Name: isolation of intrapulmonary artery and smooth muscle cells to investigate vascular responses
Uploaded: 2022-06-08T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Intrapulmonary Artery and Smooth Muscle Cells to Investigate Vascular Responses at JoVE.com

Författarna vill erkänna National Research Council of Thailand, Center of Excellence for Innovation in Chemistry (PERCH-CIC) och International Research Network (IRN61W0005) för att ge ekonomiskt stöd, och Institutionen för fysiologi fakulteten för medicinsk vetenskap, Naresuan University, för stöd till forskningsanläggningar.

Experimenten som utfördes i denna studie godkändes av etikkommittén för Naresuan University Animal Care and Use Committee (NUACUC), protokollnummer NU-AE620921, för vård och användning av djur för vetenskapliga ändamål.
1. Sammansättning av fysiologiska lösningar
<ol><li>Formulera Krebs-lösning genom att lösa kemikalier i destillerat vatten för att uppnå de slutliga koncentrationerna enligt följande: 122 mM NaCl, 10 mM HEPES, 5 mM KCl, 0,5 mM KH 2 PO 4, 0,5 ...

<ol>
	<li>Lyle, M. A., Davis, J. P., Brozovich, F. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+pulmonary+vascular+smooth+muscle+contractility+in+pulmonary+arterial+hypertension:+Implications+for+therapy.">Regulation of pulmonary vascular smooth muscle contractility in pulmonary arterial hypertension: Implications for therapy.</a> Frontiers in Physiology. 8, 614 (2017).</li><li>Cyr, A. R., Huckaby, L. V., Shiva, S. S., Zuckerbraun, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nitric+oxide+and+endothelial+dysfunction.">Nitric oxide and endothelial dysfunction.</a> Critical Care Clinics. 36 (2), 307-321 (2020).</li><li>Ruan, K. -. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advance+in+understanding+the+biosynthesis+of+prostacyclin+and+thromboxane+A2+in+the+endoplasmic+reticulum+membrane+via+the+cyclo-oxygenase+pathway.">Advance in understanding the biosynthesis of prostacyclin and thromboxane A2 in the endoplasmic reticulum membrane via the cyclo-oxygenase pathway.</a> Mini Reviews in Medicinal Chemistry. 4 (6), 639-647 (2004).</li><li>Del Pozo, R., Hernandez Gonzalez, I., Escribano-Subias, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+prostacyclin+pathway+in+pulmonary+arterial+hypertension:+A+clinical+review.">The prostacyclin pathway in pulmonary arterial hypertension: A clinical review.</a> Expert Review of Respiratory Medicine. 11 (6), 491-503 (2017).</li><li>Morgado, M., Cairr&#227;o, E., Santos-Silva, A. J., Verde, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cyclic+nucleotide-dependent+relaxation+pathways+in+vascular+smooth+muscle.">Cyclic nucleotide-dependent relaxation pathways in vascular smooth muscle.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 69 (2), 247-266 (2012).</li><li>Schmidt, K., de Wit, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelium-derived+hyperpolarizing+factor+and+myoendothelial+coupling:+The+in+vivo+perspective.">Endothelium-derived hyperpolarizing factor and myoendothelial coupling: The in vivo perspective.</a> Frontiers in Physiology. 11, (2020).</li><li>Fan, G., Cui, Y., Gollasch, M., Kassmann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elementary+calcium+signaling+in+arterial+smooth+muscle.">Elementary calcium signaling in arterial smooth muscle.</a> Channels. 13 (1), 505-519 (2019).</li><li>Wisutthathum, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extract+of+Aquilaria+crassna+leaves+and+mangiferin+are+vasodilators+while+showing+no+cytotoxicity.">Extract of Aquilaria crassna leaves and mangiferin are vasodilators while showing no cytotoxicity.</a> Journal of Traditional and Complementary Medicine. 9 (4), 237-242 (2019).</li><li>Kamkaew, N., Paracha, T. U., Ingkaninan, K., Waranuch, N., Chootip, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vasodilatory+effects+and+mechanisms+of+action+of+Bacopa+monnieri+active+compounds+on+rat+mesenteric+arteries.">Vasodilatory effects and mechanisms of action of Bacopa monnieri active compounds on rat mesenteric arteries.</a> Molecules. 24 (12), 2243 (2019).</li><li>Chootip, K., Kennedy, C., Gurney, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+P2+receptors+mediating+contraction+of+the+rat+isolated+pulmonary+vasculature.">Characterization of P2 receptors mediating contraction of the rat isolated pulmonary vasculature.</a> British Journal of Pharmacology. 131, 167 (2000).</li><li>Paracha, T. U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elucidation+of+vasodilation+response+and+structure+activity+relationships+of+N2,+N4-disubstituted+quinazoline+2,+4-diamines+in+a+rat+pulmonary+artery+model.">Elucidation of vasodilation response and structure activity relationships of N2, N4-disubstituted quinazoline 2, 4-diamines in a rat pulmonary artery model.</a> Molecules. 24 (2), 281 (2019).</li><li>Chootip, K., Gurney, A. M., Kennedy, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+P2Y+receptors+couple+to+calcium-dependent,+chloride+channels+in+smooth+muscle+cells+of+the+rat+pulmonary+artery.">Multiple P2Y receptors couple to calcium-dependent, chloride channels in smooth muscle cells of the rat pulmonary artery.</a> Respiratory Research. 6 (1), 1-10 (2005).</li><li>Wisutthathum, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Eulophia+macrobulbon+extract+relaxes+rat+isolated+pulmonary+artery+and+protects+against+monocrotaline-induced+pulmonary+arterial+hypertension.">Eulophia macrobulbon extract relaxes rat isolated pulmonary artery and protects against monocrotaline-induced pulmonary arterial hypertension.</a> Phytomedicine. 50, 157-165 (2018).</li><li>Kruangtip, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Curcumin+analogues+inhibit+phosphodiesterase-5+and+dilate+rat+pulmonary+arteries.">Curcumin analogues inhibit phosphodiesterase-5 and dilate rat pulmonary arteries.</a> Journal of Pharmacy and Pharmacology. 67 (1), 87-95 (2015).</li></ol>

