Name: isolation of intrapulmonary artery and smooth muscle cells to investigate vascular responses
Uploaded: 2022-06-08T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Intrapulmonary Artery and Smooth Muscle Cells to Investigate Vascular Responses at JoVE.com

Forfatterne ønsker å anerkjenne National Research Council of Thailand, Center of Excellence for innovasjon i kjemi (PERCH-CIC), og International Research Network (IRN61W0005) for å gi økonomisk støtte, og Institutt for fysiologi Fakultet for medisinsk vitenskap, Naresuan University, for forskning anlegget støtte.

Forsøkene som ble utført i denne studien ble godkjent av den etiske komiteen for Naresuan University Animal Care and Use Committee (NUACUC), protokollnummer NU-AE620921, for pleie og bruk av dyr til vitenskapelige formål.
1. Sammensetning av fysiologiske løsninger
<ol><li>Formuler Krebs-løsningen ved å oppløse kjemikalier i destillert vann for å oppnå de endelige konsentrasjonene som følger: 122 mM NaCl, 10 mM HEPES, 5 mM KCl, 0,5 mM KH 2 PO 4, 0,5 mM NaHPO4</...

<ol>
	<li>Lyle, M. A., Davis, J. P., Brozovich, F. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+pulmonary+vascular+smooth+muscle+contractility+in+pulmonary+arterial+hypertension:+Implications+for+therapy.">Regulation of pulmonary vascular smooth muscle contractility in pulmonary arterial hypertension: Implications for therapy.</a> Frontiers in Physiology. 8, 614 (2017).</li><li>Cyr, A. R., Huckaby, L. V., Shiva, S. S., Zuckerbraun, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nitric+oxide+and+endothelial+dysfunction.">Nitric oxide and endothelial dysfunction.</a> Critical Care Clinics. 36 (2), 307-321 (2020).</li><li>Ruan, K. -. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advance+in+understanding+the+biosynthesis+of+prostacyclin+and+thromboxane+A2+in+the+endoplasmic+reticulum+membrane+via+the+cyclo-oxygenase+pathway.">Advance in understanding the biosynthesis of prostacyclin and thromboxane A2 in the endoplasmic reticulum membrane via the cyclo-oxygenase pathway.</a> Mini Reviews in Medicinal Chemistry. 4 (6), 639-647 (2004).</li><li>Del Pozo, R., Hernandez Gonzalez, I., Escribano-Subias, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+prostacyclin+pathway+in+pulmonary+arterial+hypertension:+A+clinical+review.">The prostacyclin pathway in pulmonary arterial hypertension: A clinical review.</a> Expert Review of Respiratory Medicine. 11 (6), 491-503 (2017).</li><li>Morgado, M., Cairr&#227;o, E., Santos-Silva, A. J., Verde, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cyclic+nucleotide-dependent+relaxation+pathways+in+vascular+smooth+muscle.">Cyclic nucleotide-dependent relaxation pathways in vascular smooth muscle.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 69 (2), 247-266 (2012).</li><li>Schmidt, K., de Wit, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelium-derived+hyperpolarizing+factor+and+myoendothelial+coupling:+The+in+vivo+perspective.">Endothelium-derived hyperpolarizing factor and myoendothelial coupling: The in vivo perspective.</a> Frontiers in Physiology. 11, (2020).</li><li>Fan, G., Cui, Y., Gollasch, M., Kassmann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elementary+calcium+signaling+in+arterial+smooth+muscle.">Elementary calcium signaling in arterial smooth muscle.</a> Channels. 13 (1), 505-519 (2019).</li><li>Wisutthathum, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extract+of+Aquilaria+crassna+leaves+and+mangiferin+are+vasodilators+while+showing+no+cytotoxicity.">Extract of Aquilaria crassna leaves and mangiferin are vasodilators while showing no cytotoxicity.</a> Journal of Traditional and Complementary Medicine. 9 (4), 237-242 (2019).</li><li>Kamkaew, N., Paracha, T. U., Ingkaninan, K., Waranuch, N., Chootip, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vasodilatory+effects+and+mechanisms+of+action+of+Bacopa+monnieri+active+compounds+on+rat+mesenteric+arteries.">Vasodilatory effects and mechanisms of action of Bacopa monnieri active compounds on rat mesenteric arteries.</a> Molecules. 24 (12), 2243 (2019).</li><li>Chootip, K., Kennedy, C., Gurney, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+P2+receptors+mediating+contraction+of+the+rat+isolated+pulmonary+vasculature.">Characterization of P2 receptors mediating contraction of the rat isolated pulmonary vasculature.</a> British Journal of Pharmacology. 131, 167 (2000).</li><li>Paracha, T. U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elucidation+of+vasodilation+response+and+structure+activity+relationships+of+N2,+N4-disubstituted+quinazoline+2,+4-diamines+in+a+rat+pulmonary+artery+model.">Elucidation of vasodilation response and structure activity relationships of N2, N4-disubstituted quinazoline 2, 4-diamines in a rat pulmonary artery model.</a> Molecules. 24 (2), 281 (2019).</li><li>Chootip, K., Gurney, A. M., Kennedy, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+P2Y+receptors+couple+to+calcium-dependent,+chloride+channels+in+smooth+muscle+cells+of+the+rat+pulmonary+artery.">Multiple P2Y receptors couple to calcium-dependent, chloride channels in smooth muscle cells of the rat pulmonary artery.</a> Respiratory Research. 6 (1), 1-10 (2005).</li><li>Wisutthathum, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Eulophia+macrobulbon+extract+relaxes+rat+isolated+pulmonary+artery+and+protects+against+monocrotaline-induced+pulmonary+arterial+hypertension.">Eulophia macrobulbon extract relaxes rat isolated pulmonary artery and protects against monocrotaline-induced pulmonary arterial hypertension.</a> Phytomedicine. 50, 157-165 (2018).</li><li>Kruangtip, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Curcumin+analogues+inhibit+phosphodiesterase-5+and+dilate+rat+pulmonary+arteries.">Curcumin analogues inhibit phosphodiesterase-5 and dilate rat pulmonary arteries.</a> Journal of Pharmacy and Pharmacology. 67 (1), 87-95 (2015).</li></ol>

