Name: isolation of intrapulmonary artery and smooth muscle cells to investigate vascular responses
Uploaded: 2022-06-08T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Intrapulmonary Artery and Smooth Muscle Cells to Investigate Vascular Responses at JoVE.com

Los autores desean agradecer al Consejo Nacional de Investigación de Tailandia, al Centro de Excelencia para la Innovación en Química (PERCH-CIC) y a la Red Internacional de Investigación (IRN61W0005) por brindar apoyo financiero, y al Departamento de Fisiología de la Facultad de Ciencias Médicas de la Universidad de Naresuan, por el apoyo a las instalaciones de investigación.

Los experimentos realizados en este estudio fueron aprobados por el Comité de Ética del Comité de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Naresuan (NUACUC), número de protocolo NU-AE620921, para el cuidado y uso de animales con fines científicos.
1. Composición de las soluciones fisiológicas
<ol><li>Formular la solución de Krebs disolviendo productos químicos en agua destilada para alcanzar las concentraciones finales de la siguiente manera: 122 mM NaCl, 10 m...

<ol>
	<li>Lyle, M. A., Davis, J. P., Brozovich, F. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+pulmonary+vascular+smooth+muscle+contractility+in+pulmonary+arterial+hypertension:+Implications+for+therapy.">Regulation of pulmonary vascular smooth muscle contractility in pulmonary arterial hypertension: Implications for therapy.</a> Frontiers in Physiology. 8, 614 (2017).</li><li>Cyr, A. R., Huckaby, L. V., Shiva, S. S., Zuckerbraun, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nitric+oxide+and+endothelial+dysfunction.">Nitric oxide and endothelial dysfunction.</a> Critical Care Clinics. 36 (2), 307-321 (2020).</li><li>Ruan, K. -. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advance+in+understanding+the+biosynthesis+of+prostacyclin+and+thromboxane+A2+in+the+endoplasmic+reticulum+membrane+via+the+cyclo-oxygenase+pathway.">Advance in understanding the biosynthesis of prostacyclin and thromboxane A2 in the endoplasmic reticulum membrane via the cyclo-oxygenase pathway.</a> Mini Reviews in Medicinal Chemistry. 4 (6), 639-647 (2004).</li><li>Del Pozo, R., Hernandez Gonzalez, I., Escribano-Subias, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+prostacyclin+pathway+in+pulmonary+arterial+hypertension:+A+clinical+review.">The prostacyclin pathway in pulmonary arterial hypertension: A clinical review.</a> Expert Review of Respiratory Medicine. 11 (6), 491-503 (2017).</li><li>Morgado, M., Cairr&#227;o, E., Santos-Silva, A. J., Verde, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cyclic+nucleotide-dependent+relaxation+pathways+in+vascular+smooth+muscle.">Cyclic nucleotide-dependent relaxation pathways in vascular smooth muscle.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 69 (2), 247-266 (2012).</li><li>Schmidt, K., de Wit, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelium-derived+hyperpolarizing+factor+and+myoendothelial+coupling:+The+in+vivo+perspective.">Endothelium-derived hyperpolarizing factor and myoendothelial coupling: The in vivo perspective.</a> Frontiers in Physiology. 11, (2020).</li><li>Fan, G., Cui, Y., Gollasch, M., Kassmann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elementary+calcium+signaling+in+arterial+smooth+muscle.">Elementary calcium signaling in arterial smooth muscle.</a> Channels. 13 (1), 505-519 (2019).</li><li>Wisutthathum, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extract+of+Aquilaria+crassna+leaves+and+mangiferin+are+vasodilators+while+showing+no+cytotoxicity.">Extract of Aquilaria crassna leaves and mangiferin are vasodilators while showing no cytotoxicity.</a> Journal of Traditional and Complementary Medicine. 9 (4), 237-242 (2019).</li><li>Kamkaew, N., Paracha, T. U., Ingkaninan, K., Waranuch, N., Chootip, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vasodilatory+effects+and+mechanisms+of+action+of+Bacopa+monnieri+active+compounds+on+rat+mesenteric+arteries.">Vasodilatory effects and mechanisms of action of Bacopa monnieri active compounds on rat mesenteric arteries.</a> Molecules. 24 (12), 2243 (2019).</li><li>Chootip, K., Kennedy, C., Gurney, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+P2+receptors+mediating+contraction+of+the+rat+isolated+pulmonary+vasculature.">Characterization of P2 receptors mediating contraction of the rat isolated pulmonary vasculature.</a> British Journal of Pharmacology. 131, 167 (2000).</li><li>Paracha, T. U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elucidation+of+vasodilation+response+and+structure+activity+relationships+of+N2,+N4-disubstituted+quinazoline+2,+4-diamines+in+a+rat+pulmonary+artery+model.">Elucidation of vasodilation response and structure activity relationships of N2, N4-disubstituted quinazoline 2, 4-diamines in a rat pulmonary artery model.</a> Molecules. 24 (2), 281 (2019).</li><li>Chootip, K., Gurney, A. M., Kennedy, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+P2Y+receptors+couple+to+calcium-dependent,+chloride+channels+in+smooth+muscle+cells+of+the+rat+pulmonary+artery.">Multiple P2Y receptors couple to calcium-dependent, chloride channels in smooth muscle cells of the rat pulmonary artery.</a> Respiratory Research. 6 (1), 1-10 (2005).</li><li>Wisutthathum, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Eulophia+macrobulbon+extract+relaxes+rat+isolated+pulmonary+artery+and+protects+against+monocrotaline-induced+pulmonary+arterial+hypertension.">Eulophia macrobulbon extract relaxes rat isolated pulmonary artery and protects against monocrotaline-induced pulmonary arterial hypertension.</a> Phytomedicine. 50, 157-165 (2018).</li><li>Kruangtip, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Curcumin+analogues+inhibit+phosphodiesterase-5+and+dilate+rat+pulmonary+arteries.">Curcumin analogues inhibit phosphodiesterase-5 and dilate rat pulmonary arteries.</a> Journal of Pharmacy and Pharmacology. 67 (1), 87-95 (2015).</li></ol>