I detta manuskript beskriver vi tekniken för isolering av råtta IPA och VSMCs. Flera experimentella protokoll har använts för att undersöka det vaskulära svaret av IPA in vitro, som kan användas för att karakterisera den farmakologiska effekten och den mekanistiska grunden för IPA-vasorelaxation inducerad av växtextrakt.
När det gäller endotelberoende vasodilator verkan av växtextraktet, olika blockerare såsom L-NAME (eNOS), indometacin (COX), och apamin+charybdotoxin (E...

Lungkärlen är ett lågtryckskärlsystem där huvudfunktionen är att leverera deoxygenerat blod till gasutbytesområdet i lungorna. Lungartärerna i lungorna är ordnade i grenar parallellt med bronkialträdet, vilket i slutändan bildar ett omfattande nätverk av kapillärer som är kontinuerliga över flera alveoler och slutligen kommer samman i venules och vener. Den vaskulära tonen i lungartären styrs av flera faktorer, som involverar interaktionen mellan endotel och vaskulära glattmuskelceller (VSMCs)1.
I denna studie fokuserar vi på endotelberoende och -oberoende vasorelaxation av den intrapulmonella artären (IPA). När det gäller endotelberoende vasorelaxation kan olika mekanismer som förekommer på ytan av endotelceller öka intracellulär Ca2+ koncentration (t.ex. acetylkolin [ACh] binder med muskarinreceptor [M3]), vilket leder till bildandet av kväveoxid (NO), prostacyklin (PGl 2) och endotel-härledd hyperpolariserande faktor (EDHF) (Figur 1 ). NO är den huvudsakliga endotel-härledda avslappnande faktorn syntetiserad från L-arginin av endotelialt kväveoxidsyntas (eNOS)2, som sedan dissocierar ut ur endotelcellerna till VSMC (Figur 1) och stimulerar det lösliga guanylylylcyklaset (sGC) enzymet; detta enzym förändrar guanosintrifosfat (GTP) till cykliskt guanosinmonofosfat (cGMP), vilket aktiverar proteinkinas G (PKG) och minskar cytosoliska Ca2+ -nivåer, vilket orsakar vasorelaxation (Figur 1). PGl2 syntetiseras av endotelceller via cyklo-oxygenas (COX) väg 3,4. Det binder till prostacyklinreceptorn (IP) på VSMC och stimulerar enzymet adenylylcyklas (AC), som sedan omvandlar adenosintrifosfat (ATP) till cykliskt adenosinmonofosfat (cAMP) (figur 1)3,4. cAMP aktiverar proteinkinas A (PKA), vilket minskar cytosoliska Ca2+ nivåer och orsakar vasorelaxation5 (figur 1). EDHF-vägen deltar också i endotelberoende vasorelaxation via olika endotelmediatorer och elektriska händelser. Aktiveringen av EDHF-vägen leder till hyperpolarisering av VSMCs, vilket stänger spänningsdrivna Ca 2+ -kanaler (VOCC), minskar intracellulära Ca 2+ -nivåer och inducerar vasorelaxation 6. Den endoteloberoende vasorelaxationen sker direkt på VSMC via flera mekanismer, såsom reduktionen av intracellulär Ca 2+ -nivå, hämningen av myosinljuskedjekinas (MLCK), aktiveringen av myosinljuskedjefosfatas (MLCP) och minskningen av Ca2+ känslighet för kontraktilmaskineriet hos VSMCs. I denna studie fokuserar vi på vasorelaxation orsakad av öppningen av olika K + -kanaler, blockaden av VOCC och hämningen av Ca 2+ frisättning från sarkoplasmatisk retikulum7, vilket leder till minskning av intracellulära Ca2+ nivåer, vilket minskar VSMC-myosinljuskedjefosforylering respektive myosin-aktinbindning eller korsbrobildning, vilket resulterar i vasorelaxation.
Tekniken för att utvärdera vasokonstriktions- och vasorelaxationsmätningar i isolerad IPA är väl etablerad för gnagare, men data varierade beroende på experimentella protokoll. Den aktuella studien beskriver metoden som används för att utvärdera de vaskulära reaktiviteterna hos råtta IPA-preparat in vitro, som gjordes i frånvaro av yttre faktorer som modulerar vaskulärt svar in vivo, såsom nervsignaler, hormoner, cytokiner, blodtryck etc.
Vi använde flera experimentella protokoll med växtextraktet som ett exempel för att studera de vaskulära reaktiviteterna hos IPA. Olika blockerare (figur 1) användes för att identifiera mekanismerna för endotelberoende och -oberoende vasorelaxation inducerad av växtextraktet. Ändå kan samma protokoll anpassas för att utvärdera IPA: s vaskulära svar på alla läkemedel, extrakt eller fytokemikalier som används för behandling av olika lungpatologier.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1,4-dithiothreitol (DTT)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D0632 
			CAS NO. 348-12-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-aminopyridine (4-AP)</td>
			<td>Aldrich Chemical</td>
			<td>A78403 
			CAS NO. 504-24-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetylcholine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A6625 
			CAS NO. 60-31-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Apamin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9459 
			CAS NO. 24345-16-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A2153 
