Name: isolation of intrapulmonary artery and smooth muscle cells to investigate vascular responses
Uploaded: 2022-06-08T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Intrapulmonary Artery and Smooth Muscle Cells to Investigate Vascular Responses at JoVE.com

Os autores gostariam de agradecer ao Conselho Nacional de Pesquisa da Tailândia, ao Centro de Excelência para Inovação em Química (PERCH-CIC) e à Rede Internacional de Pesquisa (IRN61W0005) por fornecer apoio financeiro, e ao Departamento de Fisiologia da Faculdade de Ciências Médicas da Universidade de Naresuan, pelo apoio às instalações de pesquisa.

Os experimentos realizados neste estudo foram aprovados pelo Comitê de Ética do Comitê de Cuidado e Uso de Animais da Universidade de Naresuan (NUACUC), número de protocolo NU-AE620921, para o cuidado e uso de animais para fins científicos.
1. Composição das soluções fisiológicas
<ol><li>Formular a solução de Krebs dissolvendo produtos químicos em água destilada para atingir as concentrações finais da seguinte forma: 122 mM de NaCl, 10 mM de HEPES, 5 mM de KC...

<ol>
	<li>Lyle, M. A., Davis, J. P., Brozovich, F. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+pulmonary+vascular+smooth+muscle+contractility+in+pulmonary+arterial+hypertension:+Implications+for+therapy.">Regulation of pulmonary vascular smooth muscle contractility in pulmonary arterial hypertension: Implications for therapy.</a> Frontiers in Physiology. 8, 614 (2017).</li><li>Cyr, A. R., Huckaby, L. V., Shiva, S. S., Zuckerbraun, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nitric+oxide+and+endothelial+dysfunction.">Nitric oxide and endothelial dysfunction.</a> Critical Care Clinics. 36 (2), 307-321 (2020).</li><li>Ruan, K. -. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advance+in+understanding+the+biosynthesis+of+prostacyclin+and+thromboxane+A2+in+the+endoplasmic+reticulum+membrane+via+the+cyclo-oxygenase+pathway.">Advance in understanding the biosynthesis of prostacyclin and thromboxane A2 in the endoplasmic reticulum membrane via the cyclo-oxygenase pathway.</a> Mini Reviews in Medicinal Chemistry. 4 (6), 639-647 (2004).</li><li>Del Pozo, R., Hernandez Gonzalez, I., Escribano-Subias, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+prostacyclin+pathway+in+pulmonary+arterial+hypertension:+A+clinical+review.">The prostacyclin pathway in pulmonary arterial hypertension: A clinical review.</a> Expert Review of Respiratory Medicine. 11 (6), 491-503 (2017).</li><li>Morgado, M., Cairr&#227;o, E., Santos-Silva, A. J., Verde, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cyclic+nucleotide-dependent+relaxation+pathways+in+vascular+smooth+muscle.">Cyclic nucleotide-dependent relaxation pathways in vascular smooth muscle.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 69 (2), 247-266 (2012).</li><li>Schmidt, K., de Wit, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelium-derived+hyperpolarizing+factor+and+myoendothelial+coupling:+The+in+vivo+perspective.">Endothelium-derived hyperpolarizing factor and myoendothelial coupling: The in vivo perspective.</a> Frontiers in Physiology. 11, (2020).</li><li>Fan, G., Cui, Y., Gollasch, M., Kassmann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elementary+calcium+signaling+in+arterial+smooth+muscle.">Elementary calcium signaling in arterial smooth muscle.</a> Channels. 13 (1), 505-519 (2019).</li><li>Wisutthathum, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extract+of+Aquilaria+crassna+leaves+and+mangiferin+are+vasodilators+while+showing+no+cytotoxicity.">Extract of Aquilaria crassna leaves and mangiferin are vasodilators while showing no cytotoxicity.</a> Journal of Traditional and Complementary Medicine. 9 (4), 237-242 (2019).</li><li>Kamkaew, N., Paracha, T. U., Ingkaninan, K., Waranuch, N., Chootip, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vasodilatory+effects+and+mechanisms+of+action+of+Bacopa+monnieri+active+compounds+on+rat+mesenteric+arteries.">Vasodilatory effects and mechanisms of action of Bacopa monnieri active compounds on rat mesenteric arteries.</a> Molecules. 24 (12), 2243 (2019).</li><li>Chootip, K., Kennedy, C., Gurney, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+P2+receptors+mediating+contraction+of+the+rat+isolated+pulmonary+vasculature.">Characterization of P2 receptors mediating contraction of the rat isolated pulmonary vasculature.</a> British Journal of Pharmacology. 131, 167 (2000).</li><li>Paracha, T. U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elucidation+of+vasodilation+response+and+structure+activity+relationships+of+N2,+N4-disubstituted+quinazoline+2,+4-diamines+in+a+rat+pulmonary+artery+model.">Elucidation of vasodilation response and structure activity relationships of N2, N4-disubstituted quinazoline 2, 4-diamines in a rat pulmonary artery model.</a> Molecules. 24 (2), 281 (2019).</li><li>Chootip, K., Gurney, A. M., Kennedy, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+P2Y+receptors+couple+to+calcium-dependent,+chloride+channels+in+smooth+muscle+cells+of+the+rat+pulmonary+artery.">Multiple P2Y receptors couple to calcium-dependent, chloride channels in smooth muscle cells of the rat pulmonary artery.</a> Respiratory Research. 6 (1), 1-10 (2005).</li><li>Wisutthathum, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Eulophia+macrobulbon+extract+relaxes+rat+isolated+pulmonary+artery+and+protects+against+monocrotaline-induced+pulmonary+arterial+hypertension.">Eulophia macrobulbon extract relaxes rat isolated pulmonary artery and protects against monocrotaline-induced pulmonary arterial hypertension.</a> Phytomedicine. 50, 157-165 (2018).</li><li>Kruangtip, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Curcumin+analogues+inhibit+phosphodiesterase-5+and+dilate+rat+pulmonary+arteries.">Curcumin analogues inhibit phosphodiesterase-5 and dilate rat pulmonary arteries.</a> Journal of Pharmacy and Pharmacology. 67 (1), 87-95 (2015).</li></ol>

