Name: isolation of intrapulmonary artery and smooth muscle cells to investigate vascular responses
Uploaded: 2022-06-08T13:30:00
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Die Autoren danken dem National Research Council of Thailand, dem Center of Excellence for Innovation in Chemistry (PERCH-CIC) und dem International Research Network (IRN61W0005) für die finanzielle Unterstützung sowie dem Department of Physiology Faculty of Medical Science der Naresuan University für die Unterstützung von Forschungseinrichtungen.

Die in dieser Studie durchgeführten Experimente wurden von der Ethikkommission des Naresuan University Animal Care and Use Committee (NUACUC), Protokollnummer NU-AE620921, für die Pflege und Verwendung von Tieren für wissenschaftliche Zwecke genehmigt.
1. Zusammensetzung physiologischer Lösungen
<ol><li>Die Krebslösung wird durch Auflösen von Chemikalien in destilliertem Wasser formuliert, um die Endkonzentrationen wie folgt zu erreichen: 122 mM NaCl, 10 mM HEPES, 5 mM...

<ol>
	<li>Lyle, M. A., Davis, J. P., Brozovich, F. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+pulmonary+vascular+smooth+muscle+contractility+in+pulmonary+arterial+hypertension:+Implications+for+therapy.">Regulation of pulmonary vascular smooth muscle contractility in pulmonary arterial hypertension: Implications for therapy.</a> Frontiers in Physiology. 8, 614 (2017).</li><li>Cyr, A. R., Huckaby, L. V., Shiva, S. S., Zuckerbraun, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nitric+oxide+and+endothelial+dysfunction.">Nitric oxide and endothelial dysfunction.</a> Critical Care Clinics. 36 (2), 307-321 (2020).</li><li>Ruan, K. -. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advance+in+understanding+the+biosynthesis+of+prostacyclin+and+thromboxane+A2+in+the+endoplasmic+reticulum+membrane+via+the+cyclo-oxygenase+pathway.">Advance in understanding the biosynthesis of prostacyclin and thromboxane A2 in the endoplasmic reticulum membrane via the cyclo-oxygenase pathway.</a> Mini Reviews in Medicinal Chemistry. 4 (6), 639-647 (2004).</li><li>Del Pozo, R., Hernandez Gonzalez, I., Escribano-Subias, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+prostacyclin+pathway+in+pulmonary+arterial+hypertension:+A+clinical+review.">The prostacyclin pathway in pulmonary arterial hypertension: A clinical review.</a> Expert Review of Respiratory Medicine. 11 (6), 491-503 (2017).</li><li>Morgado, M., Cairr&#227;o, E., Santos-Silva, A. J., Verde, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cyclic+nucleotide-dependent+relaxation+pathways+in+vascular+smooth+muscle.">Cyclic nucleotide-dependent relaxation pathways in vascular smooth muscle.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 69 (2), 247-266 (2012).</li><li>Schmidt, K., de Wit, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelium-derived+hyperpolarizing+factor+and+myoendothelial+coupling:+The+in+vivo+perspective.">Endothelium-derived hyperpolarizing factor and myoendothelial coupling: The in vivo perspective.</a> Frontiers in Physiology. 11, (2020).</li><li>Fan, G., Cui, Y., Gollasch, M., Kassmann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elementary+calcium+signaling+in+arterial+smooth+muscle.">Elementary calcium signaling in arterial smooth muscle.</a> Channels. 13 (1), 505-519 (2019).</li><li>Wisutthathum, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extract+of+Aquilaria+crassna+leaves+and+mangiferin+are+vasodilators+while+showing+no+cytotoxicity.">Extract of Aquilaria crassna leaves and mangiferin are vasodilators while showing no cytotoxicity.</a> Journal of Traditional and Complementary Medicine. 9 (4), 237-242 (2019).</li><li>Kamkaew, N., Paracha, T. U., Ingkaninan, K., Waranuch, N., Chootip, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vasodilatory+effects+and+mechanisms+of+action+of+Bacopa+monnieri+active+compounds+on+rat+mesenteric+arteries.">Vasodilatory effects and mechanisms of action of Bacopa monnieri active compounds on rat mesenteric arteries.</a> Molecules. 24 (12), 2243 (2019).</li><li>Chootip, K., Kennedy, C., Gurney, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+P2+receptors+mediating+contraction+of+the+rat+isolated+pulmonary+vasculature.">Characterization of P2 receptors mediating contraction of the rat isolated pulmonary vasculature.</a> British Journal of Pharmacology. 131, 167 (2000).</li><li>Paracha, T. U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elucidation+of+vasodilation+response+and+structure+activity+relationships+of+N2,+N4-disubstituted+quinazoline+2,+4-diamines+in+a+rat+pulmonary+artery+model.">Elucidation of vasodilation response and structure activity relationships of N2, N4-disubstituted quinazoline 2, 4-diamines in a rat pulmonary artery model.</a> Molecules. 24 (2), 281 (2019).</li><li>Chootip, K., Gurney, A. M., Kennedy, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+P2Y+receptors+couple+to+calcium-dependent,+chloride+channels+in+smooth+muscle+cells+of+the+rat+pulmonary+artery.">Multiple P2Y receptors couple to calcium-dependent, chloride channels in smooth muscle cells of the rat pulmonary artery.</a> Respiratory Research. 6 (1), 1-10 (2005).</li><li>Wisutthathum, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Eulophia+macrobulbon+extract+relaxes+rat+isolated+pulmonary+artery+and+protects+against+monocrotaline-induced+pulmonary+arterial+hypertension.">Eulophia macrobulbon extract relaxes rat isolated pulmonary artery and protects against monocrotaline-induced pulmonary arterial hypertension.</a> Phytomedicine. 50, 157-165 (2018).</li><li>Kruangtip, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Curcumin+analogues+inhibit+phosphodiesterase-5+and+dilate+rat+pulmonary+arteries.">Curcumin analogues inhibit phosphodiesterase-5 and dilate rat pulmonary arteries.</a> Journal of Pharmacy and Pharmacology. 67 (1), 87-95 (2015).</li></ol>

