Name: isolation of intrapulmonary artery and smooth muscle cells to investigate vascular responses
Uploaded: 2022-06-08T13:30:00
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Gli autori desiderano ringraziare il Consiglio Nazionale delle Ricerche della Thailandia, il Centro di eccellenza per l'innovazione in chimica (PERCH-CIC) e la Rete internazionale di ricerca (IRN61W0005) per aver fornito supporto finanziario e il Dipartimento di Fisiologia della Facoltà di Scienze Mediche, Naresuan University, per il supporto delle strutture di ricerca.

Gli esperimenti eseguiti in questo studio sono stati approvati dal Comitato Etico del Comitato per la cura e l'uso degli animali dell'Università di Naresuan (NUACUC), numero di protocollo NU-AE620921, per la cura e l'uso di animali per scopi scientifici.
1. Composizione delle soluzioni fisiologiche
<ol><li>Formulare la soluzione di Krebs sciogliendo le sostanze chimiche in acqua distillata per ottenere le concentrazioni finali come segue: 122 mM NaCl, 10 mM HEPES, 5 mM KCl,...

<ol>
	<li>Lyle, M. A., Davis, J. P., Brozovich, F. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+pulmonary+vascular+smooth+muscle+contractility+in+pulmonary+arterial+hypertension:+Implications+for+therapy.">Regulation of pulmonary vascular smooth muscle contractility in pulmonary arterial hypertension: Implications for therapy.</a> Frontiers in Physiology. 8, 614 (2017).</li><li>Cyr, A. R., Huckaby, L. V., Shiva, S. S., Zuckerbraun, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nitric+oxide+and+endothelial+dysfunction.">Nitric oxide and endothelial dysfunction.</a> Critical Care Clinics. 36 (2), 307-321 (2020).</li><li>Ruan, K. -. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advance+in+understanding+the+biosynthesis+of+prostacyclin+and+thromboxane+A2+in+the+endoplasmic+reticulum+membrane+via+the+cyclo-oxygenase+pathway.">Advance in understanding the biosynthesis of prostacyclin and thromboxane A2 in the endoplasmic reticulum membrane via the cyclo-oxygenase pathway.</a> Mini Reviews in Medicinal Chemistry. 4 (6), 639-647 (2004).</li><li>Del Pozo, R., Hernandez Gonzalez, I., Escribano-Subias, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+prostacyclin+pathway+in+pulmonary+arterial+hypertension:+A+clinical+review.">The prostacyclin pathway in pulmonary arterial hypertension: A clinical review.</a> Expert Review of Respiratory Medicine. 11 (6), 491-503 (2017).</li><li>Morgado, M., Cairr&#227;o, E., Santos-Silva, A. J., Verde, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cyclic+nucleotide-dependent+relaxation+pathways+in+vascular+smooth+muscle.">Cyclic nucleotide-dependent relaxation pathways in vascular smooth muscle.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 69 (2), 247-266 (2012).</li><li>Schmidt, K., de Wit, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelium-derived+hyperpolarizing+factor+and+myoendothelial+coupling:+The+in+vivo+perspective.">Endothelium-derived hyperpolarizing factor and myoendothelial coupling: The in vivo perspective.</a> Frontiers in Physiology. 11, (2020).</li><li>Fan, G., Cui, Y., Gollasch, M., Kassmann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elementary+calcium+signaling+in+arterial+smooth+muscle.">Elementary calcium signaling in arterial smooth muscle.</a> Channels. 13 (1), 505-519 (2019).</li><li>Wisutthathum, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extract+of+Aquilaria+crassna+leaves+and+mangiferin+are+vasodilators+while+showing+no+cytotoxicity.">Extract of Aquilaria crassna leaves and mangiferin are vasodilators while showing no cytotoxicity.</a> Journal of Traditional and Complementary Medicine. 9 (4), 237-242 (2019).</li><li>Kamkaew, N., Paracha, T. U., Ingkaninan, K., Waranuch, N., Chootip, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vasodilatory+effects+and+mechanisms+of+action+of+Bacopa+monnieri+active+compounds+on+rat+mesenteric+arteries.">Vasodilatory effects and mechanisms of action of Bacopa monnieri active compounds on rat mesenteric arteries.</a> Molecules. 24 (12), 2243 (2019).</li><li>Chootip, K., Kennedy, C., Gurney, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+P2+receptors+mediating+contraction+of+the+rat+isolated+pulmonary+vasculature.">Characterization of P2 receptors mediating contraction of the rat isolated pulmonary vasculature.</a> British Journal of Pharmacology. 131, 167 (2000).</li><li>Paracha, T. U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elucidation+of+vasodilation+response+and+structure+activity+relationships+of+N2,+N4-disubstituted+quinazoline+2,+4-diamines+in+a+rat+pulmonary+artery+model.">Elucidation of vasodilation response and structure activity relationships of N2, N4-disubstituted quinazoline 2, 4-diamines in a rat pulmonary artery model.</a> Molecules. 24 (2), 281 (2019).</li><li>Chootip, K., Gurney, A. M., Kennedy, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+P2Y+receptors+couple+to+calcium-dependent,+chloride+channels+in+smooth+muscle+cells+of+the+rat+pulmonary+artery.">Multiple P2Y receptors couple to calcium-dependent, chloride channels in smooth muscle cells of the rat pulmonary artery.</a> Respiratory Research. 6 (1), 1-10 (2005).</li><li>Wisutthathum, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Eulophia+macrobulbon+extract+relaxes+rat+isolated+pulmonary+artery+and+protects+against+monocrotaline-induced+pulmonary+arterial+hypertension.">Eulophia macrobulbon extract relaxes rat isolated pulmonary artery and protects against monocrotaline-induced pulmonary arterial hypertension.</a> Phytomedicine. 50, 157-165 (2018).</li><li>Kruangtip, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Curcumin+analogues+inhibit+phosphodiesterase-5+and+dilate+rat+pulmonary+arteries.">Curcumin analogues inhibit phosphodiesterase-5 and dilate rat pulmonary arteries.</a> Journal of Pharmacy and Pharmacology. 67 (1), 87-95 (2015).</li></ol>

