Name: isolation of intrapulmonary artery and smooth muscle cells to investigate vascular responses
Uploaded: 2022-06-08T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Intrapulmonary Artery and Smooth Muscle Cells to Investigate Vascular Responses at JoVE.com

Авторы хотели бы поблагодарить Национальный исследовательский совет Таиланда, Центр передового опыта по инновациям в химии (PERCH-CIC) и Международную исследовательскую сеть (IRN61W0005) за предоставление финансовой поддержки, а также Факультет физиологии факультета медицинских наук Университета Наресуан за поддержку исследовательского центра.

Эксперименты, проведенные в этом исследовании, были одобрены Комитетом по этике Комитета по уходу и использованию животных Университета Наресуан (NUACUC), номер протокола NU-AE620921, для ухода и использования животных в научных целях.
1. Состав физиологических растворов...

<ol>
	<li>Lyle, M. A., Davis, J. P., Brozovich, F. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+pulmonary+vascular+smooth+muscle+contractility+in+pulmonary+arterial+hypertension:+Implications+for+therapy.">Regulation of pulmonary vascular smooth muscle contractility in pulmonary arterial hypertension: Implications for therapy.</a> Frontiers in Physiology. 8, 614 (2017).</li><li>Cyr, A. R., Huckaby, L. V., Shiva, S. S., Zuckerbraun, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nitric+oxide+and+endothelial+dysfunction.">Nitric oxide and endothelial dysfunction.</a> Critical Care Clinics. 36 (2), 307-321 (2020).</li><li>Ruan, K. -. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advance+in+understanding+the+biosynthesis+of+prostacyclin+and+thromboxane+A2+in+the+endoplasmic+reticulum+membrane+via+the+cyclo-oxygenase+pathway.">Advance in understanding the biosynthesis of prostacyclin and thromboxane A2 in the endoplasmic reticulum membrane via the cyclo-oxygenase pathway.</a> Mini Reviews in Medicinal Chemistry. 4 (6), 639-647 (2004).</li><li>Del Pozo, R., Hernandez Gonzalez, I., Escribano-Subias, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+prostacyclin+pathway+in+pulmonary+arterial+hypertension:+A+clinical+review.">The prostacyclin pathway in pulmonary arterial hypertension: A clinical review.</a> Expert Review of Respiratory Medicine. 11 (6), 491-503 (2017).</li><li>Morgado, M., Cairr&#227;o, E., Santos-Silva, A. J., Verde, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cyclic+nucleotide-dependent+relaxation+pathways+in+vascular+smooth+muscle.">Cyclic nucleotide-dependent relaxation pathways in vascular smooth muscle.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 69 (2), 247-266 (2012).</li><li>Schmidt, K., de Wit, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelium-derived+hyperpolarizing+factor+and+myoendothelial+coupling:+The+in+vivo+perspective.">Endothelium-derived hyperpolarizing factor and myoendothelial coupling: The in vivo perspective.</a> Frontiers in Physiology. 11, (2020).</li><li>Fan, G., Cui, Y., Gollasch, M., Kassmann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elementary+calcium+signaling+in+arterial+smooth+muscle.">Elementary calcium signaling in arterial smooth muscle.</a> Channels. 13 (1), 505-519 (2019).</li><li>Wisutthathum, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extract+of+Aquilaria+crassna+leaves+and+mangiferin+are+vasodilators+while+showing+no+cytotoxicity.">Extract of Aquilaria crassna leaves and mangiferin are vasodilators while showing no cytotoxicity.</a> Journal of Traditional and Complementary Medicine. 9 (4), 237-242 (2019).</li><li>Kamkaew, N., Paracha, T. U., Ingkaninan, K., Waranuch, N., Chootip, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vasodilatory+effects+and+mechanisms+of+action+of+Bacopa+monnieri+active+compounds+on+rat+mesenteric+arteries.">Vasodilatory effects and mechanisms of action of Bacopa monnieri active compounds on rat mesenteric arteries.</a> Molecules. 24 (12), 2243 (2019).</li><li>Chootip, K., Kennedy, C., Gurney, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+P2+receptors+mediating+contraction+of+the+rat+isolated+pulmonary+vasculature.">Characterization of P2 receptors mediating contraction of the rat isolated pulmonary vasculature.</a> British Journal of Pharmacology. 131, 167 (2000).</li><li>Paracha, T. U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elucidation+of+vasodilation+response+and+structure+activity+relationships+of+N2,+N4-disubstituted+quinazoline+2,+4-diamines+in+a+rat+pulmonary+artery+model.">Elucidation of vasodilation response and structure activity relationships of N2, N4-disubstituted quinazoline 2, 4-diamines in a rat pulmonary artery model.</a> Molecules. 24 (2), 281 (2019).</li><li>Chootip, K., Gurney, A. M., Kennedy, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+P2Y+receptors+couple+to+calcium-dependent,+chloride+channels+in+smooth+muscle+cells+of+the+rat+pulmonary+artery.">Multiple P2Y receptors couple to calcium-dependent, chloride channels in smooth muscle cells of the rat pulmonary artery.</a> Respiratory Research. 6 (1), 1-10 (2005).</li><li>Wisutthathum, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Eulophia+macrobulbon+extract+relaxes+rat+isolated+pulmonary+artery+and+protects+against+monocrotaline-induced+pulmonary+arterial+hypertension.">Eulophia macrobulbon extract relaxes rat isolated pulmonary artery and protects against monocrotaline-induced pulmonary arterial hypertension.</a> Phytomedicine. 50, 157-165 (2018).</li><li>Kruangtip, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Curcumin+analogues+inhibit+phosphodiesterase-5+and+dilate+rat+pulmonary+arteries.">Curcumin analogues inhibit phosphodiesterase-5 and dilate rat pulmonary arteries.</a> Journal of Pharmacy and Pharmacology. 67 (1), 87-95 (2015).</li></ol>