En este manuscrito, describimos la técnica para el aislamiento de IPA de rata y VSMCs. Se han empleado varios protocolos experimentales para investigar la respuesta vascular de IPA in vitro, que se pueden utilizar para caracterizar el efecto farmacológico y las bases mecanicistas de la vasorelajación de IPA inducida por extracto de planta.
En cuanto a la acción vasodilatadora dependiente del endotelio del extracto vegetal, se emplearon varios bloqueadores como L-NAME (eNOS), indom...

La vasculatura pulmonar es un sistema vascular de baja presión en el que la función principal es suministrar sangre desoxigenada al área de intercambio de gases de los pulmones. Las arterias pulmonares en los pulmones están dispuestas en ramas paralelas al árbol bronquial, formando finalmente una extensa red de capilares que es continua sobre varios alvéolos y, finalmente, uniéndose en vénulas y venas. El tono vascular de la arteria pulmonar está controlado por varios factores, que involucran la interacción entre el endotelio y las células del músculo liso vascular (CMV)1.
En este estudio, nos centramos en la vasorelajación dependiente e independiente del endotelio de la arteria intrapulmonar (IPA). Con respecto a la vasorelajación dependiente del endotelio, varios mecanismos que ocurren en la superficie de las células endoteliales podrían aumentar la concentración intracelular de Ca2+ (por ejemplo, la acetilcolina [ACh] se une con el receptor muscarínico [M3]), lo que lleva a la formación de óxido nítrico (NO), prostaciclina (PGl2) y factor hiperpolarizante derivado del endotelio (EDHF) (Figura 1 ). El NO es el principal factor relajante derivado del endotelio sintetizado a partir de la L-arginina por la óxido nítrico sintasa endotelial (eNOS)2, que luego se disocia de las células endoteliales a los VSMC (Figura 1) y estimula la enzima guanilil ciclasa soluble (sGC); esta enzima cambia el trifosfato de guanosina (GTP) en monofosfato de guanosina cíclico (GMPc), que activa la proteína quinasa G (PKG) y reduce los niveles citosólicos de Ca2+, causando así vasorelajación (Figura 1). PGl2 es sintetizado por las células endoteliales a través de la vía de la ciclooxigenasa (COX) 3,4. Se une con el receptor de prostaciclina (IP) en los VSMC y estimula la enzima adenilil ciclasa (AC), que luego convierte el trifosfato de adenosina (ATP) en monofosfato de adenosina cíclico (cAMP) (Figura 1)3,4. El AMPc activa la proteína quinasa A (PKA), reduciendo los niveles citosólicos deCa2+ y provocando vasorelajación5 (Figura 1). La vía EDHF también participa en la vasorelajación dependiente del endotelio a través de varios mediadores endoteliales y eventos eléctricos. La activación de la vía EDHF conduce a la hiperpolarización de los VSMC, cerrando así los canales de Ca 2+ operados por voltaje (VOCC), reduciendo los niveles intracelulares de Ca 2+ e induciendo vasorelajación 6. La vasorelajación independiente del endotelio ocurre directamente en los VSMC a través de varios mecanismos, como la reducción del nivel intracelular de Ca 2+, la inhibición de la quinasa de cadena ligera de miosina (MLCK), la activación de la fosfatasa de cadena ligera de miosina (MLCP) y la reducción de la sensibilidad de Ca2+ a la maquinaria contráctil de los VSMC. En este estudio, nos centramos en la vasorelajación causada por la apertura de varios canales K +, el bloqueo de VOCC y la inhibición de la liberación de Ca 2+ del retículo sarcoplásmico7, lo que conduce a la reducción de los niveles intracelulares de Ca2+, disminuyendo así la fosforilación de la cadena ligera de miosina VSMC y la unión miosina-actina o la formación de puentes cruzados, respectivamente, en última instancia, resultando en vasorelajación.
La técnica para evaluar las mediciones de vasoconstricción y vasorelajación en IPA aislada está bien establecida para roedores, pero los datos variaron dependiendo de los protocolos experimentales. El presente estudio describe el método utilizado para evaluar las reactividades vasculares de preparaciones de IPA de rata in vitro, que se realizaron en ausencia de factores externos que modulan la respuesta vascular in vivo, como señales nerviosas, hormonas, citoquinas, presión arterial, etc.
Empleamos varios protocolos experimentales utilizando el extracto de la planta como ejemplo para estudiar las reactividades vasculares de IPA. Se utilizaron varios bloqueantes (Figura 1) para identificar los mecanismos de vasorelajación dependiente e independiente del endotelio inducidos por el extracto de la planta. Sin embargo, los mismos protocolos se pueden adaptar para evaluar las respuestas vasculares de IPA a cualquier fármaco, extracto o fitoquímico utilizado para el tratamiento de diversas patologías pulmonares.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1,4-dithiothreitol (DTT)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D0632 
			CAS NO. 348-12-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-aminopyridine (4-AP)</td>
			<td>Aldrich Chemical</td>
			<td>A78403 