			CAS NO. 9048-46-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium choride</td>
			<td>Ajax Finechem</td>
			<td>AJA960 
			CAS NO. 1707055184</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Charybdotoxin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C7802 
			CAS NO. 95751-30-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase type 1A</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C9891 
			CAS NO. 9001-12-1</td>
			<td>From Clostridium histolyticum</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D(+)-Glucose monohydrate</td>
			<td>Millipore Corporation</td>
			<td>K50876942 924 
			CAS NO. 14431-43-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D4540 
			CAS NO. 67-68-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylene glycol-bis (2-aminoethylether)-N,N,N&#8217;,N&#8217;-tetraacetic acid (EGTA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E3889 
			CAS NO. 67-42-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E9884 
			CAS NO. 60-00-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps 11 cm.</td>
			<td>Rustless Dumoxel</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps 14 cm.</td>
			<td>Rustless Dumoxel</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glibenclamide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G6039 
			CAS NO. 16673-34-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GraphPad Prism program</td>
			<td>Software version 5.0 (San Diego, CA, USA)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H3375 
			CAS NO. 7365-45-9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iberiotoxin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I5904 
			CAS NO. 1002546960</td>
			<td>recombinant from Mesobuthus tamulus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Indomethacin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I7378 
			CAS NO. 53-86-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Labchart Program</td>
			<td>Software version 7.0 (A.D. Instrument, Castle Hill, Australia).</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride</td>
			<td>Ajax Finechem</td>
			<td>296 
			CAS NO. 1506254995</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Male Wistar rats</td>
			<td>Nomura Siam International Co. Ltd., Bangkok, Thailand</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NG-nitro-L-arginine methyl ester (L-NAME)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>N5751 
			CAS NO. 51298-62-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nicardipine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>N7510 
			CAS NO. 54527-84-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Organ bath 15 mL.</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Specific order by the researchers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Papain</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4762 
			CAS NO. 9001-73-4</td>
			<td>FromPapaya Latex</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenal red</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5530 
			CAS NO. 34487-61-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenylephrine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P6126 
			CAS NO. 61-76-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>Kemaus</td>
			<td>KA383 
			CAS NO. 7447-40-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium dihydrogenphosphate</td>
			<td>Aldrich Chemical</td>
			<td>EC231-913-4 
			CAS NO. 7778-77-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>S+A2:E36odium chloride</td>
			<td>Kemaus</td>
			<td>KA465 
			CAS NO. 7647-14-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissors 11 cm.</td>
			<td>Spall Stainless</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissors 14 cm.</td>
			<td>Spall Stainless</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium bicarbonate</td>
			<td>Ajax Finechem</td>
			<td>475 
			CAS NO. 912466</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dihydrogenphosphate</td>
			<td>Aldrich Chemical</td>
			<td>33,198-8 
			CAS NO. 7558-80-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide</td>
			<td>Ajax Finechem</td>
			<td>482 
			CAS NO. 1506196602</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium thiopental</td>
			<td>Anesthal</td>
			<td>JPN3010002 
			CAS NO. 1C 314/47</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taurine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T0625 
			CAS NO. 107-35-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Waterbath WBU 45</td>
			<td>Memmert</td>
			<td>2766 
			CAS NO. -</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of intrapulmonary artery and smooth muscle cells to investigate vascular responses