I dette manuskriptet beskriver vi teknikken for isolering av rotte-IPA og VSMC-er. Flere eksperimentelle protokoller har blitt brukt til å undersøke vaskulær respons av IPA in vitro, som kan brukes til å karakterisere den farmakologiske effekten og mekanistiske grunnlaget for IPA vasorelaxation indusert av planteekstrakt.
Når det gjelder den endotelavhengige vasodilatorvirkningen av planteekstraktet, ble forskjellige blokkere som L-NAME (eNOS), indometacin (COX) og apamin+charybd...

Lungevaskulaturen er et lavtrykks vaskulært system der hovedfunksjonen er å levere deoksygenert blod til gassutvekslingsområdet i lungene. Lungearteriene i lungene er ordnet i grener parallelt med bronkialtreet, og danner til slutt et omfattende nettverk av kapillærer som er kontinuerlig over flere alveoler og til slutt kommer sammen i venuler og årer. Den vaskulære tonen i lungearterien styres av flere faktorer, som involverer samspillet mellom endotelet og vaskulære glatte muskelceller (VSMCs)1.
I denne studien fokuserer vi på endotelavhengig og -uavhengig vasorelaxasjon av arteria intrapulmonal arterie (IPA). Med hensyn til den endotelavhengige vasorelaxasjonen kan forskjellige mekanismer som forekommer på overflaten av endotelceller øke intracellulær Ca2+-konsentrasjon (f.eks. acetylkolin [ACh] binder seg til muskarinreseptor [M3]), noe som fører til dannelse av nitrogenoksid (NO), prostacyklin (PGl2) og endotelavledet hyperpolariserende faktor (EDHF) (figur 1 ). NO er den viktigste endotelavledede avslappende faktoren syntetisert fra L-arginin av endotelial nitrogenoksidsyntase (eNOS)2, som deretter dissosieres ut av endotelcellene til VSMCs (figur 1) og stimulerer det oppløselige guanylcyklase (sGC) enzymet; dette enzymet endrer guanosintrifosfat (GTP) til syklisk guanosinmonofosfat (cGMP), som aktiverer proteinkinase G (PKG) og reduserer cytosoliske Ca2+ nivåer, og dermed forårsaker vasorelaxasjon (figur 1). PGl2 syntetiseres av endotelceller via cyklo-oksygenase (COX) -banen 3,4. Det binder seg til prostacyklinreseptoren (IP) på VSMCs og stimulerer adenylylsyklase (AC) enzymet, som deretter omdanner adenosintrifosfat (ATP) til syklisk adenosinmonofosfat (cAMP) (figur 1) 3,4. cAMP aktiverer proteinkinase A (PKA), reduserer cytosolisk Ca2+ nivå og forårsaker vasorelaxasjon5 (figur 1). EDHF-banen deltar også i endotelavhengig vasorelaxasjon via ulike endotelmediatorer og elektriske hendelser. Aktiveringen av EDHF-banen fører til hyperpolarisering av VSMCs, og lukker dermed spenningsopererte Ca2+ kanaler (VOCCs), reduserer intracellulære Ca2 + nivåer og induserer vasorelaxation6. Den endoteluavhengige vasorelaxasjonen skjer direkte på VSMCs via flere mekanismer, for eksempel reduksjon av intracellulært Ca 2+ nivå, inhibering av myosin lettkjedekinase (MLCK), aktivering av myosin lettkjedet fosfatase (MLCP), og reduksjon av Ca2+ følsomhet for kontraktilmaskineriet til VSMCs. I denne studien fokuserer vi på vasorelaxasjonen forårsaket av åpningen av forskjellige K + -kanaler, blokkeringen av VOCCs og inhiberingen av Ca 2 + -frigjøring fra sarkoplasmatisk retikulum7, noe som fører til reduksjon av intracellulære Ca 2 + -nivåer, og dermed reduserer VSMC myosin lyskjedefosforylering og henholdsvis myosin-aktinbinding eller kryssbrodannelse, til slutt resulterer i vasorelaxation.
Teknikken for å evaluere vasokonstriksjons- og vasorelaxasjonsmålinger i isolert IPA er godt etablert for gnagere, men dataene varierte avhengig av eksperimentelle protokoller. Denne studien beskriver metoden som ble brukt til å evaluere vaskulære reaktiviteter av rotte IPA-preparater in vitro, som ble gjort i fravær av eksterne faktorer som modulerer vaskulær respons in vivo, som nervesignaler, hormoner, cytokiner, blodtrykk, etc.
Vi benyttet flere eksperimentelle protokoller ved å bruke planteekstraktet som et eksempel for å studere vaskulære reaktiviteter av IPA. Ulike blokkere (figur 1) ble benyttet for å identifisere mekanismene for endotelavhengig og -uavhengig vasorelaxasjon indusert av planteekstraktet. Likevel kan de samme protokollene tilpasses for å evaluere IPAs vaskulære respons på legemidler, ekstrakter eller fytokjemikalier som brukes til behandling av ulike lungepatologier.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1,4-dithiothreitol (DTT)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D0632 
			CAS NO. 348-12-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-aminopyridine (4-AP)</td>
			<td>Aldrich Chemical</td>
			<td>A78403 
			CAS NO. 504-24-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetylcholine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A6625 
			CAS NO. 60-31-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Apamin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9459 