			CAS NO. 504-24-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetylcholine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A6625 
			CAS NO. 60-31-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Apamin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9459 
			CAS NO. 24345-16-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A2153 
			CAS NO. 9048-46-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium choride</td>
			<td>Ajax Finechem</td>
			<td>AJA960 
			CAS NO. 1707055184</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Charybdotoxin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C7802 
			CAS NO. 95751-30-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase type 1A</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C9891 
			CAS NO. 9001-12-1</td>
			<td>From Clostridium histolyticum</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D(+)-Glucose monohydrate</td>
			<td>Millipore Corporation</td>
			<td>K50876942 924 
			CAS NO. 14431-43-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D4540 
			CAS NO. 67-68-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylene glycol-bis (2-aminoethylether)-N,N,N&#8217;,N&#8217;-tetraacetic acid (EGTA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E3889 
			CAS NO. 67-42-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E9884 
			CAS NO. 60-00-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps 11 cm.</td>
			<td>Rustless Dumoxel</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps 14 cm.</td>
			<td>Rustless Dumoxel</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glibenclamide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G6039 
			CAS NO. 16673-34-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GraphPad Prism program</td>
			<td>Software version 5.0 (San Diego, CA, USA)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H3375 
			CAS NO. 7365-45-9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iberiotoxin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I5904 
			CAS NO. 1002546960</td>
			<td>recombinant from Mesobuthus tamulus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Indomethacin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I7378 
			CAS NO. 53-86-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Labchart Program</td>
			<td>Software version 7.0 (A.D. Instrument, Castle Hill, Australia).</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride</td>
			<td>Ajax Finechem</td>
			<td>296 
			CAS NO. 1506254995</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Male Wistar rats</td>
			<td>Nomura Siam International Co. Ltd., Bangkok, Thailand</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NG-nitro-L-arginine methyl ester (L-NAME)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>N5751 
			CAS NO. 51298-62-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nicardipine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>N7510 
			CAS NO. 54527-84-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Organ bath 15 mL.</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Specific order by the researchers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Papain</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4762 
			CAS NO. 9001-73-4</td>
			<td>FromPapaya Latex</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenal red</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5530 
			CAS NO. 34487-61-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenylephrine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P6126 
			CAS NO. 61-76-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>Kemaus</td>
			<td>KA383 
			CAS NO. 7447-40-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium dihydrogenphosphate</td>
			<td>Aldrich Chemical</td>
			<td>EC231-913-4 
			CAS NO. 7778-77-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>S+A2:E36odium chloride</td>
			<td>Kemaus</td>
			<td>KA465 
			CAS NO. 7647-14-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissors 11 cm.</td>
			<td>Spall Stainless</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissors 14 cm.</td>
			<td>Spall Stainless</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium bicarbonate</td>
			<td>Ajax Finechem</td>
			<td>475 
			CAS NO. 912466</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dihydrogenphosphate</td>
			<td>Aldrich Chemical</td>
			<td>33,198-8 
			CAS NO. 7558-80-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide</td>
			<td>Ajax Finechem</td>
			<td>482 
			CAS NO. 1506196602</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium thiopental</td>
			<td>Anesthal</td>
			<td>JPN3010002 
			CAS NO. 1C 314/47</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taurine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T0625 
			CAS NO. 107-35-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Waterbath WBU 45</td>
			<td>Memmert</td>
			<td>2766 
			CAS NO. -</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of intrapulmonary artery and smooth muscle cells to investigate vascular responses