Neste manuscrito, descrevemos a técnica de isolamento de IPA e VSMCs de ratos. Vários protocolos experimentais têm sido empregados para investigar a resposta vascular da AIP in vitro, que podem ser utilizados para caracterizar o efeito farmacológico e a base mecanicista do vasorelaxamento da AIP induzido pelo extrato vegetal.
Em relação à ação vasodilatadora endotélio-dependente do extrato vegetal, vários bloqueadores como L-NAME (eNOS), indometacina (COX) e apamina+caribdo...

A vasculatura pulmonar é um sistema vascular de baixa pressão em que a principal função é entregar sangue desoxigenado para a área de troca de gases dos pulmões. As artérias pulmonares nos pulmões estão dispostas em ramos paralelos à árvore brônquica, formando uma extensa rede de capilares que é contínua sobre vários alvéolos e, finalmente, juntando-se em vênulas e veias. O tônus vascular da artéria pulmonar é controlado por diversos fatores, envolvendo a interação entre o endotélio e as células musculares lisas vasculares (CMVS)1.
Neste estudo, enfocamos o vasorelaxamento dependente e independente do endotélio da artéria intrapulmonar (AIP). Com relação ao vasorelaxamento dependente do endotélio, vários mecanismos que ocorrem na superfície das células endoteliais podem aumentar a concentração intracelular de Ca2+ (por exemplo, a acetilcolina [ACh] se liga ao receptor muscarínico [M3]), levando à formação de óxido nítrico (NO), prostaciclina (PGl2) e fator hiperpolarizante derivado do endotélio (EDHF) (Figura 1 ). O NO é o principal fator relaxante derivado do endotélio sintetizado a partir da L-arginina pela óxido nítrico sintase endotelial (eNOS)2, que então se dissocia das células endoteliais para VSMCs (Figura 1) e estimula a enzima guanililciclase solúvel (sGC); essa enzima transforma o trifosfato de guanosina (GTP) em monofosfato cíclico de guanosina (cGMP), que ativa a proteína quinase G (PKG) e reduz os níveis citosólicos de Ca2+, causando vasorelaxamento (Figura 1). O PGl2 é sintetizado por células endoteliais através da via ciclo-oxigenase (COX) 3,4. Liga-se ao receptor de prostaciclina (IP) em VSMCs e estimula a enzima adenilil ciclase (AC), que então converte o trifosfato de adenosina (ATP) em monofosfato de adenosina cíclico (cAMP) (Figura 1)3,4. O AMPc ativa a proteína quinase A (PKA), reduzindo os níveis citosólicos de Ca2+ e causando vasorelaxamento5 (Figura 1). A via EDHF também participa do vasorelaxamento dependente do endotélio através de vários mediadores endoteliais e eventos elétricos. A ativação da via EDHF leva à hiperpolarização dos CMVS, fechando assim os canais de Ca 2+ operados por voltagem (VOCCs), reduzindo os níveis intracelulares de Ca 2+ e induzindo vasorelaxamento 6. O vasorelaxamento independente do endotélio ocorre diretamente nos CMVS por meio de vários mecanismos, como a redução do nível intracelular de Ca 2+, a inibição da miosina quinase de cadeia leve (MLCK), a ativação da fosfatase de cadeia leve da miosina (MLCP) e a redução da sensibilidade de Ca2+ à maquinaria contrátil dos VSMCs. Neste estudo, enfocamos o vasorelaxamento causado pela abertura de vários canais K+, o bloqueio de VOCCs e a inibição da liberação de Ca 2+ do retículo sarcoplasmático7, o que leva à redução dos níveis intracelulares de Ca2+, diminuindo assim a fosforilação da cadeia leve da miosina VSMC e a ligação miosina-actina ou formação de ponte cruzada, respectivamente, em última análise, resultando em vasorelaxamento.
A técnica para avaliar as medidas de vasoconstrição e vasorelaxamento em TIP isolada está bem estabelecida para roedores, mas os dados variaram dependendo dos protocolos experimentais. O presente estudo descreve o método utilizado para avaliar as reatividades vasculares de preparações de AIP in vitro de ratos, que foram realizadas na ausência de fatores externos moduladores da resposta vascular in vivo, como sinais nervosos, hormônios, citocinas, pressão arterial, etc.
Empregamos vários protocolos experimentais utilizando o extrato vegetal como exemplo para o estudo das reatividades vasculares da AIP. Vários bloqueadores (Figura 1) foram utilizados para identificar os mecanismos de vasorelaxamento endotélio-dependente e independente induzido pelo extrato vegetal. No entanto, os mesmos protocolos podem ser adaptados para avaliar as respostas vasculares da AIP a quaisquer fármacos, extratos ou fitoquímicos utilizados para o tratamento de várias patologias pulmonares.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1,4-dithiothreitol (DTT)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D0632 
			CAS NO. 348-12-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-aminopyridine (4-AP)</td>
			<td>Aldrich Chemical</td>
			<td>A78403 
			CAS NO. 504-24-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetylcholine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A6625 