In questo manoscritto, descriviamo la tecnica per l'isolamento di IPA e VSMC di ratto. Diversi protocolli sperimentali sono stati impiegati per studiare la risposta vascolare dell'IPA in vitro, che possono essere utilizzati per caratterizzare l'effetto farmacologico e le basi meccanicistiche della vasorilassazione dell'IPA indotta dall'estratto vegetale.
Per quanto riguarda l'azione vasodilatatrice endotelio-dipendente dell'estratto vegetale, sono stati impiegati vari bloccanti come L...

La vascolarizzazione polmonare è un sistema vascolare a bassa pressione in cui la funzione principale è quella di fornire sangue deossigenato all'area di scambio di gas dei polmoni. Le arterie polmonari nei polmoni sono disposte in rami paralleli all'albero bronchiale, formando in definitiva una vasta rete di capillari che è continua su diversi alveoli e, infine, si uniscono in venule e vene. Il tono vascolare dell'arteria polmonare è controllato da diversi fattori, che coinvolgono l'interazione tra l'endotelio e le cellule muscolari lisce vascolari (VSMC)1.
In questo studio, ci concentriamo sulla vasorilassazione endotelio-dipendente e indipendente dell'arteria intrapolmonare (IPA). Per quanto riguarda la vasorilassazione endotelio-dipendente, vari meccanismi che si verificano sulla superficie delle cellule endoteliali potrebbero aumentare la concentrazione intracellulare di Ca2+ (ad esempio, l'acetilcolina [ACh] si lega al recettore muscarinico [M3]), portando alla formazione di ossido nitrico (NO), prostaciclina (PGl2) e fattore iperpolarizzante derivato dall'endotelio (EDHF) (Figura 1 ). L'NO è il principale fattore rilassante derivato dall'endotelio sintetizzato dalla L-arginina mediante ossido nitrico sintasi endoteliale (eNOS)2, che poi si dissocia dalle cellule endoteliali ai VSMC (Figura 1) e stimola l'enzima solubile guanylyl cyclase (sGC); questo enzima trasforma la guanosina trifosfato (GTP) in guanosina monofosfato ciclico (cGMP), che attiva la protein chinasi G (PKG) e riduce i livelli citosolici di Ca2+, causando così vasorilassamento (Figura 1). PGl2 è sintetizzato dalle cellule endoteliali attraverso la via della ciclo-ossigenasi (COX) 3,4. Si lega con il recettore della prostaciclina (IP) sui VSMC e stimola l'enzima adenilil ciclasi (AC), che converte quindi l'adenosina trifosfato (ATP) in adenosina monofosfato ciclico (cAMP) (Figura 1)3,4. cAMP attiva la proteina chinasi A (PKA), riducendo i livelli citosolici di Ca2+ e causando vasorilassamento5 (Figura 1). La via EDHF partecipa anche alla vasorilassamento endotelio-dipendente attraverso vari mediatori endoteliali ed eventi elettrici. L'attivazione della via EDHF porta all'iperpolarizzazione dei VSMC, chiudendo così i canali Ca 2+ (COVC) azionati in tensione, riducendo i livelli intracellulari di Ca2+ e inducendo vasorilassamento6. La vasorilassazione endotelio-indipendente avviene direttamente sui VSMC attraverso diversi meccanismi, come la riduzione del livello intracellulare di Ca 2+, l'inibizione della miosina chinasi a catena leggera (MLCK), l'attivazione della fosfatasi della catena leggera della miosina (MLCP) e la riduzione della sensibilità di Ca2+ al macchinario contrattile delle VSMC. In questo studio, ci concentriamo sulla vasorilassamento causato dall'apertura di vari canali K+, il blocco dei COVC e l'inibizione del rilascio di Ca 2+ dal reticolo sarcoplasmatico7, che porta alla riduzione dei livelli intracellulari di Ca 2+, diminuendo così la fosforilazione della catena leggera della miosina VSMC e il legame miosina-actina o la formazione di ponti incrociati, rispettivamente, alla fine con conseguente vasorilassamento.
La tecnica per valutare le misure di vasocostrizione e vasorilassamento nell'IPA isolata è ben consolidata per i roditori, ma i dati variavano a seconda dei protocolli sperimentali. Il presente studio descrive il metodo utilizzato per valutare le reattività vascolari dei preparati IPA di ratto in vitro, che sono stati effettuati in assenza di fattori esterni che modulano la risposta vascolare in vivo, come segnali nervosi, ormoni, citochine, pressione sanguigna, ecc.
Abbiamo impiegato diversi protocolli sperimentali utilizzando l'estratto vegetale come esempio per studiare le reattività vascolari dell'IPA. Vari bloccanti (Figura 1) sono stati utilizzati per identificare i meccanismi di vasorilassamento endotelio-dipendente e indipendente indotto dall'estratto vegetale. Tuttavia, gli stessi protocolli possono essere adattati per valutare le risposte vascolari dell'IPA a qualsiasi farmaco, estratto o fitochimico utilizzato per il trattamento di varie patologie polmonari.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1,4-dithiothreitol (DTT)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D0632 
			CAS NO. 348-12-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-aminopyridine (4-AP)</td>
			<td>Aldrich Chemical</td>
			<td>A78403 
			CAS NO. 504-24-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetylcholine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A6625 