			CAS NO. 24345-16-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A2153 
			CAS NO. 9048-46-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium choride</td>
			<td>Ajax Finechem</td>
			<td>AJA960 
			CAS NO. 1707055184</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Charybdotoxin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C7802 
			CAS NO. 95751-30-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase type 1A</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C9891 
			CAS NO. 9001-12-1</td>
			<td>From Clostridium histolyticum</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D(+)-Glucose monohydrate</td>
			<td>Millipore Corporation</td>
			<td>K50876942 924 
			CAS NO. 14431-43-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D4540 
			CAS NO. 67-68-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylene glycol-bis (2-aminoethylether)-N,N,N&#8217;,N&#8217;-tetraacetic acid (EGTA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E3889 
			CAS NO. 67-42-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E9884 
			CAS NO. 60-00-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps 11 cm.</td>
			<td>Rustless Dumoxel</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps 14 cm.</td>
			<td>Rustless Dumoxel</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glibenclamide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G6039 
			CAS NO. 16673-34-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GraphPad Prism program</td>
			<td>Software version 5.0 (San Diego, CA, USA)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H3375 
			CAS NO. 7365-45-9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iberiotoxin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I5904 
			CAS NO. 1002546960</td>
			<td>recombinant from Mesobuthus tamulus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Indomethacin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I7378 
			CAS NO. 53-86-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Labchart Program</td>
			<td>Software version 7.0 (A.D. Instrument, Castle Hill, Australia).</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride</td>
			<td>Ajax Finechem</td>
			<td>296 
			CAS NO. 1506254995</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Male Wistar rats</td>
			<td>Nomura Siam International Co. Ltd., Bangkok, Thailand</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NG-nitro-L-arginine methyl ester (L-NAME)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>N5751 
			CAS NO. 51298-62-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nicardipine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>N7510 
			CAS NO. 54527-84-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Organ bath 15 mL.</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Specific order by the researchers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Papain</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4762 
			CAS NO. 9001-73-4</td>
			<td>FromPapaya Latex</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenal red</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5530 
			CAS NO. 34487-61-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenylephrine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P6126 
			CAS NO. 61-76-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>Kemaus</td>
			<td>KA383 
			CAS NO. 7447-40-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium dihydrogenphosphate</td>
			<td>Aldrich Chemical</td>
			<td>EC231-913-4 
			CAS NO. 7778-77-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>S+A2:E36odium chloride</td>
			<td>Kemaus</td>
			<td>KA465 
			CAS NO. 7647-14-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissors 11 cm.</td>
			<td>Spall Stainless</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissors 14 cm.</td>
			<td>Spall Stainless</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium bicarbonate</td>
			<td>Ajax Finechem</td>
			<td>475 
			CAS NO. 912466</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dihydrogenphosphate</td>
			<td>Aldrich Chemical</td>
			<td>33,198-8 
			CAS NO. 7558-80-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide</td>
			<td>Ajax Finechem</td>
			<td>482 
			CAS NO. 1506196602</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium thiopental</td>
			<td>Anesthal</td>
			<td>JPN3010002 
			CAS NO. 1C 314/47</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taurine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T0625 
			CAS NO. 107-35-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Waterbath WBU 45</td>
			<td>Memmert</td>
			<td>2766 
			CAS NO. -</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of intrapulmonary artery and smooth muscle cells to investigate vascular responses