			CAS NO. 60-31-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Apamin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9459 
			CAS NO. 24345-16-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A2153 
			CAS NO. 9048-46-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium choride</td>
			<td>Ajax Finechem</td>
			<td>AJA960 
			CAS NO. 1707055184</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Charybdotoxin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C7802 
			CAS NO. 95751-30-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase type 1A</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C9891 
			CAS NO. 9001-12-1</td>
			<td>From Clostridium histolyticum</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D(+)-Glucose monohydrate</td>
			<td>Millipore Corporation</td>
			<td>K50876942 924 
			CAS NO. 14431-43-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D4540 
			CAS NO. 67-68-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylene glycol-bis (2-aminoethylether)-N,N,N&#8217;,N&#8217;-tetraacetic acid (EGTA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E3889 
			CAS NO. 67-42-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E9884 
			CAS NO. 60-00-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps 11 cm.</td>
			<td>Rustless Dumoxel</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps 14 cm.</td>
			<td>Rustless Dumoxel</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glibenclamide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G6039 
			CAS NO. 16673-34-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GraphPad Prism program</td>
			<td>Software version 5.0 (San Diego, CA, USA)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H3375 
			CAS NO. 7365-45-9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iberiotoxin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I5904 
			CAS NO. 1002546960</td>
			<td>recombinant from Mesobuthus tamulus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Indomethacin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I7378 
			CAS NO. 53-86-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Labchart Program</td>
			<td>Software version 7.0 (A.D. Instrument, Castle Hill, Australia).</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride</td>
			<td>Ajax Finechem</td>
			<td>296 
			CAS NO. 1506254995</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Male Wistar rats</td>
			<td>Nomura Siam International Co. Ltd., Bangkok, Thailand</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NG-nitro-L-arginine methyl ester (L-NAME)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>N5751 
			CAS NO. 51298-62-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nicardipine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>N7510 
			CAS NO. 54527-84-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Organ bath 15 mL.</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Specific order by the researchers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Papain</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4762 
			CAS NO. 9001-73-4</td>
			<td>FromPapaya Latex</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenal red</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5530 
			CAS NO. 34487-61-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenylephrine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P6126 
			CAS NO. 61-76-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>Kemaus</td>
			<td>KA383 
			CAS NO. 7447-40-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium dihydrogenphosphate</td>
			<td>Aldrich Chemical</td>
			<td>EC231-913-4 
			CAS NO. 7778-77-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>S+A2:E36odium chloride</td>
			<td>Kemaus</td>
			<td>KA465 
			CAS NO. 7647-14-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissors 11 cm.</td>
			<td>Spall Stainless</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissors 14 cm.</td>
			<td>Spall Stainless</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium bicarbonate</td>
			<td>Ajax Finechem</td>
			<td>475 
			CAS NO. 912466</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dihydrogenphosphate</td>
			<td>Aldrich Chemical</td>
			<td>33,198-8 
			CAS NO. 7558-80-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide</td>
			<td>Ajax Finechem</td>
			<td>482 
			CAS NO. 1506196602</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium thiopental</td>
			<td>Anesthal</td>
			<td>JPN3010002 
			CAS NO. 1C 314/47</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taurine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T0625 
			CAS NO. 107-35-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Waterbath WBU 45</td>
			<td>Memmert</td>
			<td>2766 
			CAS NO. -</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of intrapulmonary artery and smooth muscle cells to investigate vascular responses

