Name: isolation of intrapulmonary artery and smooth muscle cells to investigate vascular responses
Uploaded: 2022-06-08T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Intrapulmonary Artery and Smooth Muscle Cells to Investigate Vascular Responses at JoVE.com

המחברים מבקשים להודות למועצת המחקר הלאומית של תאילנד, למרכז המצוינות לחדשנות בכימיה (PERCH-CIC) ולרשת המחקר הבינלאומית (IRN61W0005) על מתן תמיכה כספית, ולמחלקה לפיזיולוגיה הפקולטה למדעי הרפואה, אוניברסיטת נארסואן, על תמיכה במתקני מחקר.

הניסויים שבוצעו במחקר זה אושרו על ידי ועדת האתיקה של ועדת הטיפול והשימוש בבעלי חיים של אוניברסיטת Naresuan (NUACUC), פרוטוקול מספר NU-AE620921, לטיפול ושימוש בבעלי חיים למטרות מדעיות.
1. הרכב של פתרונות פיזיולוגיים
<ol><li>צור תמיסת קרבס על ידי המסת כימיקלים במים מזוקקים כדי להשיג...

<ol>
	<li>Lyle, M. A., Davis, J. P., Brozovich, F. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+pulmonary+vascular+smooth+muscle+contractility+in+pulmonary+arterial+hypertension:+Implications+for+therapy.">Regulation of pulmonary vascular smooth muscle contractility in pulmonary arterial hypertension: Implications for therapy.</a> Frontiers in Physiology. 8, 614 (2017).</li><li>Cyr, A. R., Huckaby, L. V., Shiva, S. S., Zuckerbraun, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nitric+oxide+and+endothelial+dysfunction.">Nitric oxide and endothelial dysfunction.</a> Critical Care Clinics. 36 (2), 307-321 (2020).</li><li>Ruan, K. -. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advance+in+understanding+the+biosynthesis+of+prostacyclin+and+thromboxane+A2+in+the+endoplasmic+reticulum+membrane+via+the+cyclo-oxygenase+pathway.">Advance in understanding the biosynthesis of prostacyclin and thromboxane A2 in the endoplasmic reticulum membrane via the cyclo-oxygenase pathway.</a> Mini Reviews in Medicinal Chemistry. 4 (6), 639-647 (2004).</li><li>Del Pozo, R., Hernandez Gonzalez, I., Escribano-Subias, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+prostacyclin+pathway+in+pulmonary+arterial+hypertension:+A+clinical+review.">The prostacyclin pathway in pulmonary arterial hypertension: A clinical review.</a> Expert Review of Respiratory Medicine. 11 (6), 491-503 (2017).</li><li>Morgado, M., Cairr&#227;o, E., Santos-Silva, A. J., Verde, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cyclic+nucleotide-dependent+relaxation+pathways+in+vascular+smooth+muscle.">Cyclic nucleotide-dependent relaxation pathways in vascular smooth muscle.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 69 (2), 247-266 (2012).</li><li>Schmidt, K., de Wit, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelium-derived+hyperpolarizing+factor+and+myoendothelial+coupling:+The+in+vivo+perspective.">Endothelium-derived hyperpolarizing factor and myoendothelial coupling: The in vivo perspective.</a> Frontiers in Physiology. 11, (2020).</li><li>Fan, G., Cui, Y., Gollasch, M., Kassmann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elementary+calcium+signaling+in+arterial+smooth+muscle.">Elementary calcium signaling in arterial smooth muscle.</a> Channels. 13 (1), 505-519 (2019).</li><li>Wisutthathum, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extract+of+Aquilaria+crassna+leaves+and+mangiferin+are+vasodilators+while+showing+no+cytotoxicity.">Extract of Aquilaria crassna leaves and mangiferin are vasodilators while showing no cytotoxicity.</a> Journal of Traditional and Complementary Medicine. 9 (4), 237-242 (2019).</li><li>Kamkaew, N., Paracha, T. U., Ingkaninan, K., Waranuch, N., Chootip, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vasodilatory+effects+and+mechanisms+of+action+of+Bacopa+monnieri+active+compounds+on+rat+mesenteric+arteries.">Vasodilatory effects and mechanisms of action of Bacopa monnieri active compounds on rat mesenteric arteries.</a> Molecules. 24 (12), 2243 (2019).</li><li>Chootip, K., Kennedy, C., Gurney, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+P2+receptors+mediating+contraction+of+the+rat+isolated+pulmonary+vasculature.">Characterization of P2 receptors mediating contraction of the rat isolated pulmonary vasculature.</a> British Journal of Pharmacology. 131, 167 (2000).</li><li>Paracha, T. U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elucidation+of+vasodilation+response+and+structure+activity+relationships+of+N2,+N4-disubstituted+quinazoline+2,+4-diamines+in+a+rat+pulmonary+artery+model.">Elucidation of vasodilation response and structure activity relationships of N2, N4-disubstituted quinazoline 2, 4-diamines in a rat pulmonary artery model.</a> Molecules. 24 (2), 281 (2019).</li><li>Chootip, K., Gurney, A. M., Kennedy, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+P2Y+receptors+couple+to+calcium-dependent,+chloride+channels+in+smooth+muscle+cells+of+the+rat+pulmonary+artery.">Multiple P2Y receptors couple to calcium-dependent, chloride channels in smooth muscle cells of the rat pulmonary artery.</a> Respiratory Research. 6 (1), 1-10 (2005).</li><li>Wisutthathum, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Eulophia+macrobulbon+extract+relaxes+rat+isolated+pulmonary+artery+and+protects+against+monocrotaline-induced+pulmonary+arterial+hypertension.">Eulophia macrobulbon extract relaxes rat isolated pulmonary artery and protects against monocrotaline-induced pulmonary arterial hypertension.</a> Phytomedicine. 50, 157-165 (2018).</li><li>Kruangtip, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Curcumin+analogues+inhibit+phosphodiesterase-5+and+dilate+rat+pulmonary+arteries.">Curcumin analogues inhibit phosphodiesterase-5 and dilate rat pulmonary arteries.</a> Journal of Pharmacy and Pharmacology. 67 (1), 87-95 (2015).</li></ol>