Den intrapulmonella artären (IPA) och vaskulära glattmuskelceller (VSMCs) isolerade från råtta lungor kan användas för att studera de underliggande mekanismerna för vasokonstriktion och vasorelaxation. Efter isolering av IPA och VSMC kan egenskaperna hos vaskulära svar vid fysiologiska och patologiska tillstånd bedömas i frånvaro av yttre faktorer såsom nervsignaler, hormoner, cytokiner etc. Således fungerar IPA och VSMC som utmärkta modeller för att studera vaskulär fysiologi / patofysiologi, tillsammans med olika experimentella undersökningar, såsom modulering av farmakologiska medel, patch-clamp elektrofysiologisk analys, kalciumavbildning etc. Här har vi använt en teknik för att isolera IPA för att undersöka vaskulära svar i ett organbad. IPA-segment monterades på orgelbadkammaren via intraluminala ledningar och stimulerades av olika farmakologiska medel. Förändringarna i IPA-vaskulär ton (dvs. vasokonstriktion och vasorelaxation) registrerades med hjälp av en isometrisk kraftgivare och ett fysiologiskt dataanalysprogram. Vi implementerade flera experimentella protokoll, som kan anpassas för att undersöka mekanismerna för vasorelaxation / vasokonstriktion för att studera de farmakologiska aktiviteterna hos fytokemiska eller syntetiska droger. Protokollen kan också användas för att utvärdera läkemedels roller för att modulera olika sjukdomar, inklusive pulmonell arteriell hypertension. IPA-modellen gör det möjligt för oss att undersöka koncentrations-responskurvan, vilket är avgörande för att bedöma läkemedels farmakodynamiska parametrar.

