Name: isolation of intrapulmonary artery and smooth muscle cells to investigate vascular responses
Uploaded: 2022-06-08T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Intrapulmonary Artery and Smooth Muscle Cells to Investigate Vascular Responses at JoVE.com

Les auteurs tiennent à remercier le Conseil national de recherches de Thaïlande, le Centre d’excellence pour l’innovation en chimie (PERCH-CIC) et le Réseau international de recherche (IRN61W0005) pour leur soutien financier, ainsi que le Département de physiologie de la Faculté des sciences médicales de l’Université de Naresuan pour le soutien aux installations de recherche.

Les expériences réalisées dans cette étude ont été approuvées par le Comité d’éthique du Comité de soin et d’utilisation des animaux de l’Université de Naresuan (NUACUC), numéro de protocole NU-AE620921, pour le soin et l’utilisation des animaux à des fins scientifiques.
1. Composition des solutions physiologiques
<ol><li>Formuler la solution de Krebs en dissolvant des produits chimiques dans de l’eau distillée pour obtenir les concentrations finales ...

<ol>
	<li>Lyle, M. A., Davis, J. P., Brozovich, F. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+pulmonary+vascular+smooth+muscle+contractility+in+pulmonary+arterial+hypertension:+Implications+for+therapy.">Regulation of pulmonary vascular smooth muscle contractility in pulmonary arterial hypertension: Implications for therapy.</a> Frontiers in Physiology. 8, 614 (2017).</li><li>Cyr, A. R., Huckaby, L. V., Shiva, S. S., Zuckerbraun, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nitric+oxide+and+endothelial+dysfunction.">Nitric oxide and endothelial dysfunction.</a> Critical Care Clinics. 36 (2), 307-321 (2020).</li><li>Ruan, K. -. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advance+in+understanding+the+biosynthesis+of+prostacyclin+and+thromboxane+A2+in+the+endoplasmic+reticulum+membrane+via+the+cyclo-oxygenase+pathway.">Advance in understanding the biosynthesis of prostacyclin and thromboxane A2 in the endoplasmic reticulum membrane via the cyclo-oxygenase pathway.</a> Mini Reviews in Medicinal Chemistry. 4 (6), 639-647 (2004).</li><li>Del Pozo, R., Hernandez Gonzalez, I., Escribano-Subias, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+prostacyclin+pathway+in+pulmonary+arterial+hypertension:+A+clinical+review.">The prostacyclin pathway in pulmonary arterial hypertension: A clinical review.</a> Expert Review of Respiratory Medicine. 11 (6), 491-503 (2017).</li><li>Morgado, M., Cairr&#227;o, E., Santos-Silva, A. J., Verde, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cyclic+nucleotide-dependent+relaxation+pathways+in+vascular+smooth+muscle.">Cyclic nucleotide-dependent relaxation pathways in vascular smooth muscle.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 69 (2), 247-266 (2012).</li><li>Schmidt, K., de Wit, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelium-derived+hyperpolarizing+factor+and+myoendothelial+coupling:+The+in+vivo+perspective.">Endothelium-derived hyperpolarizing factor and myoendothelial coupling: The in vivo perspective.</a> Frontiers in Physiology. 11, (2020).</li><li>Fan, G., Cui, Y., Gollasch, M., Kassmann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elementary+calcium+signaling+in+arterial+smooth+muscle.">Elementary calcium signaling in arterial smooth muscle.</a> Channels. 13 (1), 505-519 (2019).</li><li>Wisutthathum, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extract+of+Aquilaria+crassna+leaves+and+mangiferin+are+vasodilators+while+showing+no+cytotoxicity.">Extract of Aquilaria crassna leaves and mangiferin are vasodilators while showing no cytotoxicity.</a> Journal of Traditional and Complementary Medicine. 9 (4), 237-242 (2019).</li><li>Kamkaew, N., Paracha, T. U., Ingkaninan, K., Waranuch, N., Chootip, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vasodilatory+effects+and+mechanisms+of+action+of+Bacopa+monnieri+active+compounds+on+rat+mesenteric+arteries.">Vasodilatory effects and mechanisms of action of Bacopa monnieri active compounds on rat mesenteric arteries.</a> Molecules. 24 (12), 2243 (2019).</li><li>Chootip, K., Kennedy, C., Gurney, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+P2+receptors+mediating+contraction+of+the+rat+isolated+pulmonary+vasculature.">Characterization of P2 receptors mediating contraction of the rat isolated pulmonary vasculature.</a> British Journal of Pharmacology. 131, 167 (2000).</li><li>Paracha, T. U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elucidation+of+vasodilation+response+and+structure+activity+relationships+of+N2,+N4-disubstituted+quinazoline+2,+4-diamines+in+a+rat+pulmonary+artery+model.">Elucidation of vasodilation response and structure activity relationships of N2, N4-disubstituted quinazoline 2, 4-diamines in a rat pulmonary artery model.</a> Molecules. 24 (2), 281 (2019).</li><li>Chootip, K., Gurney, A. M., Kennedy, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+P2Y+receptors+couple+to+calcium-dependent,+chloride+channels+in+smooth+muscle+cells+of+the+rat+pulmonary+artery.">Multiple P2Y receptors couple to calcium-dependent, chloride channels in smooth muscle cells of the rat pulmonary artery.</a> Respiratory Research. 6 (1), 1-10 (2005).</li><li>Wisutthathum, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Eulophia+macrobulbon+extract+relaxes+rat+isolated+pulmonary+artery+and+protects+against+monocrotaline-induced+pulmonary+arterial+hypertension.">Eulophia macrobulbon extract relaxes rat isolated pulmonary artery and protects against monocrotaline-induced pulmonary arterial hypertension.</a> Phytomedicine. 50, 157-165 (2018).</li><li>Kruangtip, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Curcumin+analogues+inhibit+phosphodiesterase-5+and+dilate+rat+pulmonary+arteries.">Curcumin analogues inhibit phosphodiesterase-5 and dilate rat pulmonary arteries.</a> Journal of Pharmacy and Pharmacology. 67 (1), 87-95 (2015).</li></ol>