Den intrapulmonale arterien (IPA) og vaskulære glatte muskelceller (VSMCs) isolert fra rotte lunger kan brukes til å studere de underliggende mekanismene for vasokonstriksjon og vasorelaxasjon. Etter å ha isolert IPA og VSMC, kan egenskapene til vaskulære responser i fysiologiske og patologiske forhold vurderes i fravær av ekstrinsiske faktorer som nervesignaler, hormoner, cytokiner, etc. Dermed tjener IPA og VSMCs som gode modeller for å studere vaskulær fysiologi / patofysiologi, sammen med ulike eksperimentelle undersøkelser, for eksempel modulering av farmakologiske midler, patch-clamp elektrofysiologisk analyse, kalsiumavbildning, etc. Her har vi brukt en teknikk for å isolere IPA for å undersøke vaskulære responser i et organbadoppsett. IPA-segmenter ble montert på orgelbadkammeret via intraluminale ledninger og stimulert av forskjellige farmakologiske midler. Endringene i IPA vaskulær tone (dvs. vasokonstriksjon og vasorelaxasjon), ble registrert ved hjelp av en isometrisk krafttransduser og fysiologisk dataanalyseprogram. Vi implementerte flere eksperimentelle protokoller, som kan tilpasses for å undersøke mekanismene for vasorelaxation / vasokonstriksjon for å studere farmakologiske aktiviteter av fytokjemiske eller syntetiske stoffer. Protokollene kan også brukes til å evaluere stoffets roller i modulerende ulike sykdommer, inkludert pulmonal arteriell hypertensjon. IPA-modellen gjør det mulig å undersøke konsentrasjon-respons-kurven, noe som er avgjørende for å vurdere legemidlers farmakodynamiske parametere.