Protokollet i denna studie har utvecklats för att bestämma de optimala experimentella betingelserna för att mäta fysiologiska fenomen som observerats i vaskulära svar från isolerade IPA-preparat. Pilotexperimenten utfördes för att beskriva de potentiella resultaten som hjälper till att förstå de vaskulära effekterna och den mekanistiska grunden för växtextraktets vasorelaxanta verkan, enligt följande.
Vasorelaxant effekt av växtextraktet Som visas i figur 6A...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Intrapulmonary Artery and Smooth Muscle Cells to Investigate Vascular Responses at JoVE.com

Isolation of Intrapulmonary Artery and Smooth Muscle Cells to Investigate Vascular Responses

Vaskulära svar på arteriell lungcirkulation kan utforskas med hjälp av intrapulmonell artär (IPA) och vaskulära glattmuskelceller (VSMCs). Den aktuella studien beskriver isoleringen av IPA i detalj och de protokoll som används för att undersöka vasorelaxation som svar på fysiologiska stimuli.

Isolering av intrapulmonell artär och glattmuskelceller för att undersöka vaskulära svar

The intrapulmonary artery (IPA) and vascular smooth muscle cells (VSMCs) isolated from rat lungs can be used to study the underlying mechanisms of ...

Denna studie beskriver isolering av råtta intrapulmonell artär och vaskulära glattmuskelceller. Flera experimentella protokoll användes, såsom att använda organbadtekniken för att undersöka vaskulärt svar från den intrapulmonala artären. Intrapulmonella artärer och vaskulära glattmuskelceller är utmärkta modeller för att studera vaskulär fysiologi och patofysiologi.Anpassningar av denna teknik kan utvärdera vaskulära svar av alla läkemedel, extrakt eller fytokemikalier. Montering av den isolerade intrapulmonala arteriella ringen i ett organbad möjliggör användning av isolerade intrapulmonella artärer för att utvärdera ett läkemedels roll i modulering av olika sjukdomar, inklusive lunghypertension. De experimentella protokollen är tekniskt genomförbara, men de avgörande stegen är komplicerade och viktiga för framgång, så att ha en visuell demonstration gör det lättare att förstå och följa.Att demonstrera proceduren kommer att vara Kittiwoot To-on, en magisterexamen i fysiologi från Cardiovascular Research Unit Laboratory, Institutionen för fysiologi, Fakulteten för medicinsk vetenskap, Naresuan University. Börja med att skära en enda lunglob med 11 centimeter sax och placera den på en nio centimeter petriskål med den mediala sidan, eller lungroten, vänd uppåt. Observera och identifiera inriktningen av venen, bronkierna och artären från topp till botten.Skär upp bronchus i längdriktningen med sax. Använd sedan 11 centimeter pincett för att ta tag i bronkusens spets. Dissekera försiktigt och ta bort bronkus och vener ur lungan.Använd pincetten för att ta tag i spetsen på den intrapulmonala artären och dissekera den försiktigt ur lungvävnaden med sax. Håll den isolerade intrapulmonala artären i kall Krebs-lösning tills orgelbadenheten är inställd. Efter isolering av den intrapulmonala artären, skär upp huvudgrenen av den intrapulmonala artären i längdriktningen med 11 centimeter saxen och skär i två millimeter remsor.Fördjupa de intrapulmonella artärremsorna i DM och inkubera sedan remsorna i en timme vid fyra grader Celsius i DM innehållande ett milligram per milliliter papain, 0,04% BSA och 0,4 millimolar DTT. Inkubera sedan vid 37 grader Celsius i 15 minuter. Tillsätt ett milligram per milliliter kollagenas typ IA i DM och inkubera igen vid 37 grader Celsius i fem minuter.