La arteria intrapulmonar (IPA) y las células del músculo liso vascular (VSMC) aisladas de pulmones de rata se pueden usar para estudiar los mecanismos subyacentes de vasoconstricción y vasorelajación. Después de aislar el IPA y VSMCs, las características de las respuestas vasculares en condiciones fisiológicas y patológicas pueden evaluarse en ausencia de factores extrínsecos como señales nerviosas, hormonas, citoquinas, etc. Por lo tanto, el IPA y los VSMC sirven como excelentes modelos para estudiar la fisiología / fisiopatología vascular, junto con diversas investigaciones experimentales, como la modulación por agentes farmacológicos, el análisis electrofisiológico de patch-clamp, las imágenes de calcio, etc. Aquí, hemos utilizado una técnica para aislar el IPA para investigar las respuestas vasculares en una configuración de baño de órganos. Los segmentos de IPA se montaron en la cámara de baño del órgano a través de cables intraluminales y fueron estimulados por diversos agentes farmacológicos. Los cambios en el tono vascular IPA (es decir, vasoconstricción y vasorelajación), se registraron utilizando un transductor de fuerza isométrica y un programa de software de análisis de datos fisiológicos. Implementamos varios protocolos experimentales, que pueden adaptarse para investigar los mecanismos de vasorelajación/vasoconstricción para estudiar las actividades farmacológicas de fármacos fitoquímicos o sintéticos. Los protocolos también se pueden utilizar para evaluar el papel de los fármacos en la modulación de diversas enfermedades, incluida la hipertensión arterial pulmonar. El modelo IPA nos permite investigar la curva concentración-respuesta, que es crucial para evaluar los parámetros farmacodinámicos de los fármacos.