Protokollen i denne studien er utviklet for å bestemme de optimale eksperimentelle forholdene for måling av fysiologiske fenomener observert i vaskulære responser av isolerte IPA-preparater. Pilotforsøkene ble utført for å beskrive de potensielle resultatene som hjelper forståelsen av vaskulære effekter og mekanistisk grunnlag for den vasorelaxante virkningen av planteekstraktet, som følger.
Vasorelaxant effekt av planteekstraktet Som vist i figur 6A, B</st...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Intrapulmonary Artery and Smooth Muscle Cells to Investigate Vascular Responses at JoVE.com

Isolation of Intrapulmonary Artery and Smooth Muscle Cells to Investigate Vascular Responses

Vaskulære responser av arteriell lungesirkulasjon kan utforskes ved hjelp av intrapulmonal arterie (IPA) og vaskulære glatte muskelceller (VSMCs). Denne studien beskriver isoleringen av IPA i detalj og protokollene som brukes til å undersøke vasorelaxation som respons på fysiologiske stimuli.

Isolering av arteria intrapulmonal og glatt muskulatur for å undersøke vaskulære responser

The intrapulmonary artery (IPA) and vascular smooth muscle cells (VSMCs) isolated from rat lungs can be used to study the underlying mechanisms of ...

Denne studien beskriver isolerende rotte intrapulmonal arterie og vaskulære glatte muskelceller. Flere eksperimentelle protokoller ble brukt, for eksempel bruk av organbadteknikken for å undersøke vaskulær respons av intrapulmonal arterie. Intrapulmonale arterier og vaskulære glatte muskelceller er gode modeller for å studere vaskulær fysiologi og patofysiologi.Tilpasninger av denne teknikken kan evaluere vaskulære responser av narkotika, ekstrakter eller fytokjemikalier. Montering av den isolerte intrapulmonale arterielle ringen i et organbad muliggjør bruk av isolerte intrapulmonale arterier for å evaluere stoffets rolle i å modulere ulike sykdommer, inkludert pulmonal hypertensjon. De eksperimentelle protokollene er teknisk gjennomførbare, men de avgjørende trinnene er kompliserte og avgjørende for suksess, så å ha en visuell demonstrasjon gjør det lettere å forstå og følge.Demonstrere prosedyren vil være Kittiwoot To-on, en mastergradsstudent i fysiologi fra Cardiovascular Research Unit Laboratory, Institutt for fysiologi, Fakultet for medisinsk vitenskap, Naresuan University. Begynn med å skjære en enkelt lungelapp med 11 centimeter saks og legg den på en ni centimeter petriskål med medialsiden, eller roten av lungen, vendt oppover. Vær oppmerksom på og identifiser justeringen av venen, bronkiene og arterien fra topp til bunn.Klipp opp bronkusen i lengderetningen med saks. Bruk deretter de 11 centimeter tangene til å ta tak i spissen av bronkusen. Disseker forsiktig og fjern bronkus og vener ut av lungen.Bruk tangen til å ta tak i spissen av den intrapulmonale arterien og disseker den forsiktig ut av lungevevvet med saks. Hold den isolerte intrapulmonale arterien i kald Krebs-løsning til organbadsamlingen er satt opp. Etter å ha isolert den intrapulmonale arterien, kutt åpne hovedgrenen av intrapulmonal arterien i lengderetningen med 11 centimeter saks og kutt i to millimeter strimler.Fordyp de intrapulmonale arteriestrimlene i DM, og inkluder deretter stripene i en time ved fire grader Celsius i DM som inneholder ett milligram per milliliter papain, 0, 04% BSA og 0, 4 millimolar DTT. Deretter inkuberes ved 37 grader Celsius i 15 minutter. Tilsett en milligram per milliliter kollagenase Type IA i DM, og inkuber igjen ved 37 grader Celsius i fem minutter.Overfør vevet til fersk DM og spred ved forsiktig triturasjon ved hjelp av en glass Pasteur-pipette. Fortsett å triturere