В этой рукописи мы описываем технику выделения крыс iPA и VSMC. Несколько экспериментальных протоколов были использованы для исследования сосудистого ответа IPA in vitro, который может быть использован для характеристики фармакологического эффекта и механистической основы вазорелаксац...

Легочная сосудистая система представляет собой сосудистую систему низкого давления, в которой основной функцией является доставка дезоксигенированной крови в газообменную область легких. Легочные артерии в легких расположены в ветвях параллельно бронхиальному дереву, в конечном итоге образуя обширную сеть капилляров, которая непрерывна над несколькими альвеолами и, наконец, собирается вместе в венулы и вены. Сосудистый тонус легочной артерии контролируется несколькими факторами, включая взаимодействие между эндотелием и гладкомышечными клетками сосудов (VSMC)1.
В этом исследовании мы фокусируемся на эндотелий-зависимой и -независимой вазорелаксации внутрилегочной артерии (IPA). Что касается эндотелий-зависимой вазорелаксации, различные механизмы, происходящие на поверхности эндотелиальных клеток, могут увеличивать внутриклеточную концентрацию Ca2+ (например, ацетилхолин [ACh] связывается с мускариновым рецептором [M3]), что приводит к образованию оксида азота (NO), простациклина (PGl2) и гиперполяризующего фактора, полученного из эндотелия (EDHF) (рисунок 1 ). NO является основным эндотелиевым расслабляющим фактором, синтезируемым из L-аргинина эндотелиальной синтазой оксида азота (eNOS)2, который затем диссоциирует из эндотелиальных клеток в VSMC (рисунок 1) и стимулирует растворимый фермент гуанилилциклазы (sGC); этот фермент превращает гуанозинтрифосфат (GTP) в циклический гуанозинмонофосфат (cGMP), который активирует протеинкиназу G (PKG) и снижает цитозольный уровень Ca2+, вызывая тем самым вазорелаксацию (рисунок 1). PGl2 синтезируется эндотелиальными клетками через циклооксигеназный (ЦОГ) путь 3,4. Он связывается с простациклиновым рецептором (IP) на VSMC и стимулирует фермент аденилилциклазу (AC), который затем превращает аденозинтрифосфат (АТФ) в циклический аденозинмонофосфат (цАМФ) (Рисунок 1)3,4. цАМФ активирует протеинкиназу А (ПКА), снижая цитозольный уровень Ca2+ и вызывая вазорелаксацию5 (рисунок 1). Путь EDHF также участвует в эндотелий-зависимой вазорелаксации через различные эндотелиальные медиаторы и электрические события. Активация пути EDHF приводит к гиперполяризации VSMC, тем самым закрывая управляемые напряжением каналы Ca2+ (ЛОСК), снижая внутриклеточные уровни Ca2+ и индуцируя вазорелаксацию6. Эндотелий-независимое вазорелаксирование происходит непосредственно на VSMC с помощью нескольких механизмов, таких как снижение внутриклеточного уровня Ca2+, ингибирование миозин-тижной киназы (MLCK), активация миозин-фосфатазы легкой цепи (MLCP) и снижение чувствительности Ca2+ к сократительному механизму VSMC. В этом исследовании мы фокусируемся на вазорелаксации, вызванной открытием различных каналов K+, блокадой ЛОСЦ и ингибированием высвобождения Ca2+ из саркоплазматического ретикулума7, что приводит к снижению внутриклеточных уровней Ca2+, тем самым уменьшая фосфорилирование легкой цепи миозина VSMC и связывание миозина или образование поперечных мостов, соответственно, в конечном итоге приводит к вазорелаксации.
Методика оценки измерений вазоконстрикции и вазорелаксации в изолированных IPA хорошо зарекомендовала себя для грызунов, но данные варьировались в зависимости от экспериментальных протоколов. В настоящем исследовании описан метод, используемый для оценки сосудистой реактивности препаратов IPA для крыс in vitro, которые были сделаны в отсутствие внешних факторов, модулирующих сосудистый ответ in vivo, таких как нервные сигналы, гормоны, цитокины, артериальное давление и т. Д.
Мы использовали несколько экспериментальных протоколов, используя растительный экстракт в качестве примера для изучения сосудистой реактивности IPA. Различные блокаторы (рисунок 1) использовали для идентификации механизмов эндотелий-зависимого и -независимого вазорелаксирования, индуцированного растительным экстрактом. Тем не менее, те же протоколы могут быть адаптированы для оценки сосудистых реакций МПА на любые препараты, экстракты или фитохимические вещества, используемые для лечения различных легочных патологий.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1,4-dithiothreitol (DTT)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D0632 
			CAS NO. 348-12-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-aminopyridine (4-AP)</td>
			<td>Aldrich Chemical</td>
			<td>A78403 
			CAS NO. 504-24-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetylcholine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A6625 
			CAS NO. 60-31-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Apamin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9459 