In diesem Manuskript beschreiben wir die Technik zur Isolierung von Ratten-IPA und VSMCs. Mehrere experimentelle Protokolle wurden verwendet, um die vaskuläre Reaktion von IPA in vitro zu untersuchen, die verwendet werden kann, um die pharmakologische Wirkung und mechanistische Grundlage der durch Pflanzenextrakt induzierten IPA-Vasorelaxation zu charakterisieren.
Hinsichtlich der endothelabhängigen gefäßerweiternden Wirkung des Pflanzenextrakts wurden verschiedene Blocker wie L-N...

Das Lungengefäßsystem ist ein Niederdruck-Gefäßsystem, in dem die Hauptfunktion darin besteht, sauerstoffarmes Blut in den gasaustauschenden Bereich der Lunge zu liefern. Die Lungenarterien in der Lunge sind in Ästen parallel zum Bronchialbaum angeordnet und bilden schließlich ein ausgedehntes Netzwerk von Kapillaren, das sich über mehrere Alveolen erstreckt und schließlich zu Venolen und Venen zusammenführt. Der Gefäßtonus der Lungenarterie wird durch mehrere Faktoren gesteuert, die die Interaktion zwischen dem Endothel und den vaskulären glatten Muskelzellen (VSMCs) beinhalten1.
In dieser Studie konzentrieren wir uns auf die endothelabhängige und -unabhängige Vasorelaxation der intrapulmonalen Arterie (IPA). Im Hinblick auf die endothelabhängige Vasorelaxation könnten verschiedene Mechanismen, die auf der Oberfläche von Endothelzellen auftreten, die intrazelluläre Ca2+-Konzentration erhöhen (z.B. bindet Acetylcholin [ACh] an Muskarinrezeptor [M3]), was zur Bildung von Stickstoffmonoxid (NO), Prostacyclin (PGl2) und Endothel-abgeleitetem Hyperpolarisationsfaktor (EDHF) führt (Abbildung 1 ). NO ist der wichtigste Endothel-abgeleitete Entspannungsfaktor, der aus L-Arginin durch endotheliale Stickstoffmonoxid-Synthase (eNOS)2 synthetisiert wird, die dann aus den Endothelzellen zu VSMCs dissoziiert (Abbildung 1) und das Enzym lösliche Guanylylzyklase (sGC) stimuliert; Dieses Enzym wandelt Guanosintriphosphat (GTP) in zyklisches Guanosinmonophosphat (cGMP) um, das die Proteinkinase G (PKG) aktiviert und den zytosolischen Ca2+-Spiegel senkt, wodurch eine Vasorelaxation verursacht wird (Abbildung 1). PGl2 wird von Endothelzellen über den Cyclooxygenase (COX) -Weg 3,4 synthetisiert. Es bindet an den Prostacyclinrezeptor (IP) auf VSMCs und stimuliert das Enzym Adenylylzyklase (AC), das dann Adenosintriphosphat (ATP) in zyklisches Adenosinmonophosphat (cAMP) umwandelt (Abbildung 1)3,4. cAMP aktiviert die Proteinkinase A (PKA), senkt den zytosolischen Ca2+-Spiegel und verursacht Vasorelaxation5 (Abbildung 1). Der EDHF-Signalweg ist auch an der endothelabhängigen Vasorelaxation über verschiedene endotheliale Mediatoren und elektrische Ereignisse beteiligt. Die Aktivierung des EDHF-Signalwegs führt zur Hyperpolarisation von VSMCs, wodurch spannungsbetriebene Ca 2+ Kanäle (VOCCs) geschlossen, intrazelluläre Ca2+ Spiegel reduziert und Vasorelaxation induziertwerden 6. Die endothelunabhängige Vasorelaxation erfolgt direkt an VSMCs über mehrere Mechanismen, wie die Reduktion des intrazellulären Ca 2+ Spiegels, die Hemmung der Myosin Light Chain Kinase (MLCK), die Aktivierung der Myosin Light Chain Phosphatase (MLCP) und die Reduktion der Ca2+ Sensitivität gegenüber der kontraktilen Maschinerie von VSMCs. In dieser Studie konzentrieren wir uns auf die Vasorelaxation, die durch die Öffnung verschiedener K+-Kanäle, die Blockade von VOCCs und die Hemmung der Ca 2+-Freisetzung aus dem sarkoplasmatischen Retikulum7 verursacht wird, was zur Senkung der intrazellulären Ca 2+-Spiegel führt, wodurch die VSMC-Myosin-Leichtkettenphosphorylierung bzw. die Myosin-Aktin-Bindung bzw. Querbrückenbildung verringert wird. letztendlich zu Vasorelaxation führen.
Die Technik zur Auswertung von Vasokonstriktions- und Vasorelaxationsmessungen in isoliertem IPA ist für Nagetiere gut etabliert, aber die Daten variierten je nach den experimentellen Protokollen. Die vorliegende Studie beschreibt die Methode zur Bewertung der vaskulären Reaktivitäten von IPA-Präparaten der Ratte in vitro, die in Abwesenheit externer Faktoren, die die vaskuläre Reaktion in vivo modulieren, wie Nervensignale, Hormone, Zytokine, Blutdruck usw., durchgeführt wurden.
Wir verwendeten mehrere experimentelle Protokolle mit dem Pflanzenextrakt als Beispiel für die Untersuchung der vaskulären Reaktivitäten von IPA. Verschiedene Blocker (Abbildung 1) wurden verwendet, um die Mechanismen der endothelabhängigen und -unabhängigen Vasorelaxation zu identifizieren, die durch den Pflanzenextrakt induziert werden. Dennoch können die gleichen Protokolle angepasst werden, um die vaskulären Reaktionen von IPA auf Medikamente, Extrakte oder sekundäre Pflanzenstoffe zu bewerten, die zur Behandlung verschiedener Lungenpathologien verwendet werden.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1,4-dithiothreitol (DTT)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D0632 
			CAS NO. 348-12-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-aminopyridine (4-AP)</td>
			<td>Aldrich Chemical</td>
			<td>A78403 
