdtak van de intrapulmonale slagader in de lengterichting open met de schaar van 11 centimeter en snijdt u in stroken van twee millimeter.Dompel de intrapulmonale slagaderstrips onder in DM en incubeer de strips vervolgens gedurende een uur bij vier graden Celsius in DM met één milligram per milliliter papaïne, 0,04% BSA en 0,4 millimolar DTT. Incubeer vervolgens bij 37 graden Celsius gedurende 15 minuten. Voeg één milligram per milliliter collagenase type IA toe in DM en incubeer opnieuw bij 37 graden Celsius gedurende vijf minuten.Breng de weefsels over in verse DM en dispergeer door zachte trituratie met behulp van een glazen Pasteur-pipet. Blijf tritureren totdat geïsoleerde vasculaire gladde spiercellen zichtbaar worden in de badoplossing onder de microscoop. Isoleer de intrapulmonale slagader zoals eerder aangetoond en snijd de hoofdtak van de intrapulmonale slagader in ringen van ongeveer twee millimeter lang.Bevestig de intrapulmonale slagaderringen in orgaanbadkamers door ze op twee roestvrijstalen draden met een diameter van 40 micrometer te rijgen. Bevestig roestvrijstalen draden gemonteerd met intrapulmonale slagaderringen aan de isometrische krachttransducers die zijn aangesloten op het gegevensverzamelingsapparaat en het computersysteem dat is geïnstalleerd met de geschikte fysiologische software voor gegevensregistratie en -analyse. Verhoog vervolgens voorzichtig de spanning van de intrapulmonale slagaderring tot één gram.Laat de segmenten van het vat ongeveer 45 minuten in evenwicht zijn bij een rustspanning van één gram. Zorg er tijdens de evenwichtsperiode voor dat de Krebs-oplossing regelmatig om de 15 minuten wordt vervangen. Test na equilibratie de levensvatbaarheid van de vaten door hun vasoconstrictie tot een hoge extracellulaire kaliumoplossing te meten.Beoordeel de aan- of afwezigheid van endotheel door de ontspanningsrespons op acetylcholine in ringen te berekenen die vooraf zijn gecontracteerd met PE. Verwijder het endotheel mechanisch door zachtjes met een draadje over de binnenkant van het vat te wrijven om denudatie te induceren. Breng vervolgens de arteriële ringen gedurende 30 minuten in evenwicht voordat de testexperimenten beginnen. Onderzoek het relaxerende effect van het plantenextract door intrapulmonale slagaderringen met PE vooraf samen te trekken. Voeg vervolgens voorzichtig 0,1 tot 1000 microgram per milliliter van het plantenextract cumulatief toe aan endotheel intacte ringen en endotheel-gedenatraliseerde ringen om vasorelaxatie te induceren en een concentratieafhankelijke responscurve te verkrijgen.Zorg ervoor dat de effectieve DMSO die als oplosmiddel wordt gebruikt, ook op dezelfde manier wordt geëvalueerd om als negatieve controle te dienen. Evalueer het vasorelaxant werkingsmechanisme van het plantenextract zoals vermeld in het tekstmanuscript. Voeg vervolgens na de samentrekkingen tot PE-stabilisatie cumulatieve concentraties van het plantenextract toe.Presenteer de effecten van plantenextract als procentuele ontspanning van de intrapulmonale slagaderringen in aanwezigheid van remmers in vergelijking met de respons van de intrapulmonale slagaderringen zonder remmers en construeer de concentratieresponscurve. In endotheel intacte intrapulmonale slagader veroorzaakte het plantenextract een concentratieafhankelijke reactie van vasorelaxatie. Uitroeiing van endotheel verminderde de vasorelaxatie geïnduceerd door het plantenextract grondig, zoals weerspiegeld door de toename van de EC50 met 2,2-voudig, remming van eNOS en EDHF verminderde duidelijk de vasorelaxante reactie op het plantenextract.Hierdoor verschoof de concentratieresponscurve naar rechts en steeg de EC50 zonder de E max-waarden te wijzigen. Integendeel, Indomethacine vertoonde geen effect op de vasorelaxante reactie op het plantenextract. In de endotheel-gedenudeerde intrapulmonale slagaderringen verminderden calcium-geactiveerde kaliumkanaalblokkers de vasorelaxante respons op het plantenextract.Terwijl blokkers van spanningsafhankelijke of ATP-gevoelige kaliumkanalen geen afwijking vertoonden. Preïncubatie met het plantenextract remde de door calciumchloride geïnduceerde contractie. De endotheel-gedenudeerde intrapulmonale slagaderringen vooraf geïncubeerd met calciumvrije Krebs-oplossing en PE gaven een voorbijgaande contractie.In vergelijking met het voertuig verminderden de plantenextracten de door PE geïnduceerde contractie aanzienlijk. Tijdens de procedure moet men ader, bronchia en slagader al vroeg duidelijk identificeren. Het snijden of beschadigen van de slagader zal de lengte verminderen en de vasculaire reacties beïnvloeden. Deze techniek kan worden aangepast om verbindingen te onderzoeken die kunnen dienen als prototypes voor behandelingen van pulmonale vaatziekten zoals pulmonale arteriële hypertensie.