			CAS NO. 60-31-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Apamin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9459 
			CAS NO. 24345-16-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A2153 
			CAS NO. 9048-46-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium choride</td>
			<td>Ajax Finechem</td>
			<td>AJA960 
			CAS NO. 1707055184</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Charybdotoxin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C7802 
			CAS NO. 95751-30-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase type 1A</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C9891 
			CAS NO. 9001-12-1</td>
			<td>From Clostridium histolyticum</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D(+)-Glucose monohydrate</td>
			<td>Millipore Corporation</td>
			<td>K50876942 924 
			CAS NO. 14431-43-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D4540 
			CAS NO. 67-68-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylene glycol-bis (2-aminoethylether)-N,N,N&#8217;,N&#8217;-tetraacetic acid (EGTA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E3889 
			CAS NO. 67-42-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E9884 
			CAS NO. 60-00-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps 11 cm.</td>
			<td>Rustless Dumoxel</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps 14 cm.</td>
			<td>Rustless Dumoxel</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glibenclamide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G6039 
			CAS NO. 16673-34-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GraphPad Prism program</td>
			<td>Software version 5.0 (San Diego, CA, USA)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H3375 
			CAS NO. 7365-45-9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iberiotoxin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I5904 
			CAS NO. 1002546960</td>
			<td>recombinant from Mesobuthus tamulus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Indomethacin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I7378 
			CAS NO. 53-86-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Labchart Program</td>
			<td>Software version 7.0 (A.D. Instrument, Castle Hill, Australia).</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride</td>
			<td>Ajax Finechem</td>
			<td>296 
			CAS NO. 1506254995</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Male Wistar rats</td>
			<td>Nomura Siam International Co. Ltd., Bangkok, Thailand</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NG-nitro-L-arginine methyl ester (L-NAME)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>N5751 
			CAS NO. 51298-62-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nicardipine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>N7510 
			CAS NO. 54527-84-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Organ bath 15 mL.</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Specific order by the researchers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Papain</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4762 
			CAS NO. 9001-73-4</td>
			<td>FromPapaya Latex</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenal red</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5530 
			CAS NO. 34487-61-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenylephrine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P6126 
			CAS NO. 61-76-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>Kemaus</td>
			<td>KA383 
			CAS NO. 7447-40-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium dihydrogenphosphate</td>
			<td>Aldrich Chemical</td>
			<td>EC231-913-4 
			CAS NO. 7778-77-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>S+A2:E36odium chloride</td>
			<td>Kemaus</td>
			<td>KA465 
			CAS NO. 7647-14-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissors 11 cm.</td>
			<td>Spall Stainless</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissors 14 cm.</td>
			<td>Spall Stainless</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium bicarbonate</td>
			<td>Ajax Finechem</td>
			<td>475 
			CAS NO. 912466</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dihydrogenphosphate</td>
			<td>Aldrich Chemical</td>
			<td>33,198-8 
			CAS NO. 7558-80-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide</td>
			<td>Ajax Finechem</td>
			<td>482 
			CAS NO. 1506196602</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium thiopental</td>
			<td>Anesthal</td>
			<td>JPN3010002 
			CAS NO. 1C 314/47</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taurine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T0625 
			CAS NO. 107-35-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Waterbath WBU 45</td>
			<td>Memmert</td>
			<td>2766 
			CAS NO. -</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of intrapulmonary artery and smooth muscle cells to investigate vascular responses