			CAS NO. 504-24-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetylcholine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A6625 
			CAS NO. 60-31-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Apamin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9459 
			CAS NO. 24345-16-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A2153 
			CAS NO. 9048-46-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium choride</td>
			<td>Ajax Finechem</td>
			<td>AJA960 
			CAS NO. 1707055184</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Charybdotoxin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C7802 
			CAS NO. 95751-30-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase type 1A</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C9891 
			CAS NO. 9001-12-1</td>
			<td>From Clostridium histolyticum</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D(+)-Glucose monohydrate</td>
			<td>Millipore Corporation</td>
			<td>K50876942 924 
			CAS NO. 14431-43-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D4540 
			CAS NO. 67-68-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylene glycol-bis (2-aminoethylether)-N,N,N&#8217;,N&#8217;-tetraacetic acid (EGTA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E3889 
			CAS NO. 67-42-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E9884 
			CAS NO. 60-00-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps 11 cm.</td>
			<td>Rustless Dumoxel</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps 14 cm.</td>
			<td>Rustless Dumoxel</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glibenclamide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G6039 
			CAS NO. 16673-34-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GraphPad Prism program</td>
			<td>Software version 5.0 (San Diego, CA, USA)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H3375 
			CAS NO. 7365-45-9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iberiotoxin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I5904 
			CAS NO. 1002546960</td>
			<td>recombinant from Mesobuthus tamulus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Indomethacin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I7378 
			CAS NO. 53-86-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Labchart Program</td>
			<td>Software version 7.0 (A.D. Instrument, Castle Hill, Australia).</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride</td>
			<td>Ajax Finechem</td>
			<td>296 
			CAS NO. 1506254995</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Male Wistar rats</td>
			<td>Nomura Siam International Co. Ltd., Bangkok, Thailand</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NG-nitro-L-arginine methyl ester (L-NAME)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>N5751 
			CAS NO. 51298-62-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nicardipine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>N7510 
			CAS NO. 54527-84-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Organ bath 15 mL.</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Specific order by the researchers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Papain</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4762 
			CAS NO. 9001-73-4</td>
			<td>FromPapaya Latex</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenal red</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5530 
			CAS NO. 34487-61-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenylephrine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P6126 
			CAS NO. 61-76-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>Kemaus</td>
			<td>KA383 
			CAS NO. 7447-40-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium dihydrogenphosphate</td>
			<td>Aldrich Chemical</td>
			<td>EC231-913-4 
			CAS NO. 7778-77-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>S+A2:E36odium chloride</td>
			<td>Kemaus</td>
			<td>KA465 
			CAS NO. 7647-14-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissors 11 cm.</td>
			<td>Spall Stainless</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissors 14 cm.</td>
			<td>Spall Stainless</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium bicarbonate</td>
			<td>Ajax Finechem</td>
			<td>475 
			CAS NO. 912466</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dihydrogenphosphate</td>
			<td>Aldrich Chemical</td>
			<td>33,198-8 
			CAS NO. 7558-80-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide</td>
			<td>Ajax Finechem</td>
			<td>482 
			CAS NO. 1506196602</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium thiopental</td>
			<td>Anesthal</td>
			<td>JPN3010002 
			CAS NO. 1C 314/47</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taurine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T0625 
			CAS NO. 107-35-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Waterbath WBU 45</td>
			<td>Memmert</td>
			<td>2766 
			CAS NO. -</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of intrapulmonary artery and smooth muscle cells to investigate vascular responses