A artéria intrapulmonar (AIP) e as células musculares lisas vasculares (CMVS) isoladas dos pulmões de ratos podem ser usadas para estudar os mecanismos subjacentes de vasoconstrição e vasorelaxamento. Após o isolamento da AIP e dos CMVS, as características das respostas vasculares em condições fisiológicas e patológicas podem ser avaliadas na ausência de fatores extrínsecos, como sinais nervosos, hormônios, citocinas, etc. Assim, o IPA e o VSMCs servem como excelentes modelos para o estudo da fisiologia / fisiopatologia vascular, juntamente com várias investigações experimentais, como modulação por agentes farmacológicos, análise eletrofisiológica patch-clamp, imagens de cálcio, etc. Aqui, utilizamos uma técnica de isolamento da AFI para investigar as respostas vasculares em uma configuração de banho de órgão. Os segmentos de AFI foram montados na câmara de banho do órgão através de fios intraluminais e estimulados por vários agentes farmacológicos. As alterações no tônus vascular da AIP (isto é, vasoconstrição e vasorelaxamento) foram registradas por meio de um transdutor de força isométrico e de um programa de análise de dados fisiológicos. Implementamos diversos protocolos experimentais, que podem ser adaptados para investigar os mecanismos de vasorelaxamento/vasoconstrição para o estudo das atividades farmacológicas de drogas fitoquímicas ou sintéticas. Os protocolos também podem ser usados para avaliar o papel dos medicamentos na modulação de várias doenças, incluindo a hipertensão arterial pulmonar. O modelo IPA permite investigar a curva concentração-resposta, que é crucial na avaliação dos parâmetros farmacodinâmicos dos fármacos.