L'arteria intrapolmonare (IPA) e le cellule muscolari lisce vascolari (VSMC) isolate dai polmoni di ratto possono essere utilizzate per studiare i meccanismi sottostanti di vasocostrizione e vasorilassamento. Dopo aver isolato IPA e VSMC, le caratteristiche delle risposte vascolari in condizioni fisiologiche e patologiche possono essere valutate in assenza di fattori estrinseci come segnali nervosi, ormoni, citochine, ecc. Pertanto, l'IPA e i VSMC fungono da modelli eccellenti per lo studio della fisiologia / fisiopatologia vascolare, insieme a varie indagini sperimentali, come la modulazione da parte di agenti farmacologici, l'analisi elettrofisiologica patch-clamp, l'imaging del calcio, ecc. Qui, abbiamo usato una tecnica per isolare l'IPA per studiare le risposte vascolari in una configurazione di bagno d'organo. I segmenti di IPA sono stati montati sulla camera da bagno dell'organo tramite fili intraluminali e stimolati da vari agenti farmacologici. I cambiamenti nel tono vascolare IPA (cioè vasocostrizione e vasorilassamento), sono stati registrati utilizzando un trasduttore di forza isometrico e un programma software di analisi dei dati fisiologici. Abbiamo implementato diversi protocolli sperimentali, che possono essere adattati per studiare i meccanismi di vasorilassamento/vasocostrizione per lo studio delle attività farmacologiche di farmaci fitochimici o sintetici. I protocolli possono anche essere utilizzati per valutare il ruolo dei farmaci nella modulazione di varie malattie, tra cui l'ipertensione arteriosa polmonare. Il modello IPA ci permette di studiare la curva concentrazione-risposta, che è cruciale nella valutazione dei parametri farmacodinamici dei farmaci.