til isolerte vaskulære glatte muskelceller blir synlige i badeløsningen under mikroskopet. Isoler arteria intrapulmonal arterie som vist tidligere og skjær hovedgrenen av arteria intrapulmonal arterie i ringer på ca. to millimeter i lengde.Fest de intrapulmonale arterieringene i orgelbadkamre ved å tre dem på to 40 mikrometer diameter rustfrie ståltråder. Fest ledninger i rustfritt stål montert med intrapulmonale arterieringer til de isometriske krafttransduserne som er koblet til datainnsamlingsenheten og datasystemet som er installert med egnet fysiologisk programvare for dataregistrering og analyse. Deretter øker du forsiktig spenningen i den intrapulmonale arterieringen til ett gram.La fartøysegmentene likestille i ca. 45 minutter ved en hvilespenning på ett gram. I løpet av likevektsperioden må du sørge for at Krebs-løsningen endres regelmessig hvert 15. minutt. Etter likevekt, test fartøyets levedyktighet ved å måle vasokonstriksjonen til høy ekstracellulær kaliumløsning.Vurder tilstedeværelsen eller fraværet av endotel ved å beregne avslapningsresponsen på acetylkolin i ringer som er forhåndskontraktert med PE. Fjern endotelet mekanisk ved å forsiktig gni innsiden av karet med en liten ledning for å indusere denudasjon. Balanser deretter arterielle ringer i 30 minutter før testeksperimentene starter. Undersøk den avslappende effekten av planteekstraktet ved å prekontrahere intrapulmonale arterieringer med PE. Deretter tilsettes forsiktig 0,1 til 1000 mikrogram per milliliter av planteekstraktet kumulativt til endotel intakte ringer og endotel-denuderte ringer for å indusere vasorelaxering og oppnå en konsentrasjonsavhengig responskurve.Sørg for at den effektive DMSO-en som brukes som løsningsmiddel, også evalueres på samme måte for å fungere som en negativ kontroll. Evaluer den vasorelaxante virkningsmekanismen til planteekstraktet som nevnt i tekstmanuskriptet. Deretter legger du til kumulative konsentrasjoner av planteekstraktet etter at sammentrekningene PE stabiliseres.Presentere effekten av planteekstrakt som prosentvis avslapping av de intrapulmonale arterieringene i nærvær av inhibitorer sammenlignet med responsen til de intrapulmonale arterieringene uten hemmere og konstruere konsentrasjonsresponskurven. I endotelet intakt intrapulmonal arterie, fremkalte planteekstraktet en konsentrasjonsavhengig respons av vasorelaxasjon. Utryddelse av endotel reduserte vasorelaxasjonen forårsaket av planteekstraktet som reflektert av økningen i EC50 med 2,2 ganger, inhibering av eNOS og EDHF reduserte tydeligvis den vasorelaxante responsen på planteekstraktet.Dette flyttet konsentrasjonsresponskurven til høyre og økte EC50 uten å endre E max-verdiene. Tvert imot viste Indomethacin ingen effekt på vasorelaxant respons på planteekstraktet. I de endotel-denuderte intrapulmonale arterieringene reduserte kalsiumaktiverte kaliumkanalblokkere den vasorelaxante responsen på planteekstraktet.Mens blokkere av spenningsstyrte eller ATP-følsomme kaliumkanaler ikke viste avvik. Preinkubering med planteekstraktet hemmet kalsiumklorid-indusert sammentrekning. De endotel-denuderte intrapulmonale arterieringene preinkubert med kalsiumfri Krebs-løsning og PE ga en forbigående sammentrekning.I forhold til kjøretøyet reduserte planteekstraktene signifikant sammentrekningen indusert av PE. Under prosedyren må man tydelig identifisere vene, bronkier og arterie tidlig. Kutting eller skade arterien vil redusere lengden og påvirke vaskulære responser. Denne teknikken kan tilpasses for å undersøke forbindelser som kan tjene som prototyper for behandling av pulmonale vaskulære sykdommer som pulmonal arteriell hypertensjon.