El protocolo en el presente estudio ha sido desarrollado para determinar las condiciones experimentales óptimas para medir los fenómenos fisiológicos observados en las respuestas vasculares de preparaciones aisladas de IPA. Los experimentos piloto se realizaron para describir los resultados potenciales que ayudan a la comprensión de los efectos vasculares y la base mecanicista de la acción vasorelajante del extracto de la planta, de la siguiente manera.
Efecto vasorelajante del ex...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Intrapulmonary Artery and Smooth Muscle Cells to Investigate Vascular Responses at JoVE.com

Isolation of Intrapulmonary Artery and Smooth Muscle Cells to Investigate Vascular Responses

Las respuestas vasculares de la circulación pulmonar arterial se pueden explorar utilizando la arteria intrapulmonar (IPA) y las células del músculo liso vascular (VSMC). El presente estudio describe el aislamiento de IPA en detalle y los protocolos utilizados para investigar la vasorelajación en respuesta a estímulos fisiológicos.

Aislamiento de la arteria intrapulmonar y las células del músculo liso para investigar las respuestas vasculares

The intrapulmonary artery (IPA) and vascular smooth muscle cells (VSMCs) isolated from rat lungs can be used to study the underlying mechanisms of ...

Este estudio describe el aislamiento de la arteria intrapulmonar de rata y las células del músculo liso vascular. Se emplearon varios protocolos experimentales, como el uso de la técnica de baño de órganos para investigar la respuesta vascular de la arteria intrapulmonar. Las arterias intrapulmonares y las células del músculo liso vascular son excelentes modelos para estudiar la fisiología vascular y la fisiopatología.Las adaptaciones de esta técnica podrían evaluar las respuestas vasculares de cualquier fármaco, extracto o fitoquímicos. El montaje del anillo arterial intrapulmonar aislado en un baño de órganos permite el uso de arterias intrapulmonares aisladas para evaluar el papel de un fármaco en la modulación de diversas enfermedades, incluida la hipertensión pulmonar. Los protocolos experimentales son técnicamente factibles, pero los pasos cruciales son complicados y esenciales para el éxito, por lo que tener una demostración visual hace que sea más fácil de entender y seguir.Demostrando el procedimiento estará Kittiwoot To-on, un estudiante de maestría en fisiología del Laboratorio de la Unidad de Investigación Cardiovascular, Departamento de Fisiología, Facultad de Ciencias Médicas, Universidad de Naresuan. Comience cortando un solo lóbulo del pulmón con tijeras de 11 centímetros y colocándolo en una placa de Petri de nueve centímetros con el lado medial, o raíz del pulmón, hacia arriba. Observe e identifique la alineación de la vena, los bronquios y la arteria de arriba a abajo.Abra el bronquio longitudinalmente con tijeras. Luego use las pinzas de 11 centímetros para agarrar la punta del bronquio. Diseccionar suavemente y extraer el bronquio y las venas del pulmón.Use los fórceps para agarrar la punta de la arteria intrapulmonar y diseccionarla cuidadosamente del tejido pulmonar con tijeras. Mantenga la arteria intrapulmonar aislada en una solución fría de Krebs hasta que se configure el conjunto del baño de órganos. Después de aislar la arteria intrapulmonar, abra la rama principal de la arteria intrapulmonar longitudinalmente con las tijeras de 11 centímetros y córtela en tiras de dos milímetros.Sumerja las tiras de la arteria intrapulmonar en DM, luego incube las tiras durante una hora a cuatro grados Celsius en DM que contienen un miligramo por mililitro de papaína, 0.04% BSA y 0.4 milimolar DTT. Luego incubar a 37 grados centígrados durante 15 minutos. Agregue un miligramo por mililitro de colagenasa tipo IA en DM, y nuevamente incube a 37 grados centígrados durante cinco minutos.Transfiera los tejidos a MS fresca y disperse mediante una trituración suave con una pipeta de vidrio Pasteur. Siga triturando hasta que las células aisladas del músculo liso vascular se hagan visibles en la solución de baño bajo el microscopio. Aislar la arteria intrapulmonar como se demostró