Dans ce manuscrit, nous décrivons la technique d’isolement des rats IPA et des VSMC. Plusieurs protocoles expérimentaux ont été utilisés pour étudier la réponse vasculaire de l’IPA in vitro, qui peut être utilisée pour caractériser l’effet pharmacologique et la base mécaniste de la vasorelaxation IPA induite par l’extrait de plante.
En ce qui concerne l’action vasodilatatrice dépendante de l’endothélium de l’extrait de plante, divers bloqueurs tels que L-NAM...

Le système vasculaire pulmonaire est un système vasculaire à basse pression dont la fonction principale est de fournir du sang désoxygéné à la zone d’échange de gaz des poumons. Les artères pulmonaires dans les poumons sont disposées en branches parallèles à l’arbre bronchique, formant finalement un vaste réseau de capillaires qui est continu sur plusieurs alvéoles et, enfin, se rejoignant en veinules et veines. Le tonus vasculaire de l’artère pulmonaire est contrôlé par plusieurs facteurs, impliquant l’interaction entre l’endothélium et les cellules musculaires lisses vasculaires (VSMC)1.
Dans cette étude, nous nous concentrons sur la vasorelaxation dépendante et indépendante de l’endothélium de l’artère intrapulmonaire (API). En ce qui concerne la vasorelaxation dépendante de l’endothélium, divers mécanismes se produisant à la surface des cellules endothéliales pourraient augmenter la concentration intracellulaire de Ca2+ (p. ex., l’acétylcholine [ACh] se lie au récepteur muscarinique [M3]), conduisant à la formation d’oxyde nitrique (NO), de prostacycline (PGl2) et de facteur hyperpolarisant dérivé de l’endothélium (EDHF) (Figure 1 ). Le NO est le principal facteur de relaxation dérivé de l’endothélium synthétisé à partir de la L-arginine par l’oxyde nitrique synthase endothéliale (eNOS)2, qui se dissocie ensuite des cellules endothéliales en VSMC (Figure 1) et stimule l’enzyme soluble guanylyl cyclase (sGC) ; cette enzyme transforme la guanosine triphosphate (GTP) en guanosine monophosphate cyclique (GMPc), qui active la protéine kinase G (PKG) et réduit les niveaux cytosoliques de Ca2+, provoquant ainsi une vasorelaxation (Figure 1). PGl2 est synthétisé par les cellules endothéliales via la voie cyclo-oxygénase (COX) 3,4. Il se lie au récepteur de la prostacycline (IP) sur les VSMC et stimule l’enzyme adénylyl cyclase (AC), qui convertit ensuite l’adénosine triphosphate (ATP) en adénosine monophosphate cyclique (AMPc) (Figure 1)3,4. L’AMPc active la protéine kinase A (PKA), réduisant les taux cytosoliques de Ca2+ et provoquant une vasorelaxation5 (Figure 1). La voie EDHF participe également à la vasorelaxation dépendante de l’endothélium via divers médiateurs endothéliaux et événements électriques. L’activation de la voie EDHF conduit à l’hyperpolarisation des VSMC, fermant ainsi les canaux Ca 2+ (VOCC) actionnés par tension, réduisant les niveaux intracellulaires de Ca 2+ et induisant une vasorelaxation 6. La vasorelaxation indépendante de l’endothélium se produit directement sur les VSMC via plusieurs mécanismes, tels que la réduction du niveau intracellulaire de Ca 2+, l’inhibition de la myosine light chain kinase (MLCK), l’activation de la myosine phosphatase à chaîne légère (MLCP) et la réduction de la sensibilité Ca2+ à la machinerie contractile des VSMC. Dans cette étude, nous nous concentrons sur la vasorelaxation causée par l’ouverture de divers canaux K+, le blocage des VOCC et l’inhibition de la libération de Ca 2+ par le réticulum sarcoplasmique7, ce qui conduit à la réduction des niveaux intracellulaires de Ca 2+, diminuant ainsi la phosphorylation de la chaîne légère de la myosine VSMC et la liaison myosine-actine ou la formation de ponts croisés, respectivement, aboutissant finalement à une vasorelaxation.
La technique d’évaluation des mesures de vasoconstriction et de vasorelaxation dans l’IPA isolé est bien établie pour les rongeurs, mais les données variaient selon les protocoles expérimentaux. La présente étude décrit la méthode utilisée pour évaluer les réactivités vasculaires de préparations IPA in vitro de rat, qui ont été réalisées en l’absence de facteurs externes modulant la réponse vasculaire in vivo, tels que les signaux nerveux, les hormones, les cytokines, la pression artérielle, etc.
Nous avons utilisé plusieurs protocoles expérimentaux utilisant l’extrait de plante comme exemple pour étudier les réactivités vasculaires de l’API. Différents bloqueurs (Figure 1) ont été utilisés pour identifier les mécanismes de vasorelaxation dépendante et indépendante de l’endothélium induite par l’extrait de plante. Néanmoins, les mêmes protocoles peuvent être adaptés pour évaluer les réponses vasculaires de l’IPA à tout médicament, extrait ou phytochimique utilisé pour le traitement de diverses pathologies pulmonaires.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1,4-dithiothreitol (DTT)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D0632 
			CAS NO. 348-12-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-aminopyridine (4-AP)</td>
			<td>Aldrich Chemical</td>
			<td>A78403 