בכתב יד זה אנו מתארים את הטכניקה לבידוד של חולדות IPA ו- VSMCs. מספר פרוטוקולים ניסיוניים שימשו כדי לחקור את התגובה הווסקולרית של IPA במבחנה, אשר ניתן להשתמש בהם כדי לאפיין את האפקט הפרמקולוגי ואת הבסיס המכניסטי של IPA vasorelaxation המושרה על ידי תמצית צמחים.
בנוגע לפעולת מרחיב כלי ה...

כלי הדם הריאתיים הם מערכת כלי דם בלחץ נמוך שבה הפונקציה העיקרית היא לספק דם deoxygenated לאזור החלפת גז של הריאות. העורקים הריאתיים בריאות מסודרים בענפים מקבילים לעץ הסימפונות, ובסופו של דבר יוצרים רשת נרחבת של נימים שהיא רציפה על פני כמה נאדיות, ולבסוף, מתאחדת לתוך ורידים וורידים. הטון הווסקולרי של עורק הריאה נשלט על ידי מספר גורמים, המערבים את האינטראקציה בין האנדותל לבין תאי השריר החלק של כלי הדם (VSMCs)1.
במחקר זה אנו מתמקדים בכלי הדם התלויים-תלותיים והעצמאיים של העורק התוך-פולמונרי (IPA). בנוגע לווסורגנציה התלויה באנדותל, מנגנונים שונים המתרחשים על פני השטח של תאי האנדותל עשויים להגביר את ריכוז Ca2+ התוך-תאי (לדוגמה, קשירת אצטילכולין [ACh] עם קולטן מוסקריני [M3]), מה שמוביל להיווצרות תחמוצת החנקן (NO), פרוסטציקלין (PGl 2) וגורם היפרפולריזציה שמקורו באנדותל (EDHF) (איור 1 ). NO הוא הגורם המרגיע העיקרי שמקורו באנדותל, המסונתז מ-L-ארגינין על-ידי סינתאז תחמוצת החנקן של האנדותל (eNOS)2, אשר לאחר מכן מתנתק מתאי האנדותל ל-VSMCs (איור 1) וממריץ את האנזים המסיס גואניליל ציקלאז (sGC); האנזים הזה משנה את הגואנוזין טריפוספט (GTP) לגואנוזין מונופוספט מחזורי (cGMP), שמפעיל את החלבון קינאז G (PKG) ומפחית את רמות Ca2+ הציטוזוליקיות, ובכך גורם לדלקת כלי הדם (איור 1). PGl 2 מסונתז על ידי תאי אנדותל דרך מסלול ציקלו-אוקסיגנאז (COX) 3,4. הוא נקשר לקולטן הפרוסטציקלין (IP) ב-VSMCs וממריץ את האנזים אדניליל ציקלאז (AC), אשר לאחר מכן ממיר אדנוזין טריפוספט (ATP) לאדנוזין מונופוספט מחזורי (cAMP) (איור 1)3,4. cAMP מפעיל את החלבון קינאז A (PKA), מפחית את רמות Ca2+ הציטוזולי וגורם לווזורגנציה5 (איור 1). מסלול ה-EDHF משתתף גם בוויסורגנציה תלוית אנדותל באמצעות מתווכי אנדותל שונים ואירועים חשמליים. ההפעלה של מסלול EDHF מובילה להיפרפולריזציה של VSMCs, ובכך סוגרת ערוצי Ca2+ (VOCCs) המופעלים באמצעות מתח, מפחיתה את רמותCa 2+ התוך-תאיות, וגורמת לוויסורגנציה6. הוויסורגנציה הבלתי תלויה באנדותל מתרחשת ישירות על VSMCs באמצעות מספר מנגנונים, כגון הפחתת רמתCa 2+ תוך-תאית, עיכוב של קינאז שרשרת אור מיוזין (MLCK), הפעלת פוספטאז שרשרת אור מיוזין (MLCP), והפחתת רגישות Ca2+ למנגנון ההתכווצות של VSMCs. במחקר זה, אנו מתמקדים בווזורגנציה הנגרמת על ידי פתיחת ערוצי K+ שונים, חסימת תרכובות אורגניות נדיפות ועיכוב שחרור Ca 2+ מהרשתית הסרקופלסמית7, מה שמוביל לירידה ברמות Ca 2+ תוך-תאיות, ובכך מפחית את זרחון שרשרת האור VSMC מיוזין וקשירת מיוזין-אקטין או היווצרות גשר צולב, בהתאמה, ובסופו של דבר התוצאה היא vasorelaxation.
הטכניקה להערכת מדידות vasoconstriction ו vasorelaxation ב IPA מבודד מבוססת היטב עבור מכרסמים, אבל הנתונים השתנו בהתאם לפרוטוקולים הניסוי. המחקר הנוכחי מתאר את השיטה המשמשת להערכת תגובתיות כלי הדם של תכשירי IPA של חולדות במבחנה, שנעשו בהיעדר גורמים חיצוניים המווסתים את תגובת כלי הדם in vivo, כגון אותות עצביים, הורמונים, ציטוקינים, לחץ דם וכו '.
השתמשנו במספר פרוטוקולים ניסיוניים תוך שימוש בתמצית הצמח כדוגמה לחקר תגובתיות כלי הדם של IPA. חוסמים שונים (איור 1) שימשו כדי לזהות את המנגנונים של כלי דם תלויי אנדותל ובלתי תלויים המושרים על-ידי תמצית הצמח. עם זאת, ניתן להתאים את אותם פרוטוקולים כדי להעריך את תגובות כלי הדם של IPA לכל תרופות, תמציות או פיטוכימיקלים המשמשים לטיפול בפאתולוגיות ריאתיות שונות.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1,4-dithiothreitol (DTT)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D0632 
			CAS NO. 348-12-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-aminopyridine (4-AP)</td>
			<td>Aldrich Chemical</td>
			<td>A78403 
			CAS NO. 504-24-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetylcholine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A6625 
			CAS NO. 60-31-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Apamin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9459 
			CAS NO. 24345-16-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A2153 
			CAS NO. 9048-46-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium choride</td>
			<td>Ajax Finechem</td>
			<td>AJA960 
			CAS NO. 1707055184</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Charybdotoxin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C7802 
			CAS NO. 95751-30-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase type 1A</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C9891 