Die intrapulmonale Arterie (IPA) und die vaskulären glatten Muskelzellen (VSMCs), die aus Rattenlungen isoliert wurden, können verwendet werden, um die zugrunde liegenden Mechanismen der Vasokonstriktion und Vasorelaxation zu untersuchen. Nach der Isolierung der IPA- und VSMCs können die Eigenschaften der vaskulären Reaktionen unter physiologischen und pathologischen Bedingungen in Abwesenheit extrinsischer Faktoren wie Nervensignale, Hormone, Zytokine usw. beurteilt werden. Daher dienen die IPA und VSMCs als hervorragende Modelle für die Untersuchung der vaskulären Physiologie / Pathophysiologie, zusammen mit verschiedenen experimentellen Untersuchungen, wie Modulation durch pharmakologische Wirkstoffe, Patch-Clamp-elektrophysiologische Analyse, Kalziumbildgebung usw. Hier haben wir eine Technik zur Isolierung des IPA verwendet, um vaskuläre Reaktionen in einem Organbadaufbau zu untersuchen. IPA-Segmente wurden über intraluminale Drähte auf die Organbadkammer montiert und durch verschiedene pharmakologische Wirkstoffe stimuliert. Die Veränderungen des IPA-Gefäßtonus (d.h. Vasokonstriktion und Vasorelaxation) wurden mit einem isometrischen Kraftaufnehmer und einer physiologischen Datenanalysesoftware aufgezeichnet. Wir implementierten mehrere experimentelle Protokolle, die angepasst werden können, um die Mechanismen der Vasorelaxation / Vasokonstriktion zur Untersuchung der pharmakologischen Aktivitäten von phytochemischen oder synthetischen Arzneimitteln zu untersuchen. Die Protokolle können auch verwendet werden, um die Rolle von Medikamenten bei der Modulation verschiedener Krankheiten, einschließlich pulmonaler arterieller Hypertonie, zu bewerten. Das IPA-Modell ermöglicht es uns, die Konzentrations-Wirkungs-Kurve zu untersuchen, die für die Bewertung der pharmakodynamischen Parameter von Arzneimitteln entscheidend ist.