			CAS NO. 504-24-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetylcholine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A6625 
			CAS NO. 60-31-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Apamin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9459 
			CAS NO. 24345-16-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A2153 
			CAS NO. 9048-46-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium choride</td>
			<td>Ajax Finechem</td>
			<td>AJA960 
			CAS NO. 1707055184</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Charybdotoxin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C7802 
			CAS NO. 95751-30-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase type 1A</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C9891 
			CAS NO. 9001-12-1</td>
			<td>From Clostridium histolyticum</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D(+)-Glucose monohydrate</td>
			<td>Millipore Corporation</td>
			<td>K50876942 924 
			CAS NO. 14431-43-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D4540 
			CAS NO. 67-68-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylene glycol-bis (2-aminoethylether)-N,N,N&#8217;,N&#8217;-tetraacetic acid (EGTA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E3889 
			CAS NO. 67-42-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E9884 
			CAS NO. 60-00-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps 11 cm.</td>
			<td>Rustless Dumoxel</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps 14 cm.</td>
			<td>Rustless Dumoxel</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glibenclamide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G6039 
			CAS NO. 16673-34-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GraphPad Prism program</td>
			<td>Software version 5.0 (San Diego, CA, USA)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H3375 
			CAS NO. 7365-45-9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iberiotoxin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I5904 
			CAS NO. 1002546960</td>
			<td>recombinant from Mesobuthus tamulus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Indomethacin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I7378 
			CAS NO. 53-86-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Labchart Program</td>
			<td>Software version 7.0 (A.D. Instrument, Castle Hill, Australia).</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride</td>
			<td>Ajax Finechem</td>
			<td>296 
			CAS NO. 1506254995</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Male Wistar rats</td>
			<td>Nomura Siam International Co. Ltd., Bangkok, Thailand</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NG-nitro-L-arginine methyl ester (L-NAME)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>N5751 
			CAS NO. 51298-62-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nicardipine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>N7510 
			CAS NO. 54527-84-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Organ bath 15 mL.</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Specific order by the researchers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Papain</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4762 
			CAS NO. 9001-73-4</td>
			<td>FromPapaya Latex</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenal red</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5530 
			CAS NO. 34487-61-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenylephrine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P6126 
			CAS NO. 61-76-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>Kemaus</td>
			<td>KA383 
			CAS NO. 7447-40-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium dihydrogenphosphate</td>
			<td>Aldrich Chemical</td>
			<td>EC231-913-4 
			CAS NO. 7778-77-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>S+A2:E36odium chloride</td>
			<td>Kemaus</td>
			<td>KA465 
			CAS NO. 7647-14-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissors 11 cm.</td>
			<td>Spall Stainless</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissors 14 cm.</td>
			<td>Spall Stainless</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium bicarbonate</td>
			<td>Ajax Finechem</td>
			<td>475 
			CAS NO. 912466</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dihydrogenphosphate</td>
			<td>Aldrich Chemical</td>
			<td>33,198-8 
			CAS NO. 7558-80-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide</td>
			<td>Ajax Finechem</td>
			<td>482 
			CAS NO. 1506196602</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium thiopental</td>
			<td>Anesthal</td>
			<td>JPN3010002 
			CAS NO. 1C 314/47</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taurine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T0625 
			CAS NO. 107-35-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Waterbath WBU 45</td>
			<td>Memmert</td>
			<td>2766 
			CAS NO. -</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of intrapulmonary artery and smooth muscle cells to investigate vascular responses