anteriormente y cortar la rama principal de la arteria intrapulmonar en anillos de aproximadamente dos milímetros de longitud.Fije los anillos de la arteria intrapulmonar en las cámaras de baño de órganos enroscándolos en dos cables de acero inoxidable de 40 micrómetros de diámetro. Acople cables de acero inoxidable montados con anillos arteriales intrapulmonares a los transductores de fuerza isométrica conectados al dispositivo de adquisición de datos y al sistema informático instalado con el software fisiológico adecuado para el registro y análisis de datos. Luego eleve suavemente la tensión del anillo de la arteria intrapulmonar a un gramo.Deje que los segmentos del vaso se equilibren durante unos 45 minutos a una tensión en reposo de un gramo. Durante el período de equilibrio, asegúrese de que la solución de Krebs se cambie regularmente cada 15 minutos. Después del equilibrio, pruebe la viabilidad de los vasos midiendo su vasoconstricción a una solución de potasio extracelular alta.Evaluar la presencia o ausencia de endotelio calculando la respuesta de relajación a la acetilcolina en anillos precontraídos con EP. Retire mecánicamente el endotelio frotando suavemente el interior del vaso con un pequeño alambre para inducir la denudación. Luego equilibre los anillos arteriales durante 30 minutos antes del inicio de los experimentos de prueba. Investigue el efecto relajante del extracto de la planta precontrayendo anillos de arteria intrapulmonar con EP. Luego, agregue cuidadosamente de 0.1 a 1000 microgramos por mililitros del extracto de la planta acumulativamente a los anillos intactos del endotelio y los anillos desnudos del endotelio para inducir la vasorelajación y adquirir una curva de respuesta dependiente de la concentración.Asegúrese de que el DMSO efectivo utilizado como solvente también se evalúe de manera similar para servir como control negativo. Evaluar el mecanismo de acción vasorelajante del extracto de la planta como se menciona en el texto manuscrito. Luego, después de que las contracciones a PE se estabilicen, agregue concentraciones acumulativas del extracto de la planta.Presentar los efectos del extracto vegetal como porcentaje de relajación de los anillos de la arteria intrapulmonar en presencia de inhibidores en comparación con la respuesta de los anillos de la arteria intrapulmonar sin inhibidores y construir la curva de respuesta a la concentración. En la arteria intrapulmonar intacta del endotelio, el extracto de la planta provocó una respuesta de vasorelajación dependiente de la concentración. La erradicación del endotelio redujo profundamente la vasorelajación inducida por el extracto de la planta como se refleja en el aumento de la CE50 en 2,2 veces, la inhibición de eNOS y EDHF evidentemente disminuyó la respuesta vasorelajante al extracto de la planta.Esto desplazó la curva de respuesta de concentración hacia la derecha y aumentó el EC50 sin alterar los valores de E max. Por el contrario, la indometacina no mostró ningún efecto sobre la respuesta vasorelajante al extracto de la planta. En los anillos de la arteria intrapulmonar desnudos por endotelio, los bloqueadores de los canales de potasio activados por calcio disminuyeron la respuesta vasorelajante al extracto de la planta.Mientras que los bloqueadores de los canales de potasio dependientes de voltaje o sensibles al ATP no mostraron desviación. La preincubación con el extracto de la planta inhibió la contracción inducida por cloruro de calcio. Los anillos de las arterias intrapulmonares desnudos de endotelio preincubados con solución de Krebs sin calcio y EP produjeron una contracción transitoria.En comparación con el vehículo, los extractos de plantas redujeron significativamente la contracción inducida por la EP. Durante el procedimiento, uno debe identificar claramente la vena, los bronquios y la arteria desde el principio. Cortar o dañar la arteria reducirá su longitud y afectará las respuestas vasculares. Esta técnica se puede adaptar para investigar compuestos que puedan servir como prototipos para tratamientos de enfermedades vasculares pulmonares como la hipertensión arterial pulmonar.