Das Protokoll in der vorliegenden Studie wurde entwickelt, um die optimalen experimentellen Bedingungen für die Messung physiologischer Phänomene zu bestimmen, die in den vaskulären Reaktionen isolierter IPA-Präparate beobachtet werden. Die Pilotexperimente wurden durchgeführt, um die möglichen Ergebnisse, die zum Verständnis der vaskulären Effekte und der mechanistischen Grundlage der vasorelaxierenden Wirkung des Pflanzenextrakts beitragen, wie folgt zu beschreiben.
Vasorelax...

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Isolation of Intrapulmonary Artery and Smooth Muscle Cells to Investigate Vascular Responses

Vaskuläre Reaktionen des arteriellen Lungenkreislaufs können mit Hilfe von intrapulmonalen Arterien (IPA) und vaskulären glatten Muskelzellen (VSMCs) erforscht werden. Die vorliegende Studie beschreibt detailliert die Isolierung von IPA und die Protokolle, die zur Untersuchung der Vasorelaxation als Reaktion auf physiologische Reize verwendet werden.

Isolierung von intrapulmonalen Arterien- und glatten Muskelzellen zur Untersuchung von Gefäßreaktionen

The intrapulmonary artery (IPA) and vascular smooth muscle cells (VSMCs) isolated from rat lungs can be used to study the underlying mechanisms of ...