L’artère intrapulmonaire (API) et les cellules musculaires lisses vasculaires (VSMC) isolées des poumons de rat peuvent être utilisées pour étudier les mécanismes sous-jacents de la vasoconstriction et de la vasorelaxation. Après avoir isolé l’IPA et les VSMC, les caractéristiques des réponses vasculaires dans des conditions physiologiques et pathologiques peuvent être évaluées en l’absence de facteurs extrinsèques tels que les signaux nerveux, les hormones, les cytokines, etc. Ainsi, l’IPA et les VSMC sont d’excellents modèles pour l’étude de la physiologie/physiopathologie vasculaire, ainsi que diverses investigations expérimentales, telles que la modulation par des agents pharmacologiques, l’analyse électrophysiologique patch-clamp, l’imagerie calcique, etc. Ici, nous avons utilisé une technique pour isoler l’API afin d’étudier les réponses vasculaires dans une configuration de bain d’organes. Des segments d’IPA ont été montés sur la chambre du bain d’organes via des fils intraluminaux et stimulés par divers agents pharmacologiques. Les changements dans le tonus vasculaire de l’API (c.-à-d. vasoconstriction et vasorelaxation) ont été enregistrés à l’aide d’un transducteur de force isométrique et d’un logiciel d’analyse de données physiologiques. Nous avons mis en place plusieurs protocoles expérimentaux, qui peuvent être adaptés pour étudier les mécanismes de vasorelaxation/vasoconstriction pour étudier les activités pharmacologiques des médicaments phytochimiques ou synthétiques. Les protocoles peuvent également être utilisés pour évaluer le rôle des médicaments dans la modulation de diverses maladies, y compris l’hypertension artérielle pulmonaire. Le modèle IPA nous permet d’étudier la courbe concentration-réponse, ce qui est crucial pour évaluer les paramètres pharmacodynamiques des médicaments.