Research

JoVE Journal

Medicine

Mesenteric Artery Contraction and Relaxation Studies Using Automated Wire Myography

A. mesenterica samentrekking en ontspanning Studies met behulp van geautomatiseerde Wire Myography

Proximal resistance vessels, such as the mesenteric arteries, contribute substantially to the peripheral resistance. These small vessels of between ...

Training a Sophisticated Microsurgical Technique: Interposition of External Jugular Vein Graft in the Common Carotid Artery in Rats

Opleiding van een geavanceerde Microchirurgische Techniek: tussenkomst van externe halsader Graft in de gemeenschappelijke halsslagader bij ratten

Neointimal hyperplasia is one the primary causes of stenosis in arterialized veins that are of great importance in arterial coronary bypass surgery, in ...

Assessment of Right Ventricular Structure and Function in Mouse Model of Pulmonary Artery Constriction by Transthoracic Echocardiography

Beoordeling van de rechter ventrikel structuur en functie in een muismodel van longslagader Vernauwing door Transthoracale Echocardiografie

Emerging clinical data support the notion that RV dysfunction is critical to the pathogenesis of cardiovascular disease and heart failure1-3. Moreover, ...

Bladder Smooth Muscle Strip Contractility as a Method to Evaluate Lower Urinary Tract Pharmacology

Gladde blaasspier Strip Contractiliteit als een methode om te evalueren Lower Urinary Tract Farmacologie

We describe an in vitro method to measure bladder smooth muscle contractility, and its use for investigating physiological and pharmacological properties ...

Embolic Middle Cerebral Artery Occlusion (MCAO) for Ischemic Stroke with Homologous Blood Clots in Rats

Embolic Middle Cerebral Artery Occlusion MCAO for Ischemic Stroke with Homologous Blood Clots in Rats

Embolische midden cerebrale slagader occlusie (MCAO) voor ischemische beroerte met homologe bloedstolsels in Ratten

Clinically, thrombolytic therapy with use of recombinant tissue plasminogen activator (tPA) remains the most effective treatment for acute ischemic ...

Vascular Balloon Injury and Intraluminal Administration in Rat Carotid Artery

Vasculaire Ballon Letsel en Intraluminale Administration in Rat halsslagader

The carotid artery balloon injury model in rats has been well established for over two decades. It remains an important method to study the molecular and ...

Permanent Ligation of the Left Anterior Descending Coronary Artery in Mice: A Model of Post-myocardial Infarction Remodelling and Heart Failure

Permanente Ligatie van de linker anterior Aflopend Kransslagader in Muizen: Een model van Post-myocardinfarct Remodelling en hartfalen

Heart failure is a syndrome in which the heart fails to pump blood at a rate commensurate with cellular oxygen requirements at rest or during stress. It ...

Ultrasound Based Assessment of Coronary Artery Flow and Coronary Flow Reserve Using the Pressure Overload Model in Mice

Echografie gebaseerde beoordeling van coronaire Flow en Coronaire Flow Reserve Met behulp van de druk overbelasting Model in Muizen

Transthoracic Doppler echocardiography (TTDE) is a clinically useful, noninvasive tool for studying coronary artery flow velocity and coronary flow ...

Ferric Chloride-induced Thrombosis Mouse Model on Carotid Artery and Mesentery Vessel

Ferric-Chloride geïnduceerde trombose Muis Model op halsslagader en Mesenterium Vessel

Severe thrombosis and its ischemic consequences such as myocardial infarction, pulmonary embolism and stroke are major worldwide health issues. The ferric ...

Calcification of Vascular Smooth Muscle Cells and Imaging of Aortic Calcification and Inflammation

Verkalking van vasculaire gladde spiercellen en Imaging van Aorta verkalking en Ontsteking

Cardiovascular disease is the leading cause of morbidity and mortality in the world.  Atherosclerotic plaques, consisting of lipid-laden macrophages and ...