Överför vävnaderna till färsk DM och sprid genom mild trituration med en pasteurpipett av glas. Fortsätt triturera tills isolerade vaskulära glattmuskelceller blir synliga i badlösningen under mikroskopet. Isolera intrapulmonell artär som visats tidigare och skär huvudgrenen i den intrapulmonala artären i ringar med ungefär två millimeter i längd.Fäst de intrapulmonella artärringarna i orgelbadkammare genom att gänga dem på två rostfria ståltrådar med en diameter på 40 mikrometer. Fäst ledningar av rostfritt stål monterade med intrapulmonella artärringar till de isometriska kraftgivarna som är anslutna till datainsamlingsanordningen och datorsystemet installerat med lämplig fysiologisk programvara för dataregistrering och analys. Höj sedan försiktigt spänningen i den intrapulmonala artärringen till ett gram.Låt kärlsegmenten balansera i cirka 45 minuter vid en vilospänning på ett gram. Under jämviktsperioden, se till att Krebs-lösningen regelbundet byts var 15: e minut. Efter jämvikt, testa kärlens livskraft genom att mäta deras vasokonstriktion till hög extracellulär kaliumlösning.Bedöm närvaron eller frånvaron av endotel genom att beräkna avslappningssvaret på acetylkolin i ringar som är förkontrakterade med PE. Ta bort endotelet mekaniskt genom att försiktigt gnugga insidan av kärlet med en liten tråd för att inducera denudation. Balansera sedan artärringarna i 30 minuter innan testexperimenten börjar. Undersök den avslappnande effekten av växtextraktet genom att prekontraktera intrapulmonella artärringar med PE. Tillsätt sedan försiktigt 0,1 till 1000 mikrogram per milliliter av växtextraktet kumulativt till endotel intakta ringar och endotel-denuderade ringar för att inducera vasorelaxation och förvärva en koncentrationsberoende responskurva.Se till att den effektiva DMSO som används som lösningsmedel också utvärderas på liknande sätt för att fungera som en negativ kontroll. Utvärdera växtextraktets vasorelaxanta verkningsmekanism som nämns i textmanuskriptet. Sedan efter sammandragningarna till PE stabiliseras, tillsätt kumulativa koncentrationer av växtextraktet.Presentera effekterna av växtextrakt som procentuell avslappning av de intrapulmonella artärringarna i närvaro av hämmare jämfört med svaret från de intrapulmonella artärringarna utan hämmare och konstruera koncentrationsresponskurvan. I endotel intakt intrapulmonell artär framkallade växtextraktet ett koncentrationsberoende svar av vasorelaxation. Utrotning av endotel minskade djupt vasorelaxationen inducerad av växtextraktet, vilket återspeglas av ökningen av EC50 med 2,2 gånger, hämning av eNOS och EDHF minskade uppenbarligen det vasorelaxanta svaret på växtextraktet.Detta flyttade koncentrationsresponskurvan åt höger och ökade EC50 utan att ändra E-maxvärdena. Tvärtom visade Indometacin ingen effekt på det vasorelaxanta svaret på växtextraktet. I de endotel-denuderade intrapulmonala artärringarna minskade kalciumaktiverade kaliumkanalblockerare det vasorelaxanta svaret på växtextraktet.Medan blockerare av spänningsstyrda eller ATP-känsliga kaliumkanaler inte visade någon avvikelse. Preinkubation med växtextraktet hämmade den kalciumkloridinducerade sammandragningen. De endotel-denuderade intrapulmonala artärringarna förinkuberade med kalciumfri Krebs-lösning och PE gav en övergående sammandragning.I jämförelse med vehikeln minskade växtextrakten signifikant sammandragningen inducerad av PE. Under proceduren måste man tydligt identifiera ven, bronkier och artär tidigt. Skärning eller skada artären kommer att minska dess längd och påverka de vaskulära svaren. Denna teknik kan anpassas för att undersöka föreningar som kan fungera som prototyper för behandlingar av lungkärlssjukdomar såsom pulmonell arteriell hypertension.