			CAS NO. 9001-12-1</td>
			<td>From Clostridium histolyticum</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D(+)-Glucose monohydrate</td>
			<td>Millipore Corporation</td>
			<td>K50876942 924 
			CAS NO. 14431-43-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D4540 
			CAS NO. 67-68-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylene glycol-bis (2-aminoethylether)-N,N,N&#8217;,N&#8217;-tetraacetic acid (EGTA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E3889 
			CAS NO. 67-42-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E9884 
			CAS NO. 60-00-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps 11 cm.</td>
			<td>Rustless Dumoxel</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps 14 cm.</td>
			<td>Rustless Dumoxel</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glibenclamide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G6039 
			CAS NO. 16673-34-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GraphPad Prism program</td>
			<td>Software version 5.0 (San Diego, CA, USA)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H3375 
			CAS NO. 7365-45-9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iberiotoxin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I5904 
			CAS NO. 1002546960</td>
			<td>recombinant from Mesobuthus tamulus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Indomethacin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I7378 
			CAS NO. 53-86-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Labchart Program</td>
			<td>Software version 7.0 (A.D. Instrument, Castle Hill, Australia).</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride</td>
			<td>Ajax Finechem</td>
			<td>296 
			CAS NO. 1506254995</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Male Wistar rats</td>
			<td>Nomura Siam International Co. Ltd., Bangkok, Thailand</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NG-nitro-L-arginine methyl ester (L-NAME)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>N5751 
			CAS NO. 51298-62-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nicardipine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>N7510 
			CAS NO. 54527-84-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Organ bath 15 mL.</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Specific order by the researchers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Papain</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4762 
			CAS NO. 9001-73-4</td>
			<td>FromPapaya Latex</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenal red</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5530 
			CAS NO. 34487-61-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenylephrine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P6126 
			CAS NO. 61-76-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>Kemaus</td>
			<td>KA383 
			CAS NO. 7447-40-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium dihydrogenphosphate</td>
			<td>Aldrich Chemical</td>
			<td>EC231-913-4 
			CAS NO. 7778-77-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>S+A2:E36odium chloride</td>
			<td>Kemaus</td>
			<td>KA465 
			CAS NO. 7647-14-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissors 11 cm.</td>
			<td>Spall Stainless</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissors 14 cm.</td>
			<td>Spall Stainless</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium bicarbonate</td>
			<td>Ajax Finechem</td>
			<td>475 
			CAS NO. 912466</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dihydrogenphosphate</td>
			<td>Aldrich Chemical</td>
			<td>33,198-8 
			CAS NO. 7558-80-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide</td>
			<td>Ajax Finechem</td>
			<td>482 
			CAS NO. 1506196602</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium thiopental</td>
			<td>Anesthal</td>
			<td>JPN3010002 
			CAS NO. 1C 314/47</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taurine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T0625 
			CAS NO. 107-35-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Waterbath WBU 45</td>
			<td>Memmert</td>
			<td>2766 
			CAS NO. -</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of intrapulmonary artery and smooth muscle cells to investigate vascular responses