			CAS NO. 24345-16-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A2153 
			CAS NO. 9048-46-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium choride</td>
			<td>Ajax Finechem</td>
			<td>AJA960 
			CAS NO. 1707055184</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Charybdotoxin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C7802 
			CAS NO. 95751-30-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase type 1A</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C9891 
			CAS NO. 9001-12-1</td>
			<td>From Clostridium histolyticum</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D(+)-Glucose monohydrate</td>
			<td>Millipore Corporation</td>
			<td>K50876942 924 
			CAS NO. 14431-43-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D4540 
			CAS NO. 67-68-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylene glycol-bis (2-aminoethylether)-N,N,N&#8217;,N&#8217;-tetraacetic acid (EGTA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E3889 
			CAS NO. 67-42-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E9884 
			CAS NO. 60-00-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps 11 cm.</td>
			<td>Rustless Dumoxel</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps 14 cm.</td>
			<td>Rustless Dumoxel</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glibenclamide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G6039 
			CAS NO. 16673-34-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GraphPad Prism program</td>
			<td>Software version 5.0 (San Diego, CA, USA)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H3375 
			CAS NO. 7365-45-9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iberiotoxin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I5904 
			CAS NO. 1002546960</td>
			<td>recombinant from Mesobuthus tamulus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Indomethacin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I7378 
			CAS NO. 53-86-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Labchart Program</td>
			<td>Software version 7.0 (A.D. Instrument, Castle Hill, Australia).</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride</td>
			<td>Ajax Finechem</td>
			<td>296 
			CAS NO. 1506254995</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Male Wistar rats</td>
			<td>Nomura Siam International Co. Ltd., Bangkok, Thailand</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NG-nitro-L-arginine methyl ester (L-NAME)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>N5751 
			CAS NO. 51298-62-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nicardipine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>N7510 
			CAS NO. 54527-84-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Organ bath 15 mL.</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Specific order by the researchers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Papain</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4762 
			CAS NO. 9001-73-4</td>
			<td>FromPapaya Latex</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenal red</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5530 
			CAS NO. 34487-61-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenylephrine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P6126 
			CAS NO. 61-76-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>Kemaus</td>
			<td>KA383 
			CAS NO. 7447-40-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium dihydrogenphosphate</td>
			<td>Aldrich Chemical</td>
			<td>EC231-913-4 
			CAS NO. 7778-77-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>S+A2:E36odium chloride</td>
			<td>Kemaus</td>
			<td>KA465 
			CAS NO. 7647-14-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissors 11 cm.</td>
			<td>Spall Stainless</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissors 14 cm.</td>
			<td>Spall Stainless</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium bicarbonate</td>
			<td>Ajax Finechem</td>
			<td>475 
			CAS NO. 912466</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dihydrogenphosphate</td>
			<td>Aldrich Chemical</td>
			<td>33,198-8 
			CAS NO. 7558-80-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide</td>
			<td>Ajax Finechem</td>
			<td>482 
			CAS NO. 1506196602</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium thiopental</td>
			<td>Anesthal</td>
			<td>JPN3010002 
			CAS NO. 1C 314/47</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taurine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T0625 
			CAS NO. 107-35-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Waterbath WBU 45</td>
			<td>Memmert</td>
			<td>2766 
			CAS NO. -</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of intrapulmonary artery and smooth muscle cells to investigate vascular responses