Research

JoVE Journal

Medicine

Mesenteric Artery Contraction and Relaxation Studies Using Automated Wire Myography

Proximal resistance vessels, such as the mesenteric arteries, contribute substantially to the peripheral resistance. These small vessels of between ...

Training a Sophisticated Microsurgical Technique: Interposition of External Jugular Vein Graft in the Common Carotid Artery in Rats

Trene en sofistikert mikrokirurgisk teknikk: interposition av ekstern halsvene Graft i Common carotisar i rotter

Neointimal hyperplasia is one the primary causes of stenosis in arterialized veins that are of great importance in arterial coronary bypass surgery, in ...

Assessment of Right Ventricular Structure and Function in Mouse Model of Pulmonary Artery Constriction by Transthoracic Echocardiography

Vurdering av Høyreventrikulært struktur og funksjon i Mouse Modell av lungearterie Innsnevring av Transtorakal Ekkokardiografi

Emerging clinical data support the notion that RV dysfunction is critical to the pathogenesis of cardiovascular disease and heart failure1-3. Moreover, ...

Bladder Smooth Muscle Strip Contractility as a Method to Evaluate Lower Urinary Tract Pharmacology

Blære glatt muskulatur Strip kontraktilitet som en metode for å vurdere de nedre urinveiene Pharmacology

We describe an in vitro method to measure bladder smooth muscle contractility, and its use for investigating physiological and pharmacological properties ...

Embolic Middle Cerebral Artery Occlusion (MCAO) for Ischemic Stroke with Homologous Blood Clots in Rats

Embolic Middle Cerebral Artery Occlusion MCAO for Ischemic Stroke with Homologous Blood Clots in Rats

Embolisk Middle Cerebral arterieokklusjon (MCAO) for hjerneinfarkt med Homologe blodpropp i Rats

Clinically, thrombolytic therapy with use of recombinant tissue plasminogen activator (tPA) remains the most effective treatment for acute ischemic ...

Vascular Balloon Injury and Intraluminal Administration in Rat Carotid Artery

Vaskulær Balloon Injury og Intraluminal Administration i Rat arteria carotis

The carotid artery balloon injury model in rats has been well established for over two decades. It remains an important method to study the molecular and ...

Permanent Ligation of the Left Anterior Descending Coronary Artery in Mice: A Model of Post-myocardial Infarction Remodelling and Heart Failure

Permanent Ligation av Venstre Anterior Synkende Coronary Artery i Mus: En modell av Post-hjerteinfarkt Remodelling og hjertesvikt

Heart failure is a syndrome in which the heart fails to pump blood at a rate commensurate with cellular oxygen requirements at rest or during stress. It ...

Ultrasound Based Assessment of Coronary Artery Flow and Coronary Flow Reserve Using the Pressure Overload Model in Mice

Ultralyd Basert Vurdering av Coronary Artery Flow og Coronary Flow Reserve Bruke Trykkload Model i Mus

Transthoracic Doppler echocardiography (TTDE) is a clinically useful, noninvasive tool for studying coronary artery flow velocity and coronary flow ...

Ferric Chloride-induced Thrombosis Mouse Model on Carotid Artery and Mesentery Vessel

Jernklorid-indusert tromboser Mouse Model på arteria carotis og mesenterium Vessel

Severe thrombosis and its ischemic consequences such as myocardial infarction, pulmonary embolism and stroke are major worldwide health issues. The ferric ...

Calcification of Vascular Smooth Muscle Cells and Imaging of Aortic Calcification and Inflammation

Forkalkning av vaskulære glatte muskelceller og avbildning av Aorta forkalkninger og betennelser

Cardiovascular disease is the leading cause of morbidity and mortality in the world.  Atherosclerotic plaques, consisting of lipid-laden macrophages and ...