ניתן להשתמש בעורק התוך-ריאתי (IPA) ובתאי השריר החלק של כלי הדם (VSMCs) שבודדו מריאות חולדות כדי לחקור את המנגנונים הבסיסיים של התפשטות כלי דם ו-vasorelax. לאחר בידוד ה- IPA וה- VSMCs, ניתן להעריך את המאפיינים של תגובות כלי הדם בתנאים פיזיולוגיים ופתולוגיים בהעדר גורמים חיצוניים כגון אותות עצביים, הורמונים, ציטוקינים וכו '. לפיכך, ה- IPA וה- VSMCs משמשים מודלים מצוינים לחקר פיזיולוגיה / פתופיזיולוגיה של כלי הדם, יחד עם חקירות ניסיוניות שונות, כגון אפנון על ידי סוכנים פרמקולוגיים, ניתוח אלקטרופיזיולוגי של מהדק טלאי, הדמיית סידן וכו '. כאן, השתמשנו בטכניקה לבידוד ה-IPA כדי לחקור תגובות וסקולריות במערך אמבט איברים. מקטעי IPA הורכבו על תא אמבט האיברים באמצעות חוטים אינטראלומינליים ועוררו על ידי סוכנים פרמקולוגיים שונים. השינויים בטונוס כלי הדם של IPA (כלומר, vasoconstriction ו-vasorelax), תועדו באמצעות מתמר כוח איזומטרי ותוכנה לניתוח נתונים פיזיולוגיים. יישמנו מספר פרוטוקולים ניסיוניים, שניתן להתאים אותם כדי לחקור את המנגנונים של vasorelax/vasoconstriction לחקר הפעילות הפרמקולוגית של תרופות פיטוכימיות או סינתטיות. הפרוטוקולים יכולים לשמש גם להערכת תפקידן של תרופות בוויסות מחלות שונות, כולל יתר לחץ דם ריאתי עורקי. מודל IPA מאפשר לנו לחקור את עקומת תגובת הריכוז, שהיא חיונית בהערכת הפרמטרים הפרמקודינמיים של תרופות.