Le protocole de la présente étude a été développé pour déterminer les conditions expérimentales optimales pour mesurer les phénomènes physiologiques observés dans les réponses vasculaires de préparations IPA isolées. Les expériences pilotes ont été réalisées pour décrire les résultats potentiels qui aident à comprendre les effets vasculaires et la base mécaniste de l’action vasorelaxante de l’extrait de plante, comme suit.
Effet vasorelaxant de l’extrait de...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Intrapulmonary Artery and Smooth Muscle Cells to Investigate Vascular Responses at JoVE.com

Isolation of Intrapulmonary Artery and Smooth Muscle Cells to Investigate Vascular Responses

Les réponses vasculaires de la circulation pulmonaire artérielle peuvent être explorées à l’aide de l’artère intrapulmonaire (API) et des cellules musculaires lisses vasculaires (VSMC). La présente étude décrit en détail l’isolement de l’IPA et les protocoles utilisés pour étudier la vasorelaxation en réponse à des stimuli physiologiques.

Isolement de l’artère intrapulmonaire et des cellules musculaires lisses pour étudier les réponses vasculaires

The intrapulmonary artery (IPA) and vascular smooth muscle cells (VSMCs) isolated from rat lungs can be used to study the underlying mechanisms of ...

Cette étude décrit l’isolement des cellules de l’artère intrapulmonaire et des muscles lisses vasculaires du rat. Plusieurs protocoles expérimentaux ont été utilisés, tels que l’utilisation de la technique du bain d’organes pour étudier la réponse vasculaire de l’artère intrapulmonaire. Les artères intrapulmonaires et les cellules musculaires lisses vasculaires sont d’excellents modèles pour étudier la physiologie vasculaire et la physiopathologie.Les adaptations de cette technique pourraient évaluer les réponses vasculaires de tout médicament, extrait ou phytochimique. Le montage de l’anneau artériel intrapulmonaire isolé dans un bain d’organes permet d’utiliser des artères intrapulmonaires isolées pour évaluer le rôle d’un médicament dans la modulation de diverses maladies, y compris l’hypertension pulmonaire. Les protocoles expérimentaux sont techniquement réalisables, mais les étapes cruciales sont compliquées et essentielles au succès, de sorte que le fait d’avoir une démonstration visuelle facilite la compréhension et le suivi.Kittiwoot To-on, étudiante à la maîtrise en physiologie du laboratoire de l’unité de recherche cardiovasculaire, Département de physiologie, Faculté des sciences médicales, Université Naresuan, fera la démonstration de la procédure. Commencez par trancher un seul lobe du poumon avec des ciseaux de 11 centimètres et placez-le sur une boîte de Petri de neuf centimètres avec le côté médial, ou racine du poumon, tourné vers le haut. Observez et identifiez l’alignement de la veine, des bronches et de l’artère de haut en bas.Couper la bronche longitudinalement avec des ciseaux. Utilisez ensuite les pinces de 11 centimètres pour saisir la pointe de la bronche. Disséquez doucement et retirez les bronches et les veines du poumon.Utilisez la pince pour saisir l’extrémité de l’artère intrapulmonaire et disséquez-la soigneusement hors du tissu pulmonaire avec des ciseaux. Conserver l’artère intrapulmonaire isolée dans une solution froide de Krebs jusqu’à ce que l’ensemble du bain d’organes soit mis en place. Après avoir isolé l’artère intrapulmonaire, ouvrez la branche principale de l’artère intrapulmonaire longitudinalement avec les ciseaux de 11 centimètres et coupez en bandes de deux millimètres.Immerger les bandelettes artérielles intrapulmonaires dans DM, puis incuber les bandelettes pendant une heure à quatre degrés Celsius dans DM contenant un milligramme par millilitre de papaïne, 0,04% BSA et 0,4 millimolaire DTT. Puis incuber à 37 degrés Celsius pendant 15 minutes. Ajouter un milligramme par millilitre de collagénase de type IA dans DM, et incuber à nouveau à 37 degrés Celsius pendant cinq minutes.Transférer les tissus dans du DM frais et disperser par trituration douce à l’aide d’une pipette Pasteur en verre. Continuez à triturer jusqu’à ce que les cellules musculaires lisses vasculaires isolées deviennent visibles dans la solution