Research

JoVE Journal

Medicine

Mesenteric Artery Contraction and Relaxation Studies Using Automated Wire Myography

Contracción de la arteria mesentérica y Estudios de relajación con miografía cable automático

Proximal resistance vessels, such as the mesenteric arteries, contribute substantially to the peripheral resistance. These small vessels of between ...

Investigación

Medicina

Training a Sophisticated Microsurgical Technique: Interposition of External Jugular Vein Graft in the Common Carotid Artery in Rats

La formación de una sofisticada técnica de microcirugía: La interposición de injerto de la vena yugular externa en la arteria carótida común en ratas

Neointimal hyperplasia is one the primary causes of stenosis in arterialized veins that are of great importance in arterial coronary bypass surgery, in ...

Assessment of Right Ventricular Structure and Function in Mouse Model of Pulmonary Artery Constriction by Transthoracic Echocardiography

Evaluación del ventrículo derecho Estructura y función en modelo de ratón de la constricción de la arteria pulmonar mediante ecocardiografía transtorácica

Emerging clinical data support the notion that RV dysfunction is critical to the pathogenesis of cardiovascular disease and heart failure1-3. Moreover, ...

Bladder Smooth Muscle Strip Contractility as a Method to Evaluate Lower Urinary Tract Pharmacology

Vejiga contractilidad del músculo liso de Gaza como un método para evaluar tracto urinario inferior Farmacología

We describe an in vitro method to measure bladder smooth muscle contractility, and its use for investigating physiological and pharmacological properties ...

Embolic Middle Cerebral Artery Occlusion (MCAO) for Ischemic Stroke with Homologous Blood Clots in Rats

Embolic Middle Cerebral Artery Occlusion MCAO for Ischemic Stroke with Homologous Blood Clots in Rats

Arteria embólico cerebral media oclusión (MCAO) para el ictus isquémico con homólogas coágulos de sangre en las ratas

Clinically, thrombolytic therapy with use of recombinant tissue plasminogen activator (tPA) remains the most effective treatment for acute ischemic ...

Vascular Balloon Injury and Intraluminal Administration in Rat Carotid Artery

Lesión Vascular Globo y Administración intraluminal en rata arteria carótida

The carotid artery balloon injury model in rats has been well established for over two decades. It remains an important method to study the molecular and ...

Permanent Ligation of the Left Anterior Descending Coronary Artery in Mice: A Model of Post-myocardial Infarction Remodelling and Heart Failure

La ligadura permanente de la arteria coronaria descendente anterior en ratones: un modelo de remodelación post infarto de miocardio e insuficiencia cardiaca

Heart failure is a syndrome in which the heart fails to pump blood at a rate commensurate with cellular oxygen requirements at rest or during stress. It ...

Ultrasound Based Assessment of Coronary Artery Flow and Coronary Flow Reserve Using the Pressure Overload Model in Mice

Evaluación Ultrasonido base de la arteria coronaria de flujo y la reserva coronaria Utilizando la sobrecarga Modelo Presión en ratones

Transthoracic Doppler echocardiography (TTDE) is a clinically useful, noninvasive tool for studying coronary artery flow velocity and coronary flow ...

Ferric Chloride-induced Thrombosis Mouse Model on Carotid Artery and Mesentery Vessel

Trombosis modelo de ratón de la arteria carótida y Mesenterio Embarcaciones inducida por cloruro férrico-

Severe thrombosis and its ischemic consequences such as myocardial infarction, pulmonary embolism and stroke are major worldwide health issues. The ferric ...

Calcification of Vascular Smooth Muscle Cells and Imaging of Aortic Calcification and Inflammation

Calcificación de células del músculo liso y de imagen de la calcificación aórtica y la inflamación

Cardiovascular disease is the leading cause of morbidity and mortality in the world.  Atherosclerotic plaques, consisting of lipid-laden macrophages and ...