הפרוטוקול במחקר הנוכחי פותח כדי לקבוע את תנאי הניסוי האופטימליים למדידת תופעות פיזיולוגיות שנצפו בתגובות כלי הדם של תכשירי IPA מבודדים. ניסויי הפיילוט בוצעו כדי לתאר את התוצאות הפוטנציאליות המסייעות להבנת ההשפעות הווסקולריות והבסיס המכניסטי של פעולת הווזו-רלאקסנט של תמצית הצמח, כדלקמן.</...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Intrapulmonary Artery and Smooth Muscle Cells to Investigate Vascular Responses at JoVE.com

Isolation of Intrapulmonary Artery and Smooth Muscle Cells to Investigate Vascular Responses

ניתן לחקור תגובות וסקולריות של זרימת הדם הריאתית העורקית באמצעות עורק תוך פולמונרי (IPA) ותאי שריר חלק וסקולריים (VSMCs). המחקר הנוכחי מתאר בפירוט את הבידוד של IPA ואת הפרוטוקולים המשמשים לחקר vasorelaxation בתגובה לגירויים פיזיולוגיים.

בידוד של עורקים תוך-ריאתיים ותאי שריר חלק כדי לחקור תגובות כלי דם

The intrapulmonary artery (IPA) and vascular smooth muscle cells (VSMCs) isolated from rat lungs can be used to study the underlying mechanisms of ...