Diese Studie beschreibt die Isolierung der intrapulmonalen Arterie von Ratten und vaskulären glatten Muskelzellen. Mehrere experimentelle Protokolle wurden verwendet, wie z.B. die Verwendung der Organbadtechnik zur Untersuchung der vaskulären Reaktion der intrapulmonalen Arterie. Intrapulmonale Arterien und vaskuläre glatte Muskelzellen sind ausgezeichnete Modelle, um vaskuläre Physiologie und Pathophysiologie zu untersuchen.Anpassungen dieser Technik könnten die vaskulären Reaktionen von Medikamenten, Extrakten oder sekundären Pflanzenstoffen bewerten. Die Montage des isolierten intrapulmonalen arteriellen Rings in einem Organbad ermöglicht die Verwendung isolierter intrapulmonaler Arterien, um die Rolle eines Arzneimittels bei der Modulation verschiedener Krankheiten, einschließlich pulmonaler Hypertonie, zu bewerten. Die experimentellen Protokolle sind technisch machbar, aber die entscheidenden Schritte sind kompliziert und wesentlich für den Erfolg, so dass eine visuelle Demonstration es einfacher macht, sie zu verstehen und zu verfolgen.Kittiwoot To-on, ein Masterstudent in Physiologie vom Cardiovascular Research Unit Laboratory, Department of Physiology, Faculty of Medical Science, Naresuan University, wird das Verfahren demonstrieren. Beginnen Sie, indem Sie einen einzelnen Lungenlappen mit einer 11-Zentimeter-Schere schneiden und auf eine neun Zentimeter große Petrischale legen, wobei die mediale Seite oder Lungenwurzel nach oben zeigt. Beobachten und identifizieren Sie die Ausrichtung der Vene, Bronchien und Arterie von oben nach unten.Schneiden Sie den Bronchus längs mit einer Schere auf. Verwenden Sie dann die 11-Zentimeter-Pinzette, um die Spitze des Bronchus zu greifen. Sezieren und entfernen Sie vorsichtig die Bronchus und Venen aus der Lunge.Verwenden Sie die Pinzette, um die Spitze der intrapulmonalen Arterie zu greifen und sie vorsichtig mit einer Schere aus dem Lungengewebe zu sezieren. Halten Sie die isolierte intrapulmonale Arterie in kalter Krebslösung, bis die Organbadanordnung eingerichtet ist. Nach der Isolierung der intrapulmonalen Arterie den Hauptast der intrapulmonalen Arterie längs mit der 11-Zentimeter-Schere aufschneiden und in zwei Millimeter große Streifen schneiden.Tauchen Sie die intrapulmonalen Arterienstreifen in DM, dann inkubieren Sie die Streifen für eine Stunde bei vier Grad Celsius in TM, die ein Milligramm pro Milliliter Papain, 0,04% BSA und 0,4 Millimolar DTT enthalten. Dann bei 37 Grad Celsius für 15 Minuten inkubieren. Fügen Sie ein Milligramm pro Milliliter Kollagenase Typ IA in DM hinzu und inkubieren Sie erneut bei 37 Grad Celsius für fünf Minuten.Das Gewebe in frisches TM überführen und durch sanftes Reiben mit einer Pasteur-Glaspipette dispergieren. Verreiben Sie weiter, bis isolierte glatte Gefäßmuskelzellen in der Badelösung unter dem Mikroskop sichtbar werden. Isolieren Sie die intrapulmonale Arterie, wie zuvor gezeigt, und schneiden Sie den Hauptast der intrapulmonalen Arterie in Ringe von etwa zwei Millimetern Länge.Befestigen Sie die intrapulmonalen Arterienringe in Organbadkammern, indem Sie sie auf zwei Edelstahldrähte mit einem Durchmesser von 40 Mikrometern auffädeln. Befestigen Sie Edelstahldrähte, die mit intrapulmonalen Arterienringen befestigt sind, an den isometrischen Kraftaufnehmern, die mit dem Datenerfassungsgerät verbunden sind, und an dem Computersystem, das mit der geeigneten physiologischen Software zur Datenerfassung und -analyse installiert ist. Dann erhöhen Sie sanft die Spannung des