de bain au microscope. Isoler l’artère intrapulmonaire comme démontré précédemment et couper la branche principale de l’artère intrapulmonaire en anneaux d’environ deux millimètres de longueur.Fixez les anneaux de l’artère intrapulmonaire dans les chambres des bains d’organes en les enfilant sur deux fils en acier inoxydable de 40 micromètres de diamètre. Fixez des fils en acier inoxydable montés avec des anneaux artériels intrapulmonaires aux capteurs de force isométriques connectés au dispositif d’acquisition de données et au système informatique installé avec le logiciel physiologique approprié pour l’enregistrement et l’analyse des données. Ensuite, augmentez doucement la tension de l’anneau artériel intrapulmonaire à un gramme.Laissez les segments du récipient s’équilibrer pendant environ 45 minutes à une tension au repos d’un gramme. Pendant la période d’équilibration, assurez-vous que la solution de Krebs est régulièrement changée toutes les 15 minutes. Après l’équilibre, tester la viabilité des vaisseaux en mesurant leur vasoconstriction à une solution de potassium extracellulaire élevée.Évaluer la présence ou l’absence d’endothélium en calculant la réponse de relaxation à l’acétylcholine dans les anneaux précontractés avec l’EP. Retirez mécaniquement l’endothélium en frottant doucement l’intérieur du vaisseau avec un petit fil pour provoquer la dénudation. Ensuite, équilibrez les anneaux artériels pendant 30 minutes avant le début des expériences d’essai. Étudier l’effet relaxant de l’extrait de plante en précontractant les anneaux artériels intrapulmonaires avec du PE. Ensuite, ajoutez soigneusement 0,1 à 1000 microgrammes par millilitre d’extrait de plante cumulativement aux cycles intacts de l’endothélium et aux cycles dénudés de l’endothélium pour induire une vasorelaxation et acquérir une courbe de réponse dépendante de la concentration.S’assurer que le DMSO efficace utilisé comme solvant est également évalué de la même manière pour servir de témoin négatif. Évaluer le mécanisme d’action vasorelaxant de l’extrait de plante tel que mentionné dans le manuscrit du texte. Ensuite, après la stabilisation des contractions au PE, ajoutez des concentrations cumulatives de l’extrait de plante.Présenter les effets de l’extrait de plante en pourcentage de relaxation des anneaux artériels intrapulmonaires en présence d’inhibiteurs par rapport à la réponse des anneaux artériels intrapulmonaires sans inhibiteurs et construire la courbe concentration-réponse. Dans l’artère intrapulmonaire intacte de l’endothélium, l’extrait de plante a provoqué une réponse de vasorelaxation dépendante de la concentration. L’éradication de l’endothélium a profondément réduit la vasorelaxation induite par l’extrait de plante, comme en témoigne l’augmentation de la CE50 de 2,2 fois, l’inhibition de l’eNOS et de l’EDHF a évidemment diminué la réponse vasorelaxante à l’extrait de plante.Cela a déplacé la courbe concentration-réponse vers la droite et augmenté la CE50 sans modifier les valeurs E max. Au contraire, l’indométacine n’a montré aucun effet sur la réponse vasorelaxante à l’extrait de plante. Dans les anneaux artères intrapulmonaires dénudés par l’endothélium, les inhibiteurs des canaux potassiques activés par le calcium ont diminué la réponse vasorelaxante à l’extrait de plante.Alors que les bloqueurs des canaux potassiques voltage-dépendants ou sensibles à l’ATP n’ont montré aucune déviation. La préincubation avec l’extrait de plante a inhibé la contraction induite par le chlorure de calcium. Les anneaux artériels intrapulmonaires dénudés par endothélium préincubés avec une solution de Krebs sans calcium et de l’EP ont provoqué une contraction transitoire.Par rapport au véhicule, les extraits végétaux ont significativement réduit la contraction induite par le PE. Au cours de la procédure, il faut clairement identifier la veine, les bronches et les artères dès le début. Couper ou endommager l’artère réduira sa longueur et affectera les réponses vasculaires. Cette technique peut être adaptée pour étudier des composés qui pourraient servir de prototypes pour les traitements des maladies vasculaires pulmonaires telles que l’hypertension artérielle pulmonaire.