Il protocollo nel presente studio è stato sviluppato per determinare le condizioni sperimentali ottimali per misurare i fenomeni fisiologici osservati nelle risposte vascolari di preparati isolati di IPA. Gli esperimenti pilota sono stati eseguiti per descrivere i potenziali risultati che aiutano la comprensione degli effetti vascolari e delle basi meccanicistiche dell'azione vasorilassante dell'estratto vegetale, come segue.
Effetto vasorilassante dell'estratto vegetale C...

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Isolation of Intrapulmonary Artery and Smooth Muscle Cells to Investigate Vascular Responses

Le risposte vascolari della circolazione polmonare arteriosa possono essere esplorate utilizzando l'arteria intrapolmonare (IPA) e le cellule muscolari lisce vascolari (VSMC). Il presente studio descrive in dettaglio l'isolamento dell'IPA e i protocolli utilizzati per studiare la vasorilassazione in risposta a stimoli fisiologici.

Isolamento dell'arteria intrapolmonare e delle cellule muscolari lisce per studiare le risposte vascolari

The intrapulmonary artery (IPA) and vascular smooth muscle cells (VSMCs) isolated from rat lungs can be used to study the underlying mechanisms of ...

Questo studio descrive l'isolamento dell'arteria intrapolmonare del ratto e delle cellule muscolari lisce vascolari. Sono stati impiegati diversi protocolli sperimentali, come l'uso della tecnica del bagno d'organo per studiare la risposta vascolare dell'arteria intrapolmonare. Le arterie intrapolmonari e le cellule muscolari lisce vascolari sono modelli eccellenti per studiare la fisiologia vascolare e la fisiopatologia.Gli adattamenti di questa tecnica potrebbero valutare le risposte vascolari di qualsiasi farmaco, estratto o fitochimico. Il montaggio dell'anello arterioso intrapolmonare isolato in un bagno d'organo consente l'uso di arterie intrapolmonari isolate per valutare il ruolo di un farmaco nella modulazione di varie malattie, tra cui l'ipertensione polmonare. I protocolli sperimentali sono tecnicamente fattibili, ma i passaggi cruciali sono complicati ed essenziali per il successo, quindi avere una dimostrazione visiva lo rende più facile da capire e seguire.A dimostrare la procedura sarà Kittiwoot To-on, uno studente di master in fisiologia del Laboratorio dell'Unità di Ricerca Cardiovascolare, Dipartimento di Fisiologia, Facoltà di Scienze Mediche, Naresuan University. Inizia tagliando un singolo lobo del polmone con forbici da 11 centimetri e posizionandolo su una piastra di Petri di nove centimetri con il lato mediale, o radice del polmone, rivolto verso l'alto. Osservare e identificare l'allineamento della vena, dei bronchi e dell'arteria dall'alto verso il basso.Tagliare il bronco longitudinalmente con le forbici. Quindi usa la pinza da 11 centimetri per afferrare la punta del bronco. Sezionare delicatamente e rimuovere i bronchi e le vene dal polmone.Utilizzare la pinza per afferrare la punta dell'arteria intrapolmonare e sezionarla attentamente dal tessuto polmonare con le forbici. Mantenere l'arteria intrapolmonare isolata in soluzione fredda di Krebs fino a quando non viene impostato il gruppo del bagno dell'organo. Dopo aver isolato l'arteria intrapolmonare, tagliare longitudinalmente il ramo principale dell'arteria intrapolmonare con le forbici da 11 centimetri e tagliare a strisce di due millimetri.Immergere le strisce dell'arteria intrapolmonare in DM, quindi incubare le strisce per un'ora a quattro gradi Celsius in DM contenenti un milligrammo per millilitro di papaina, 0,04% BSA e 0,4 millimolare DTT. Quindi incubare a 37 gradi Celsius per 15 minuti. Aggiungere un milligrammo per millilitro di collagenasi di tipo IA nel DM e nuovamente incubare a 37 gradi Celsius per cinque minuti.Trasferire i tessuti in DM fresco e disperderli mediante triturazione delicata con una pipetta Pasteur di vetro. Continuare a triturare fino a quando le cellule muscolari lisce vascolari isolate diventano visibili nella soluzione di bagno al microscopio. Isolare l'arteria intrapolmonare come dimostrato in precedenza