Внутрилегочная артерия (IPA) и сосудистые гладкомышечные клетки (VSMC), выделенные из легких крыс, могут быть использованы для изучения основных механизмов сужения сосудов и вазорелаксации. После выделения IPA и VSMC характеристики сосудистых реакций при физиологических и патологических состояниях могут быть оценены при отсутствии внешних факторов, таких как нервные сигналы, гормоны, цитокины и т.д. Таким образом, IPA и VSMC служат отличными моделями для изучения сосудистой физиологии / патофизиологии, наряду с различными экспериментальными исследованиями, такими как модуляция фармакологическими агентами, электрофизиологический анализ, визуализация кальция и т. Д. Здесь мы использовали технику выделения IPA для исследования сосудистых реакций в органной ванне. Сегменты IPA были установлены на камере ванны органа через внутрипросветные провода и стимулировались различными фармакологическими средствами. Изменения сосудистого тонуса IPA (т.е. вазоконстрикция и вазорелаксация) регистрировались с помощью изометрического преобразователя силы и программного обеспечения для анализа физиологических данных. Мы внедрили несколько экспериментальных протоколов, которые могут быть адаптированы для исследования механизмов вазорелаксации/вазоконстрикции для изучения фармакологической активности фитохимических или синтетических препаратов. Протоколы также могут быть использованы для оценки роли лекарств в модуляции различных заболеваний, включая легочную артериальную гипертензию. Модель IPA позволяет исследовать кривую концентрация-реакция, которая имеет решающее значение при оценке фармакодинамических параметров лекарственных средств.