מחקר זה מתאר בידוד של עורק תוך-פולמונרי של חולדות ותאי שריר חלק של כלי הדם. נעשה שימוש במספר פרוטוקולים ניסיוניים, כגון שימוש בטכניקת אמבט האיברים כדי לחקור את תגובת כלי הדם של העורק התוך-פולמונרי. עורקים תוך-ריאתיים ותאי שריר חלק של כלי הדם הם מודלים מצוינים לחקר פיזיולוגיה של כלי הדם ופתופיזיולוגיה.התאמות של טכניקה זו יכולות להעריך את תגובות כלי הדם של כל תרופות, תמציות או פיטוכימיקלים. הרכבת טבעת העורקים התוך-פולמונרית המבודדת באמבט איברים מאפשרת שימוש בעורקים תוך-ריאתיים מבודדים כדי להעריך את תפקידה של התרופה בוויסות מחלות שונות, כולל יתר לחץ דם ריאתי. פרוטוקולי הניסוי הם אפשריים מבחינה טכנית, אך הצעדים המכריעים הם מסובכים וחיוניים להצלחה, ולכן הדגמה חזותית מקלה על ההבנה והמעקב.מי שתדגים את ההליך תהיה קיטיווט טו-און, סטודנטית לתואר שני בפיזיולוגיה מהמעבדה לחקר הלב וכלי הדם, המחלקה לפיזיולוגיה, הפקולטה למדעי הרפואה, אוניברסיטת נארסואן. התחל על ידי חיתוך אונה אחת של הריאה עם מספריים 11 ס"מ והצבתה על צלחת פטרי של תשעה ס"מ עם הצד המדיאלי, או שורש הריאה, פונה כלפי מעלה. שימו לב וזהו את היישור של הווריד, הסימפונות והעורק מלמעלה למטה.חותכים לפתוח את הברונכוס לאורך עם מספריים. לאחר מכן השתמש במלקחיים בגודל 11 ס"מ כדי לתפוס את קצה הברונכוס. נתחו בעדינות והוציאו את הברונכוס והוורידים מהריאה.השתמש מלקחיים כדי לתפוס את קצה העורק intrapulmonary בזהירות לנתח אותו מתוך רקמת הריאה עם מספריים. שמור את העורק התוך-פולמונרי המבודד בתמיסת קרבס קרה עד להתקנת מכלול אמבט האיברים. לאחר בידוד העורק התוך-פולמונרי, חותכים לפתוח את הענף הראשי של העורק התוך-פולמונרי לאורך עם מספריים של 11 ס"מ וחותכים לרצועות של שני מילימטרים.לטבול את רצועות העורקים intrapulmonary ב DM, ולאחר מכן לדגור את הרצועות במשך שעה אחת בארבע מעלות צלזיוס ב DM המכיל מיליגרם אחד לכל מיליליטר papain, 0.04% BSA ו 0.4 מילימולר DTT. ואז לדגור ב 37 מעלות צלזיוס במשך 15 דקות. מוסיפים מיליגרם אחד למיליליטר של קולגן מסוג IA ב-DM, ושוב דוגרים ב-37 מעלות צלזיוס למשך חמש דקות.העבירו את הרקמות ל-DM טרי והתפזרו על ידי טריטורציה עדינה באמצעות פיפטה פסטר מזכוכית. המשיכו לטרטור עד שתאי שריר חלק של כלי דם מבודדים נראים בתמיסת הרחצה שמתחת למיקרוסקופ. לבודד עורק תוך-פולמונרי כפי שהוכח קודם לכן ולחתוך את הענף הראשי של העורק התוך-פולמונרי לטבעות באורך של כשני מילימטרים.הדבק את טבעות העורקים התוך-פולמונריות בתאי אמבט איברים על ידי השחלתם על שני חוטי נירוסטה בקוטר 40 מיקרומטר. חבר חוטי נירוסטה המותקנים עם טבעות עורקים אינטרפולמונריות למתמרים הכוח האיזומטריים המחוברים למכשיר איסוף הנתונים ולמערכת המחשב המותקנת עם התוכנה הפיזיולוגית המתאימה לרישום וניתוח נתונים. לאחר מכן להעלות בעדינות את המתח של טבעת העורק intrapulmonary לגרם אחד.