e tagliare il ramo principale dell'arteria intrapolmonare in anelli di circa due millimetri di lunghezza.Fissare gli anelli delle arterie intrapolmonari nelle camere da bagno degli organi infilandoli su due fili di acciaio inossidabile di 40 micrometri di diametro. Collegare fili di acciaio inox montati con anelli di arterie intrapolmonari ai trasduttori di forza isometrici collegati al dispositivo di acquisizione dati e al sistema informatico installato con l'idoneo software fisiologico per la registrazione e l'analisi dei dati. Quindi aumentare delicatamente la tensione dell'anello dell'arteria intrapolmonare a un grammo.Lasciare che i segmenti del vaso si bilancino per circa 45 minuti a una tensione di riposo di un grammo. Durante il periodo di equilibrio, assicurarsi che la soluzione di Krebs venga cambiata regolarmente ogni 15 minuti. Dopo l'equilibrazione, testare la vitalità dei vasi misurando la loro vasocostrizione a soluzione di potassio extracellulare elevata.Valutare la presenza o l'assenza di endotelio calcolando la risposta di rilassamento all'acetilcolina in anelli precontratti con PE. Rimuovere meccanicamente l'endotelio strofinando delicatamente l'interno del vaso con un piccolo filo per indurre la denudazione. Quindi equilibrare gli anelli arteriosi per 30 minuti prima dell'inizio degli esperimenti di prova. Studiare l'effetto rilassante dell'estratto vegetale precontraendo gli anelli dell'arteria intrapolmonare con PE. Quindi aggiungere con attenzione da 0,1 a 1000 microgrammi per millilitri di estratto vegetale cumulativamente agli anelli intatti dell'endotelio e agli anelli denudati con endotelio per indurre vasorilassamento e acquisire una curva di risposta dipendente dalla concentrazione.Assicurarsi che anche il DMSO efficace utilizzato come solvente sia valutato in modo simile per fungere da controllo negativo. Valutare il meccanismo d'azione vasorilassante dell'estratto vegetale come menzionato nel testo manoscritto. Quindi, dopo che le contrazioni per stabilizzare il PE, aggiungere concentrazioni cumulative dell'estratto vegetale.Presentare gli effetti dell'estratto vegetale come rilassamento percentuale degli anelli dell'arteria intrapolmonare in presenza di inibitori rispetto alla risposta degli anelli dell'arteria intrapolmonare senza inibitori e costruire la curva di risposta alla concentrazione. Nell'arteria intrapolmonare intatta dell'endotelio, l'estratto vegetale ha suscitato una risposta di vasorilassamento dipendente dalla concentrazione. L'eradicazione dell'endotelio ha ridotto profondamente la vasorilassazione indotta dall'estratto vegetale come riflesso dall'aumento della CE50 di 2,2 volte, l'inibizione di eNOS e EDHF ha evidentemente diminuito la risposta vasorilassante all'estratto vegetale.Ciò ha spostato la curva di risposta alla concentrazione verso destra e aumentato l'EC50 senza alterare i valori E max. Al contrario, l'indometacina non ha mostrato alcun effetto sulla risposta vasorilassante all'estratto vegetale. Negli anelli dell'arteria intrapolmonare denudati dall'endotelio, i bloccanti dei canali del potassio attivati dal calcio hanno diminuito la risposta vasorilassante all'estratto vegetale.Mentre i bloccanti dei canali del potassio voltaggio-dipendenti o sensibili all'ATP non hanno mostrato alcuna deviazione. La preincubazione con l'estratto vegetale ha inibito la contrazione indotta dal cloruro di calcio. Gli anelli dell'arteria intrapolmonare denudati dall'endotelio preincubati con soluzione di Krebs priva di calcio e PE hanno reso una contrazione transitoria.Rispetto al veicolo, gli estratti vegetali hanno ridotto significativamente la contrazione indotta dall'EP. Durante la procedura, è necessario identificare chiaramente la vena, i bronchi e l'arteria nella fase iniziale. Tagliare o danneggiare l'arteria ridurrà la sua lunghezza e influenzerà le risposte vascolari. Questa tecnica può essere adattata per studiare composti che potrebbero servire come prototipi per il trattamento delle malattie vascolari polmonari come l'ipertensione arteriosa polmonare.