intrapulmonalen Arterienrings auf ein Gramm.Lassen Sie die Gefäßsegmente bei einer Ruhespannung von einem Gramm etwa 45 Minuten im Gleichgewicht liegen. Stellen Sie während der Äquilibrierungsphase sicher, dass die Krebslösung regelmäßig alle 15 Minuten gewechselt wird. Testen Sie nach dem Gleichgewicht die Lebensfähigkeit der Gefäße, indem Sie ihre Vasokonstriktion zu einer hohen extrazellulären Kaliumlösung messen.Beurteilen Sie das Vorhandensein oder Fehlen von Endothel, indem Sie die Relaxationsreaktion auf Acetylcholin in Ringen berechnen, die mit PE vorkontrahiert sind. Entfernen Sie das Endothel mechanisch, indem Sie das Innere des Gefäßes vorsichtig mit einem kleinen Draht reiben, um eine Denudation zu induzieren. Dann gleichen Sie die arteriellen Ringe für 30 Minuten vor Beginn der Testexperimente aus. Untersuchen Sie die entspannende Wirkung des Pflanzenextrakts, indem Sie intrapulmonale Arterienringe mit PE vorkontrahieren. Dann fügen Sie vorsichtig 0,1 bis 1000 Mikrogramm pro Milliliter des Pflanzenextrakts kumulativ zu endothelintakten Ringen und endothelentblößten Ringen hinzu, um Vasorelaxation zu induzieren und eine konzentrationsabhängige Reaktionskurve zu erhalten.Stellen Sie sicher, dass das wirksame DMSO, das als Lösungsmittel verwendet wird, ebenfalls ähnlich bewertet wird, um als Negativkontrolle zu dienen. Bewerten Sie den vasorelaxierenden Wirkmechanismus des Pflanzenextrakts, wie im Textmanuskript erwähnt. Dann, nachdem sich die Kontraktionen zu PE stabilisieren, fügen Sie kumulative Konzentrationen des Pflanzenextrakts hinzu.Präsentieren Sie die Wirkungen von Pflanzenextrakt als prozentuale Entspannung der intrapulmonalen Arterienringe in Gegenwart von Inhibitoren im Vergleich zur Reaktion der intrapulmonalen Arterienringe ohne Inhibitoren und konstruieren Sie die Konzentrationsreaktionskurve. In einer intakten intrapulmonalen Arterie des Endothels löste der Pflanzenextrakt eine konzentrationsabhängige Reaktion der Vasorelaxation aus. Die Eradikation des Endothels reduzierte die durch den Pflanzenextrakt induzierte Vasorelaxation erheblich, was sich in der Erhöhung des EC50 um das 2,2-fache widerspiegelt, die Hemmung von eNOS und EDHF verringerte offensichtlich die vasorelaxierende Reaktion auf den Pflanzenextrakt.Dadurch verschob sich die Konzentrationsreaktionskurve nach rechts und erhöhte den EC50, ohne die Emax-Werte zu verändern. Im Gegenteil, Indomethacin zeigte keine Wirkung auf die vasorelaxierende Reaktion auf den Pflanzenextrakt. In den endothelentblößten intrapulmonalen Arterienringen verringerten Kalzium-aktivierte Kaliumkanalblocker die vasorelaxierende Reaktion auf den Pflanzenextrakt.Während Blocker von spannungsabhängigen oder ATP-empfindlichen Kaliumkanälen keine Abweichung zeigten. Die Vorinkubation mit dem Pflanzenextrakt hemmte die Calciumchlorid-induzierte Kontraktion. Die endothelentblößten intrapulmonalen Arterienringe, die mit kalziumfreier Krebslösung und PE vorinkubiert wurden, führten zu einer vorübergehenden Kontraktion.Im Vergleich zum Vehikel reduzierten die Pflanzenextrakte die durch PE induzierte Kontraktion signifikant. Während des Eingriffs muss man Vene, Bronchien und Arterie frühzeitig eindeutig identifizieren. Das Schneiden oder Beschädigen der Arterie reduziert ihre Länge und beeinflusst die vaskulären Reaktionen. Diese Technik kann angepasst werden, um Verbindungen zu untersuchen, die als Prototypen für die Behandlung von pulmonalen vaskulären Erkrankungen wie pulmonaler arterieller Hypertonie dienen könnten.