O protocolo do presente estudo foi desenvolvido para determinar as condições experimentais ótimas para a mensuração de fenômenos fisiológicos observados nas respostas vasculares de preparações isoladas de AIP. Os experimentos piloto foram realizados para descrever os potenciais desfechos que auxiliam na compreensão dos efeitos vasculares e da base mecanicista da ação vasorelaxante do extrato vegetal, conforme a seguir.
Efeito vasorelaxante do extrato vegetal Com...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Intrapulmonary Artery and Smooth Muscle Cells to Investigate Vascular Responses at JoVE.com

Isolation of Intrapulmonary Artery and Smooth Muscle Cells to Investigate Vascular Responses

As respostas vasculares da circulação arterial pulmonar podem ser exploradas usando a artéria intrapulmonar (AIP) e as células musculares lisas vasculares (CMVS). O presente estudo descreve detalhadamente o isolamento da AFI e os protocolos utilizados para investigar o vasorelaxamento em resposta a estímulos fisiológicos.

Isolamento da artéria intrapulmonar e das células musculares lisas para investigar as respostas vasculares

The intrapulmonary artery (IPA) and vascular smooth muscle cells (VSMCs) isolated from rat lungs can be used to study the underlying mechanisms of ...

Este estudo descreve o isolamento da artéria intrapulmonar de ratos e das células musculares lisas vasculares. Vários protocolos experimentais foram empregados, como o uso da técnica de banho de órgãos para investigar a resposta vascular da artéria intrapulmonar. As artérias intrapulmonares e as células musculares lisas vasculares são excelentes modelos para estudar a fisiologia e a fisiopatologia vasculares.Adaptações desta técnica poderiam avaliar as respostas vasculares de quaisquer drogas, extratos ou fitoquímicos. A montagem do anel arterial intrapulmonar isolado em um banho de órgão permite o uso de artérias intrapulmonares isoladas para avaliar o papel de uma droga na modulação de várias doenças, incluindo a hipertensão pulmonar. Os protocolos experimentais são tecnicamente viáveis, mas as etapas cruciais são complicadas e essenciais para o sucesso, portanto, ter uma demonstração visual facilita a compreensão e o acompanhamento.Demonstrando o procedimento estará Kittiwoot To-on, um estudante de mestrado em fisiologia do Laboratório da Unidade de Pesquisa Cardiovascular, Departamento de Fisiologia, Faculdade de Ciências Médicas, Universidade de Naresuan. Comece cortando um único lobo do pulmão com uma tesoura de 11 centímetros e colocando-o em uma placa de Petri de nove centímetros com o lado medial, ou raiz do pulmão, voltado para cima. Observe e identifique o alinhamento da veia, brônquios e artéria de cima para baixo.Corte o brônquio longitudinalmente com uma tesoura. Em seguida, use a pinça de 11 centímetros para agarrar a ponta do brônquio. Disseque suavemente e remova o brônquio e as veias para fora do pulmão.Use o fórceps para agarrar a ponta da artéria intrapulmonar e dissecá-la cuidadosamente para fora do tecido pulmonar com uma tesoura. Mantenha a artéria intrapulmonar isolada em solução fria de Krebs até que o conjunto do banho do órgão seja configurado. Após o isolamento da artéria intrapulmonar, corte longitudinalmente o ramo principal da artéria intrapulmonar com a tesoura de 11 centímetros e corte em tiras de dois milímetros.Imergir as tiras da artéria intrapulmonar em DM e, em seguida, incubá-las por uma hora a quatro graus Celsius em MS contendo um miligrama por mililitro de papaína, 0,04% BSA e 0,4 milimolar DTT. Em seguida, incube a 37 graus Celsius por 15 minutos. Adicione um miligrama por mililitro de colagenase Tipo IA em DM e incube novamente a 37 graus Celsius por cinco minutos.Transfira os tecidos para DM fresco e disperse por trituração suave usando uma pipeta Pasteur de vidro. Continue triturando até que as células musculares lisas vasculares isoladas se tornem visíveis na solução de banho