Протокол в настоящем исследовании разработан для определения оптимальных экспериментальных условий измерения физиологических явлений, наблюдаемых в сосудистых реакциях изолированных препаратов МПА. Пилотные эксперименты были проведены для описания потенциальных результатов, кот?...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Intrapulmonary Artery and Smooth Muscle Cells to Investigate Vascular Responses at JoVE.com

Isolation of Intrapulmonary Artery and Smooth Muscle Cells to Investigate Vascular Responses

Сосудистые реакции артериального легочного кровообращения могут быть изучены с использованием внутрилегочной артерии (IPA) и гладкомышечных клеток сосудов (VSMC). В настоящем исследовании подробно описывается изоляция IPA и протоколы, используемые для исследования вазорелаксации в ответ на физиологические стимулы.

Выделение внутрилегочной артерии и гладкомышечных клеток для исследования сосудистых реакций

The intrapulmonary artery (IPA) and vascular smooth muscle cells (VSMCs) isolated from rat lungs can be used to study the underlying mechanisms of ...

Это исследование описывает выделение внутрилегочной артерии крыс и клеток гладкой мускулатуры сосудов. Было использовано несколько экспериментальных протоколов, таких как использование техники органной ванны для исследования сосудистого ответа внутрилегочной артерии. Внутрилегочные артерии и гладкомышечные клетки сосудов являются отличными моделями для изучения сосудистой физиологии и патофизиологии.Адаптация этого метода может оценивать сосудистые реакции любых лекарств, экстрактов или фитохимических веществ. Установка изолированного внутрилегочного артериального кольца в органной ванне позволяет использовать изолированные внутрилегочные артерии для оценки роли препарата в модуляции различных заболеваний, включая легочную гипертензию. Экспериментальные протоколы технически осуществимы, но важные шаги сложны и необходимы для успеха, поэтому наличие визуальной демонстрации облегчает понимание и следование.Продемонстрировать процедуру будет Киттивут То-он, студент магистратуры по физиологии из лаборатории сердечно-сосудистых исследований, кафедры физиологии, факультета медицинских наук Университета Наресуан. Начните с разрезания одной доли легкого 11-сантиметровыми ножницами и размещения ее на девятисантиметровой чашке Петри медиальной стороной или корнем легкого, обращенным вверх. Наблюдайте и идентифицируйте выравнивание вены, бронхов и артерий сверху вниз.Разрезать бронх продольно ножницами. Затем используйте 11-сантиметровые щипцы, чтобы захватить кончик бронха. Аккуратно рассекните и удалите бронхи и вены из легкого.Используйте щипцы, чтобы схватить кончик внутрилегочной артерии и аккуратно рассекнуть ее из легочной ткани ножницами. Держите изолированную внутрилегочную артерию в холодном растворе Кребса до тех пор, пока не будет установлен органная ванна. После выделения внутрилегочной артерии продольно разрезают главную ветвь внутрилегочной артерии 11-сантиметровыми ножницами и разрезают на двухмиллиметровые полоски.Погружайте полоски внутрилегочной артерии в СД, затем инкубируйте полоски в течение одного часа при четырех градусах Цельсия в СД, содержащие один миллиграмм на миллилитр папаина, 0,04% BSA и 0,4 миллимолярного DTT. Затем инкубировать при 37 градусах Цельсия в течение 15 минут. Добавьте один миллиграмм на миллилитр коллагеназы типа IA в СД и снова инкубируйте при 37 градусах Цельсия в течение пяти минут.Переведите ткани в свежий СД и диспергируйте путем мягкой тритурации с помощью стеклянной пипетки Пастера. Продолжайте тритурацию до тех пор, пока изолированные клетки гладкой мускулатуры сосудов не станут видны в растворе для купания под микроскопом. Изолируйте внутрилегочную артерию, как было показано ранее, и разрежьте основную ветвь внутрилегочной артерии на кольца длиной около двух миллиметров.