אפשרו למקטעי כלי השיט להתאזן במשך כ-45 דקות במתח מנוחה של גרם אחד. במהלך תקופת שיווי המשקל, ודא כי פתרון קרבס משתנה באופן קבוע כל 15 דקות. לאחר שיווי משקל, בדוק את הכדאיות של כלי הדם על ידי מדידת vasoconstriction שלהם לתמיסת אשלגן חוץ-תאית גבוהה.להעריך את נוכחות או היעדרות של אנדותל על ידי חישוב תגובת הרפיה אצטילכולין בטבעות מראש עם PE. באופן מכני להסיר את האנדותל על ידי שפשוף בעדינות את החלק הפנימי של כלי עם חוט קטן כדי לגרום denudation. לאחר מכן משווים את טבעות העורקים למשך 30 דקות לפני תחילת ניסויי הבדיקה. לחקור את ההשפעה המרגיעה של תמצית הצמח על ידי התקשרות מוקדמת של טבעות עורקים תוך-ריאתיים עם PE. לאחר מכן הוסיפו בזהירות 0.1 עד 1000 מיקרוגרם למיליליטר של תמצית הצמח במצטבר לטבעות אנדותל שלמות וטבעות עם אנדותל כדי לגרום לדלקת כלי הדם ולרכוש עקומת תגובה תלוית ריכוז.ודא כי ה- DMSO היעיל המשמש כממס מוערך גם הוא באופן דומה כדי לשמש כבקרה שלילית. להעריך את מנגנון הפעולה של vasorelaxant של תמצית הצמח כפי שצוין בכתב היד של הטקסט. לאחר מכן לאחר ההתכווצויות לייצוב PE, מוסיפים ריכוזים מצטברים של תמצית הצמח.הציגו את ההשפעות של תמצית צמחים כאחוז הרפיה של טבעות העורקים התוך-ריאתיים בנוכחות מעכבים בהשוואה לתגובת טבעות העורקים התוך-ריאתיים ללא מעכבים ובנו את עקומת תגובת הריכוז. בעורק התוך-פולמונרי השלם של אנדותל, תמצית הצמח עוררה תגובה תלוית ריכוז של כלי דם. מיגור האנדותל הפחית באופן עמוק את הווזורפנס המושרה על ידי תמצית הצמח כפי שמשתקף על ידי העלייה ב- EC50 פי 2.2, עיכוב של eNOS ו- EDHF ככל הנראה הפחית את התגובה הווזורלאקנטית לתמצית הצמח.פעולה זו הסיטה את עקומת תגובת הריכוז ימינה והגדילה את ה- EC50 מבלי לשנות את ערכי ה- E max. להיפך, אינדומטצין לא הראה השפעה על התגובה הווזורלאקנטית לתמצית הצמח. בטבעות העורקים התוך-פולמונריים הנגועים באנדותל, חוסמי תעלות אשלגן המופעלים על-ידי סידן הפחיתו את התגובה הווזו-ריאקסנטית לתמצית הצמח.בעוד שחוסמי תעלות אשלגן מגודרות מתח או רגישות ל-ATP לא הראו סטייה. ההתכווצות המוקדמת עם תמצית הצמח עיכבה את ההתכווצות הנגרמת על ידי סידן-כלוריד. טבעות העורקים התוך-פולמונריים עם האנדותל שעברו דגירה מוקדמת עם תמיסת קרבס נטולת סידן ו-PE יצרו התכווצות חולפת.בהשוואה לרכב, תמציות הצמח הפחיתו באופן משמעותי את ההתכווצות הנגרמת על ידי PE. במהלך ההליך, יש לזהות בבירור וריד, ברונכיה ועורק בשלב מוקדם. חיתוך או פגיעה בעורק יקטין את אורכו וישפיע על תגובות כלי הדם. טכניקה זו יכולה להיות מותאמת כדי לחקור תרכובות שעשויות לשמש אבות טיפוס לטיפול במחלות כלי דם ריאתיים כגון יתר לחץ דם ריאתי עורקי.