sob o microscópio. Isole a artéria intrapulmonar, como demonstrado anteriormente, e corte o ramo principal da artéria intrapulmonar em anéis de aproximadamente dois milímetros de comprimento.Afixe os anéis da artéria intrapulmonar nas câmaras de banho do órgão, enfiando-os em dois fios de aço inoxidável de 40 micrômetros de diâmetro. Anexar fios de aço inoxidável montados com anéis da artéria intrapulmonar aos transdutores de força isométricos conectados ao dispositivo de aquisição de dados e ao sistema de computador instalado com o software fisiológico adequado para registro e análise de dados. Em seguida, aumente suavemente a tensão do anel da artéria intrapulmonar para um grama.Permita que os segmentos do vaso se equilibrem por cerca de 45 minutos a uma tensão de repouso de um grama. Durante o período de equilíbrio, certifique-se de que a solução de Krebs é trocada regularmente a cada 15 minutos. Após o equilíbrio, testar a viabilidade dos vasos medindo sua vasoconstrição para solução de potássio extracelular alta.Avaliar a presença ou ausência de endotélio calculando a resposta de relaxamento à acetilcolina em anéis pré-contraídos com EP. Remova mecanicamente o endotélio esfregando suavemente o interior do vaso com um pequeno fio para induzir o desnudamento. Em seguida, equilibre os anéis arteriais por 30 minutos antes do início dos experimentos de teste. Investigar o efeito relaxante do extrato vegetal pré-contraindo anéis da artéria intrapulmonar com EP. Em seguida, adicione cuidadosamente 0,1 a 1000 microgramas por mililitros do extrato da planta cumulativamente aos anéis intactos do endotélio e aos anéis desnudos do endotélio para induzir vasorelaxamento e adquirir uma curva de resposta dependente da concentração.Certifique-se de que o DMSO eficaz usado como solvente também seja avaliado de forma semelhante para servir como um controle negativo. Avaliar o mecanismo vasorelaxante de ação do extrato vegetal conforme mencionado no texto manuscrito. Em seguida, após as contrações para estabilizar PE, adicione concentrações cumulativas do extrato da planta.Apresentar os efeitos do extrato vegetal como porcentagem de relaxamento dos anéis da artéria intrapulmonar na presença de inibidores em comparação com a resposta dos anéis da artéria intrapulmonar sem inibidores e construir a curva de concentração-resposta. Na artéria intrapulmonar intacta do endotélio, o extrato da planta provocou uma resposta de vasorelaxamento dependente da concentração. A erradicação do endotélio reduziu profundamente o vasorelaxamento induzido pelo extrato vegetal, como refletido pelo aumento da CE50 em 2,2 vezes, a inibição da eNOS e do EDHF evidentemente diminuiu a resposta vasorelaxante ao extrato vegetal.Isso deslocou a curva de resposta à concentração para a direita e aumentou a CE50 sem alterar os valores de E máx. Pelo contrário, a indometacina não mostrou efeito sobre a resposta vasorelaxante ao extrato da planta. Nos anéis da artéria intrapulmonar desnudados pelo endotélio, os bloqueadores dos canais de potássio ativados por cálcio diminuíram a resposta vasorelaxante ao extrato vegetal.Enquanto os bloqueadores dos canais de potássio dependentes de voltagem ou sensíveis ao ATP não apresentaram desvio. A pré-incubação com o extrato da planta inibiu a contração induzida pelo cloreto de cálcio. Os anéis da artéria intrapulmonar desnudados com endotélio pré-incubados com solução de Krebs livre de cálcio e EP renderam uma contração transitória.Em comparação com o veículo, os extratos vegetais reduziram significativamente a contração induzida pela EP. Durante o procedimento, deve-se identificar claramente veia, brônquios e artéria no início. Cortar ou danificar a artéria reduzirá seu comprimento e afetará as respostas vasculares. Essa técnica pode ser adaptada para investigar compostos que possam servir como protótipos para tratamentos de doenças vasculares pulmonares, como a hipertensão arterial pulmonar.