Research

JoVE Journal

Medicine

Mesenteric Artery Contraction and Relaxation Studies Using Automated Wire Myography

Contraction artère mésentérique et des études de relaxation utilisant myographie fil automatisé

Proximal resistance vessels, such as the mesenteric arteries, contribute substantially to the peripheral resistance. These small vessels of between ...

Recherche

Médecine

Training a Sophisticated Microsurgical Technique: Interposition of External Jugular Vein Graft in the Common Carotid Artery in Rats

Former une technique microchirurgicale sophistiquée: Interposition de greffe veine jugulaire externe dans l&#39;artère carotide commune chez les rats

Neointimal hyperplasia is one the primary causes of stenosis in arterialized veins that are of great importance in arterial coronary bypass surgery, in ...

Assessment of Right Ventricular Structure and Function in Mouse Model of Pulmonary Artery Constriction by Transthoracic Echocardiography

Évaluation de ventriculaire droite Structure et fonction dans le modèle de souris de l&#39;artère pulmonaire constriction par échocardiographie transthoracique

Emerging clinical data support the notion that RV dysfunction is critical to the pathogenesis of cardiovascular disease and heart failure1-3. Moreover, ...

Bladder Smooth Muscle Strip Contractility as a Method to Evaluate Lower Urinary Tract Pharmacology

Vessie muscle lisse bande de contractilité comme une méthode pour évaluer urinaires inférieures Pharmacologie

We describe an in vitro method to measure bladder smooth muscle contractility, and its use for investigating physiological and pharmacological properties ...

Embolic Middle Cerebral Artery Occlusion (MCAO) for Ischemic Stroke with Homologous Blood Clots in Rats

Embolic Middle Cerebral Artery Occlusion MCAO for Ischemic Stroke with Homologous Blood Clots in Rats

Embolique Artère cérébrale moyenne occlusion (MCAO) pour AVC ischémique avec homologues caillots sanguins chez les rats

Clinically, thrombolytic therapy with use of recombinant tissue plasminogen activator (tPA) remains the most effective treatment for acute ischemic ...

Vascular Balloon Injury and Intraluminal Administration in Rat Carotid Artery

Vasculaire Balloon blessures et de l&#39;administration chez le rat Intraluminal artère carotide

The carotid artery balloon injury model in rats has been well established for over two decades. It remains an important method to study the molecular and ...

Permanent Ligation of the Left Anterior Descending Coronary Artery in Mice: A Model of Post-myocardial Infarction Remodelling and Heart Failure

Ligature permanente de l&#39;artère interventriculaire antérieure coronaire chez la souris: Un modèle de post-infarctus du myocarde et de remodelage de l&#39;insuffisance cardiaque

Heart failure is a syndrome in which the heart fails to pump blood at a rate commensurate with cellular oxygen requirements at rest or during stress. It ...

Ultrasound Based Assessment of Coronary Artery Flow and Coronary Flow Reserve Using the Pressure Overload Model in Mice

Évaluation Basé échographie de l&#39;artère coronaire de débit et de Flow Reserve coronaire Utilisation de la surcharge de pression modèle chez la souris

Transthoracic Doppler echocardiography (TTDE) is a clinically useful, noninvasive tool for studying coronary artery flow velocity and coronary flow ...

Ferric Chloride-induced Thrombosis Mouse Model on Carotid Artery and Mesentery Vessel

Chlorure ferrique induite souris thrombose type sur l&#39;artère carotide et Mesentery navire

Severe thrombosis and its ischemic consequences such as myocardial infarction, pulmonary embolism and stroke are major worldwide health issues. The ferric ...

Calcification of Vascular Smooth Muscle Cells and Imaging of Aortic Calcification and Inflammation

Calcification vasculaire des cellules musculaires lisses et imagerie de Aortic calcification et Inflammation

Cardiovascular disease is the leading cause of morbidity and mortality in the world.  Atherosclerotic plaques, consisting of lipid-laden macrophages and ...