Прикрепите кольца внутрилегочной артерии в камерах органной ванны, нанизав их на две проволоки из нержавеющей стали диаметром 40 микрометров. Прикрепите провода из нержавеющей стали, установленные с внутрилегочными кольцами артерий, к изометрическим датчикам силы, подключенным к устройству сбора данных и компьютерной системе, установленной с подходящим физиологическим программным обеспечением для записи и анализа данных. Затем осторожно поднимите напряжение внутрилегочного кольца до одного грамма.Дайте сегментам сосуда уравновеситься в течение примерно 45 минут при напряжении покоя в один грамм. В течение периода уравновешивания убедитесь, что раствор Кребса регулярно меняется каждые 15 минут. После уравновешивания проверьте жизнеспособность сосудов, измерив их сужение сосудов до высококлеточного внеклеточного раствора калия.Оценить наличие или отсутствие эндотелия путем вычисления реакции релаксации на ацетилхолин в кольцах, предварительно связанных с ПЭ. Механически удалите эндотелий, осторожно протерев внутреннюю часть сосуда небольшой проволокой, чтобы вызвать денудацию. Затем уравновешивайте артериальные кольца за 30 минут до начала тестовых экспериментов. Исследуйте релаксирующий эффект растительного экстракта путем предварительного согласования внутрилегочных колец артерий с ПЭ. Затем осторожно добавьте от 0,1 до 1000 микрограммов на миллилитр растительного экстракта кумулятивно к неповрежденным кольцам эндотелия и кольцам с оголенью эндотелия, чтобы вызвать вазорелаксацию и получить зависимую от концентрации кривую ответа.Обеспечить, чтобы эффективный ДМСО, используемый в качестве растворителя, также оценивался аналогичным образом, чтобы служить отрицательным контролем. Оценить вазорелаксантный механизм действия растительного экстракта, как указано в тексте рукописи. Затем после того, как схватки стабилизируют ПЭ, добавляют кумулятивные концентрации растительного экстракта.Представить эффекты растительного экстракта в виде процентного расслабления внутрилегочных колец артерии в присутствии ингибиторов по сравнению с ответом внутрилегочных колец без ингибиторов и построить кривую реакции концентрации. В интактной внутрилегочной артерии эндотелия растительный экстракт вызывал концентрационно-зависимый ответ вазорелаксации. Эрадикация эндотелия глубоко уменьшала вазорелаксацию, вызванную растительным экстрактом, что отражалось в увеличении EC50 в 2,2 раза, ингибирование eNOS и EDHF, очевидно, уменьшало реакцию вазорелаксанта на растительный экстракт.Это сместило кривую реакции концентрации вправо и увеличило EC50 без изменения максимальных значений E. Напротив, Индометацин не показал никакого влияния на реакцию вазорелаксанта на растительный экстракт. В эндотелийно-оголенных внутрилегочных кольцах артерий блокаторы калиевых каналов, активированные кальцием, уменьшали вазорелаксантную реакцию на растительный экстракт.В то время как блокаторы силовых или АТФ-чувствительных калиевых каналов не показали отклонений. Преинкубация растительным экстрактом ингибировала сокращение, вызванное хлористым кальцием. Кольца внутрилегочной артерии с эндотелием, предварительно инкубированные безкальцевым раствором Кребса и ПЭ, оказывали преходящее сокращение.По сравнению с транспортным средством, растительные экстракты значительно уменьшали сокращение, вызванное ПЭ. Во время процедуры необходимо четко определить вену, бронхи и артерии на ранней стадии. Разрезание или повреждение артерии уменьшит ее длину и повлияет на сосудистые реакции. Этот метод может быть адаптирован для исследования соединений, которые могут служить прототипами для лечения заболеваний легочных сосудов, таких как легочная артериальная гипертензия.