Research

JoVE Journal

Medicine

Mesenteric Artery Contraction and Relaxation Studies Using Automated Wire Myography

Contrazione Arteria mesenterica e Studi Relax Utilizzando Myography automatica Wire

Proximal resistance vessels, such as the mesenteric arteries, contribute substantially to the peripheral resistance. These small vessels of between ...

Ricerca

Medicina

Training a Sophisticated Microsurgical Technique: Interposition of External Jugular Vein Graft in the Common Carotid Artery in Rats

La formazione di una sofisticata tecnica microchirurgica: Interposizione della vena giugulare esterna innesto nella carotide comune in Rats

Neointimal hyperplasia is one the primary causes of stenosis in arterialized veins that are of great importance in arterial coronary bypass surgery, in ...

Assessment of Right Ventricular Structure and Function in Mouse Model of Pulmonary Artery Constriction by Transthoracic Echocardiography

Valutazione del ventricolo destro Struttura e funzione in modello murino di polmonare Arteria Costrizione da ecocardiografia transtoracica

Emerging clinical data support the notion that RV dysfunction is critical to the pathogenesis of cardiovascular disease and heart failure1-3. Moreover, ...

Bladder Smooth Muscle Strip Contractility as a Method to Evaluate Lower Urinary Tract Pharmacology

Vescica muscolo liscio Striscia contrattilità come un metodo per valutare Lower Urinary Tract Farmacologia

We describe an in vitro method to measure bladder smooth muscle contractility, and its use for investigating physiological and pharmacological properties ...

Embolic Middle Cerebral Artery Occlusion (MCAO) for Ischemic Stroke with Homologous Blood Clots in Rats

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Embolic occlusione dell&#39;arteria cerebrale media (MCAO) per l&#39;ictus ischemico con omologhi coaguli di sangue nei ratti

Clinically, thrombolytic therapy with use of recombinant tissue plasminogen activator (tPA) remains the most effective treatment for acute ischemic ...

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The carotid artery balloon injury model in rats has been well established for over two decades. It remains an important method to study the molecular and ...

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