Research

JoVE Journal

Medicine

Mesenteric Artery Contraction and Relaxation Studies Using Automated Wire Myography

A. mesenterica Kontraktion und Entspannung Studies Verwendung automatisierter Draht Myographie

Proximal resistance vessels, such as the mesenteric arteries, contribute substantially to the peripheral resistance. These small vessels of between ...

Forschung

Medizin

Training a Sophisticated Microsurgical Technique: Interposition of External Jugular Vein Graft in the Common Carotid Artery in Rats

Trainieren eines Sophisticated mikrochirurgische Technik: Interposition der Vena jugularis externa Graft in der Arteria carotis communis bei Ratten

Neointimal hyperplasia is one the primary causes of stenosis in arterialized veins that are of great importance in arterial coronary bypass surgery, in ...

Assessment of Right Ventricular Structure and Function in Mouse Model of Pulmonary Artery Constriction by Transthoracic Echocardiography

Beurteilung der rechtsventrikulären Struktur und Funktion in Maus-Modell der Lungenarterie Verengung durch transthorakale Echokardiographie

Emerging clinical data support the notion that RV dysfunction is critical to the pathogenesis of cardiovascular disease and heart failure1-3. Moreover, ...

Bladder Smooth Muscle Strip Contractility as a Method to Evaluate Lower Urinary Tract Pharmacology

Glatten Muskulatur der Blase Streifen Kontraktilität als eine Methode zur unteren Harnwege Pharmakologie Bewerten

We describe an in vitro method to measure bladder smooth muscle contractility, and its use for investigating physiological and pharmacological properties ...

Embolic Middle Cerebral Artery Occlusion (MCAO) for Ischemic Stroke with Homologous Blood Clots in Rats

Embolic Middle Cerebral Artery Occlusion MCAO for Ischemic Stroke with Homologous Blood Clots in Rats

Embolischen mittleren Hirnarterie Okklusion (MCAO) für ischämischen Schlaganfall mit homologen Blutgerinnsel in Ratten

Clinically, thrombolytic therapy with use of recombinant tissue plasminogen activator (tPA) remains the most effective treatment for acute ischemic ...

Vascular Balloon Injury and Intraluminal Administration in Rat Carotid Artery

Gefäßballon Verletzung und intraluminale Verwaltung in Rattenhalsschlagader

The carotid artery balloon injury model in rats has been well established for over two decades. It remains an important method to study the molecular and ...

Permanent Ligation of the Left Anterior Descending Coronary Artery in Mice: A Model of Post-myocardial Infarction Remodelling and Heart Failure

Permanent Ligation des linken vorderen absteigenden Koronararterie bei Mäusen: Ein Modell der Post-Myokardinfarkt Umbau und Herzinsuffizienz

Heart failure is a syndrome in which the heart fails to pump blood at a rate commensurate with cellular oxygen requirements at rest or during stress. It ...

Ultrasound Based Assessment of Coronary Artery Flow and Coronary Flow Reserve Using the Pressure Overload Model in Mice

Ultraschall Basierend Beurteilung der koronaren Herzfluss und koronare Flussreserve Mit der Drucküberlastung Modell an der Maus

Transthoracic Doppler echocardiography (TTDE) is a clinically useful, noninvasive tool for studying coronary artery flow velocity and coronary flow ...

Ferric Chloride-induced Thrombosis Mouse Model on Carotid Artery and Mesentery Vessel

Eisenchlorid-induzierte Thrombose Mausmodell für Halsschlagader und Mesentery Vessel

Severe thrombosis and its ischemic consequences such as myocardial infarction, pulmonary embolism and stroke are major worldwide health issues. The ferric ...

Calcification of Vascular Smooth Muscle Cells and Imaging of Aortic Calcification and Inflammation

Die Verkalkung der glatten Gefäßmuskelzellen und Imaging von Aortic Kalzifizierung und Entzündung

Cardiovascular disease is the leading cause of morbidity and mortality in the world.  Atherosclerotic plaques, consisting of lipid-laden macrophages and ...