Research

JoVE Journal

Medicine

Mesenteric Artery Contraction and Relaxation Studies Using Automated Wire Myography

Брыжеечной артерии Сокращение и отдых Исследования с помощью автоматизированной миография провода

Proximal resistance vessels, such as the mesenteric arteries, contribute substantially to the peripheral resistance. These small vessels of between ...

Training a Sophisticated Microsurgical Technique: Interposition of External Jugular Vein Graft in the Common Carotid Artery in Rats

Обучение сложной технике микрохирургические: взаиморасположение наружной яремной вены трансплантата в общей сонной артерии у крыс

Neointimal hyperplasia is one the primary causes of stenosis in arterialized veins that are of great importance in arterial coronary bypass surgery, in ...

Assessment of Right Ventricular Structure and Function in Mouse Model of Pulmonary Artery Constriction by Transthoracic Echocardiography

Оценка правого желудочка структуры и функции в мышиной модели легочной артерии Сужение трансторакальной эхокардиографии

Emerging clinical data support the notion that RV dysfunction is critical to the pathogenesis of cardiovascular disease and heart failure1-3. Moreover, ...

Bladder Smooth Muscle Strip Contractility as a Method to Evaluate Lower Urinary Tract Pharmacology

Гладких мышц мочевого пузыря Газа Сократимость как метод оценки нижних мочевых путей фармакология

We describe an in vitro method to measure bladder smooth muscle contractility, and its use for investigating physiological and pharmacological properties ...

Embolic Middle Cerebral Artery Occlusion (MCAO) for Ischemic Stroke with Homologous Blood Clots in Rats

Embolic Middle Cerebral Artery Occlusion MCAO for Ischemic Stroke with Homologous Blood Clots in Rats

Эмболические средней мозговой артерии Окклюзия (MCAO) для ишемического инсульта с гомологичными сгустки крови у крыс

Clinically, thrombolytic therapy with use of recombinant tissue plasminogen activator (tPA) remains the most effective treatment for acute ischemic ...

Vascular Balloon Injury and Intraluminal Administration in Rat Carotid Artery

Сосудистая шар Травмы и в просвете администрации в Крыса сонной артерии

The carotid artery balloon injury model in rats has been well established for over two decades. It remains an important method to study the molecular and ...

Permanent Ligation of the Left Anterior Descending Coronary Artery in Mice: A Model of Post-myocardial Infarction Remodelling and Heart Failure

Постоянный Лигирование артерии передней нисходящей коронарной у мышей: Модель, перенесших инфаркт миокарда ремоделирования и сердечной недостаточности

Heart failure is a syndrome in which the heart fails to pump blood at a rate commensurate with cellular oxygen requirements at rest or during stress. It ...

Ultrasound Based Assessment of Coronary Artery Flow and Coronary Flow Reserve Using the Pressure Overload Model in Mice

Ультразвук оценки на основе коронарной артерии потока и коронарного кровотока заповедника Использование перегрузки Модель давления у мышей

Transthoracic Doppler echocardiography (TTDE) is a clinically useful, noninvasive tool for studying coronary artery flow velocity and coronary flow ...

Ferric Chloride-induced Thrombosis Mouse Model on Carotid Artery and Mesentery Vessel

Хлорного железа, вызванной Тромбоз мышь Модель на сонной артерии и брыжейки судна

Severe thrombosis and its ischemic consequences such as myocardial infarction, pulmonary embolism and stroke are major worldwide health issues. The ferric ...

Calcification of Vascular Smooth Muscle Cells and Imaging of Aortic Calcification and Inflammation

Обызвествление сосудистых гладких мышечных клеток и визуализации аортальной кальцификации и Воспаление

Cardiovascular disease is the leading cause of morbidity and mortality in the world.  Atherosclerotic plaques, consisting of lipid-laden macrophages and ...