Research

JoVE Journal

Medicine

Mesenteric Artery Contraction and Relaxation Studies Using Automated Wire Myography

A contração da artéria mesentérica e Estudos Relaxamento Usando Miografia Fio Automated

Proximal resistance vessels, such as the mesenteric arteries, contribute substantially to the peripheral resistance. These small vessels of between ...

Medicina

Training a Sophisticated Microsurgical Technique: Interposition of External Jugular Vein Graft in the Common Carotid Artery in Rats

Treinar um técnica microcirúrgica sofisticado: Interposição de enxerto de veia jugular externa na artéria carótida comum em ratos

Neointimal hyperplasia is one the primary causes of stenosis in arterialized veins that are of great importance in arterial coronary bypass surgery, in ...

Assessment of Right Ventricular Structure and Function in Mouse Model of Pulmonary Artery Constriction by Transthoracic Echocardiography

Avaliação da Estrutura e Função do Ventrículo Direito em modelo de camundongo Pulmonary Artery constrição por Ecocardiografia transtorácica

Emerging clinical data support the notion that RV dysfunction is critical to the pathogenesis of cardiovascular disease and heart failure1-3. Moreover, ...

Bladder Smooth Muscle Strip Contractility as a Method to Evaluate Lower Urinary Tract Pharmacology

Músculo liso da bexiga Faixa Contractility como um método para avaliar do trato urinário inferior Farmacologia

We describe an in vitro method to measure bladder smooth muscle contractility, and its use for investigating physiological and pharmacological properties ...

Embolic Middle Cerebral Artery Occlusion (MCAO) for Ischemic Stroke with Homologous Blood Clots in Rats

Embolic Middle Cerebral Artery Occlusion MCAO for Ischemic Stroke with Homologous Blood Clots in Rats

Embolic artéria cerebral média Oclusão (MCAO) para Acidente Vascular Cerebral Isquêmico com homólogos Coágulos de sangue em ratos

Clinically, thrombolytic therapy with use of recombinant tissue plasminogen activator (tPA) remains the most effective treatment for acute ischemic ...

Vascular Balloon Injury and Intraluminal Administration in Rat Carotid Artery

Lesão Balloon Vascular e Administração Intraluminal em Rat Carótida

The carotid artery balloon injury model in rats has been well established for over two decades. It remains an important method to study the molecular and ...

Permanent Ligation of the Left Anterior Descending Coronary Artery in Mice: A Model of Post-myocardial Infarction Remodelling and Heart Failure

A ligação permanente da artéria coronária descendente anterior esquerda em Ratos: Um Modelo de Remodelação pós-infarto do miocárdio e insuficiência cardíaca

Heart failure is a syndrome in which the heart fails to pump blood at a rate commensurate with cellular oxygen requirements at rest or during stress. It ...

Ultrasound Based Assessment of Coronary Artery Flow and Coronary Flow Reserve Using the Pressure Overload Model in Mice

Avaliação ultra-som base de Artéria Coronária Flow e Fluxo Coronariano Reserve Usando o modelo de sobrecarga de pressão no Mice

Transthoracic Doppler echocardiography (TTDE) is a clinically useful, noninvasive tool for studying coronary artery flow velocity and coronary flow ...

Ferric Chloride-induced Thrombosis Mouse Model on Carotid Artery and Mesentery Vessel

Férrico Thrombosis Modelo rato na artéria carótida e Mesentery Vessel induzida por Chloride

Severe thrombosis and its ischemic consequences such as myocardial infarction, pulmonary embolism and stroke are major worldwide health issues. The ferric ...

Calcification of Vascular Smooth Muscle Cells and Imaging of Aortic Calcification and Inflammation

Calcificação das células do músculo vascular liso e de imagem da aorta calcificação e inflamação

Cardiovascular disease is the leading cause of morbidity and mortality in the world.  Atherosclerotic plaques, consisting of lipid-laden macrophages and ...