Research

JoVE Journal

Medicine

Mesenteric Artery Contraction and Relaxation Studies Using Automated Wire Myography

Mesenteriska Artery kontraktion och Studier Avslappning med hjälp av automatiserade Wire Myography

Proximal resistance vessels, such as the mesenteric arteries, contribute substantially to the peripheral resistance. These small vessels of between ...

Training a Sophisticated Microsurgical Technique: Interposition of External Jugular Vein Graft in the Common Carotid Artery in Rats

Utbildning en sofistikerad mikrokirurgisk teknik: mellanliggande yttre halsvenen Graft i den gemensamma halspulsådern i råttor

Neointimal hyperplasia is one the primary causes of stenosis in arterialized veins that are of great importance in arterial coronary bypass surgery, in ...

Assessment of Right Ventricular Structure and Function in Mouse Model of Pulmonary Artery Constriction by Transthoracic Echocardiography

Bedömning av höger kammare struktur och funktion i musmodell av lungartären Förträngning av Transthoracic Ekokardiografi

Emerging clinical data support the notion that RV dysfunction is critical to the pathogenesis of cardiovascular disease and heart failure1-3. Moreover, ...

Bladder Smooth Muscle Strip Contractility as a Method to Evaluate Lower Urinary Tract Pharmacology

Bladder Smooth Muscle Strip Kontraktilitet som en metod för att utvärdera Lower Urinary Tract farmakologi

We describe an in vitro method to measure bladder smooth muscle contractility, and its use for investigating physiological and pharmacological properties ...

Embolic Middle Cerebral Artery Occlusion (MCAO) for Ischemic Stroke with Homologous Blood Clots in Rats

Embolic Middle Cerebral Artery Occlusion MCAO for Ischemic Stroke with Homologous Blood Clots in Rats

Emboli Middle Cerebral artärocklusion (kortex) för ischemisk stroke med Homologa Blodproppar i råttor

Clinically, thrombolytic therapy with use of recombinant tissue plasminogen activator (tPA) remains the most effective treatment for acute ischemic ...

Vascular Balloon Injury and Intraluminal Administration in Rat Carotid Artery

Vascular Balloon Skada och Intraluminal Administration i Rat carotis

The carotid artery balloon injury model in rats has been well established for over two decades. It remains an important method to study the molecular and ...

Permanent Ligation of the Left Anterior Descending Coronary Artery in Mice: A Model of Post-myocardial Infarction Remodelling and Heart Failure

Permanent Ligering av vänster främre Fallande Kranskärls hos möss: En modell av efter hjärtinfarkt Remodelling och hjärtsvikt

Heart failure is a syndrome in which the heart fails to pump blood at a rate commensurate with cellular oxygen requirements at rest or during stress. It ...

Ultrasound Based Assessment of Coronary Artery Flow and Coronary Flow Reserve Using the Pressure Overload Model in Mice

Ultraljud Baserat Bedömning av kranskärls Flow och Coronary Flow Reserve Använda tryckÖverbelastnings Model hos möss

Transthoracic Doppler echocardiography (TTDE) is a clinically useful, noninvasive tool for studying coronary artery flow velocity and coronary flow ...

Ferric Chloride-induced Thrombosis Mouse Model on Carotid Artery and Mesentery Vessel

Järnklorid-inducerad Trombos musmodell på Carotid Artery och tarmkäx Vessel

Severe thrombosis and its ischemic consequences such as myocardial infarction, pulmonary embolism and stroke are major worldwide health issues. The ferric ...

Calcification of Vascular Smooth Muscle Cells and Imaging of Aortic Calcification and Inflammation

Förkalkning av vaskulära glatta muskelceller och avbildning av aorta förkalkning och inflammation

Cardiovascular disease is the leading cause of morbidity and mortality in the world.  Atherosclerotic plaques, consisting of lipid-laden macrophages and ...