Research

JoVE Journal

Medicine

Mesenteric Artery Contraction and Relaxation Studies Using Automated Wire Myography

התכווצות העורקים mesenteric ללימודי הרפיה באמצעות Myography בנקאית אוטומטית

Proximal resistance vessels, such as the mesenteric arteries, contribute substantially to the peripheral resistance. These small vessels of between ...

Training a Sophisticated Microsurgical Technique: Interposition of External Jugular Vein Graft in the Common Carotid Artery in Rats

אימון טכניקה מתוחכמת מייקרו: התערבותם של שתלי וריד צוואר חיצוניים בעורק התרדמה המשותף בחולדות

Neointimal hyperplasia is one the primary causes of stenosis in arterialized veins that are of great importance in arterial coronary bypass surgery, in ...

Assessment of Right Ventricular Structure and Function in Mouse Model of Pulmonary Artery Constriction by Transthoracic Echocardiography

הערכה של מבנה הנכון חדרית ותפקוד בעכבר הדגם של תעוקת עורק ריאה על ידי Transthoracic אקו

Emerging clinical data support the notion that RV dysfunction is critical to the pathogenesis of cardiovascular disease and heart failure1-3. Moreover, ...

Bladder Smooth Muscle Strip Contractility as a Method to Evaluate Lower Urinary Tract Pharmacology

שריר חלק בשלפוחית ​​השתן רצועת התכווצות כשיטה להערכת נמוכה יותר בדרכי שתן פרמקולוגיה

We describe an in vitro method to measure bladder smooth muscle contractility, and its use for investigating physiological and pharmacological properties ...

Embolic Middle Cerebral Artery Occlusion (MCAO) for Ischemic Stroke with Homologous Blood Clots in Rats

Embolic Middle Cerebral Artery Occlusion MCAO for Ischemic Stroke with Homologous Blood Clots in Rats

עורקי תסחיפים התיכון מוחין ספיגה (MCAO) לשבץ איסכמי עם קרישי דם הומולוגיים בחולדות

Clinically, thrombolytic therapy with use of recombinant tissue plasminogen activator (tPA) remains the most effective treatment for acute ischemic ...

Vascular Balloon Injury and Intraluminal Administration in Rat Carotid Artery

כלי דם בלון פגיעה וIntraluminal מנהל בעורקי תרדמת העכברוש

The carotid artery balloon injury model in rats has been well established for over two decades. It remains an important method to study the molecular and ...

Permanent Ligation of the Left Anterior Descending Coronary Artery in Mice: A Model of Post-myocardial Infarction Remodelling and Heart Failure

קשירת קבע של העורק השמאלי קדמי יורד כלילית בעכברים: דגם של Remodelling אוטם שריר לב ופוסט-אי ספיקת לב

Heart failure is a syndrome in which the heart fails to pump blood at a rate commensurate with cellular oxygen requirements at rest or during stress. It ...

Ultrasound Based Assessment of Coronary Artery Flow and Coronary Flow Reserve Using the Pressure Overload Model in Mice

הערכת אולטראסאונד מבוססת של עורקים הכליליים זרימה והזרימה כלילית ריזרב שימוש בדגם עומס יתר הלחץ בעכברים

Transthoracic Doppler echocardiography (TTDE) is a clinically useful, noninvasive tool for studying coronary artery flow velocity and coronary flow ...

Ferric Chloride-induced Thrombosis Mouse Model on Carotid Artery and Mesentery Vessel

פקקת עכבר דגם על עורק ראשי וכלי לפדר מושרה כלוריד Ferric

Severe thrombosis and its ischemic consequences such as myocardial infarction, pulmonary embolism and stroke are major worldwide health issues. The ferric ...

Calcification of Vascular Smooth Muscle Cells and Imaging of Aortic Calcification and Inflammation

הסתיידות של לתאי השריר החלק בכלי הדם והדמיה של אבי העורקים הסתיידות ודלקת

Cardiovascular disease is the leading cause of morbidity and mortality in the world.  Atherosclerotic plaques, consisting of lipid-laden macrophages and ...