Name: isolation of intrapulmonary artery and smooth muscle cells to investigate vascular responses
Uploaded: 2022-06-08T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Intrapulmonary Artery and Smooth Muscle Cells to Investigate Vascular Responses at JoVE.com

Yazarlar, Tayland Ulusal Araştırma Konseyi'ne, Kimyada İnovasyon Mükemmeliyet Merkezi'ne (PERCH-CIC) ve Uluslararası Araştırma Ağı'na (IRN61W0005) finansal destek sağladıkları için ve Naresuan Üniversitesi Tıp Bilimleri Fakültesi Fizyoloji Bölümü'ne araştırma tesisi desteği için teşekkür etmek isterler.

Bu çalışmada yapılan deneyler, Naresuan Üniversitesi Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi (NUACUC) Etik Kurulu tarafından, NU-AE620921 protokol numarasıyla, hayvanların bilimsel amaçlarla bakımı ve kullanımı için onaylanmıştır.
1. Fizyolojik çözeltilerin bileşimi
<ol><li>Krebs çözeltisini, nihai konsantrasyonları elde etmek için kimyasalları damıtılmış suda çözerek aşağıdaki gibi formüle edin: 122 mM NaCl, 10 mM HEPES, 5 mM KCl, 0,5 mM K...

<ol>
	<li>Lyle, M. A., Davis, J. P., Brozovich, F. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+pulmonary+vascular+smooth+muscle+contractility+in+pulmonary+arterial+hypertension:+Implications+for+therapy.">Regulation of pulmonary vascular smooth muscle contractility in pulmonary arterial hypertension: Implications for therapy.</a> Frontiers in Physiology. 8, 614 (2017).</li><li>Cyr, A. R., Huckaby, L. V., Shiva, S. S., Zuckerbraun, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nitric+oxide+and+endothelial+dysfunction.">Nitric oxide and endothelial dysfunction.</a> Critical Care Clinics. 36 (2), 307-321 (2020).</li><li>Ruan, K. -. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advance+in+understanding+the+biosynthesis+of+prostacyclin+and+thromboxane+A2+in+the+endoplasmic+reticulum+membrane+via+the+cyclo-oxygenase+pathway.">Advance in understanding the biosynthesis of prostacyclin and thromboxane A2 in the endoplasmic reticulum membrane via the cyclo-oxygenase pathway.</a> Mini Reviews in Medicinal Chemistry. 4 (6), 639-647 (2004).</li><li>Del Pozo, R., Hernandez Gonzalez, I., Escribano-Subias, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+prostacyclin+pathway+in+pulmonary+arterial+hypertension:+A+clinical+review.">The prostacyclin pathway in pulmonary arterial hypertension: A clinical review.</a> Expert Review of Respiratory Medicine. 11 (6), 491-503 (2017).</li><li>Morgado, M., Cairr&#227;o, E., Santos-Silva, A. J., Verde, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cyclic+nucleotide-dependent+relaxation+pathways+in+vascular+smooth+muscle.">Cyclic nucleotide-dependent relaxation pathways in vascular smooth muscle.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 69 (2), 247-266 (2012).</li><li>Schmidt, K., de Wit, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelium-derived+hyperpolarizing+factor+and+myoendothelial+coupling:+The+in+vivo+perspective.">Endothelium-derived hyperpolarizing factor and myoendothelial coupling: The in vivo perspective.</a> Frontiers in Physiology. 11, (2020).</li><li>Fan, G., Cui, Y., Gollasch, M., Kassmann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elementary+calcium+signaling+in+arterial+smooth+muscle.">Elementary calcium signaling in arterial smooth muscle.</a> Channels. 13 (1), 505-519 (2019).</li><li>Wisutthathum, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extract+of+Aquilaria+crassna+leaves+and+mangiferin+are+vasodilators+while+showing+no+cytotoxicity.">Extract of Aquilaria crassna leaves and mangiferin are vasodilators while showing no cytotoxicity.</a> Journal of Traditional and Complementary Medicine. 9 (4), 237-242 (2019).</li><li>Kamkaew, N., Paracha, T. U., Ingkaninan, K., Waranuch, N., Chootip, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vasodilatory+effects+and+mechanisms+of+action+of+Bacopa+monnieri+active+compounds+on+rat+mesenteric+arteries.">Vasodilatory effects and mechanisms of action of Bacopa monnieri active compounds on rat mesenteric arteries.</a> Molecules. 24 (12), 2243 (2019).</li><li>Chootip, K., Kennedy, C., Gurney, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+P2+receptors+mediating+contraction+of+the+rat+isolated+pulmonary+vasculature.">Characterization of P2 receptors mediating contraction of the rat isolated pulmonary vasculature.</a> British Journal of Pharmacology. 131, 167 (2000).</li><li>Paracha, T. U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elucidation+of+vasodilation+response+and+structure+activity+relationships+of+N2,+N4-disubstituted+quinazoline+2,+4-diamines+in+a+rat+pulmonary+artery+model.">Elucidation of vasodilation response and structure activity relationships of N2, N4-disubstituted quinazoline 2, 4-diamines in a rat pulmonary artery model.</a> Molecules. 24 (2), 281 (2019).</li><li>Chootip, K., Gurney, A. M., Kennedy, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+P2Y+receptors+couple+to+calcium-dependent,+chloride+channels+in+smooth+muscle+cells+of+the+rat+pulmonary+artery.">Multiple P2Y receptors couple to calcium-dependent, chloride channels in smooth muscle cells of the rat pulmonary artery.</a> Respiratory Research. 6 (1), 1-10 (2005).</li><li>Wisutthathum, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Eulophia+macrobulbon+extract+relaxes+rat+isolated+pulmonary+artery+and+protects+against+monocrotaline-induced+pulmonary+arterial+hypertension.">Eulophia macrobulbon extract relaxes rat isolated pulmonary artery and protects against monocrotaline-induced pulmonary arterial hypertension.</a> Phytomedicine. 50, 157-165 (2018).</li><li>Kruangtip, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Curcumin+analogues+inhibit+phosphodiesterase-5+and+dilate+rat+pulmonary+arteries.">Curcumin analogues inhibit phosphodiesterase-5 and dilate rat pulmonary arteries.</a> Journal of Pharmacy and Pharmacology. 67 (1), 87-95 (2015).</li></ol>

Bu yazıda, sıçan IPA ve VSMC'lerinin izolasyon tekniğini açıklayacağız. IPA'nın in vitro vasküler yanıtını araştırmak için, bitki ekstresi tarafından indüklenen IPA vazogevşemesinin farmakolojik etkisini ve mekanik temelini karakterize etmek için kullanılabilecek çeşitli deneysel protokoller kullanılmıştır.
Bitki ekstraktının endotele bağımlı vazodilatör etkisi ile ilgili olarak, L-NAME (eNOS), indometazin (COX) ve apamin + charybdotoxin (EDHF) gibi ç...

Pulmoner vaskülatür, ana fonksiyonun akciğerlerin gaz değişim alanına oksijensiz kan vermek olduğu düşük basınçlı bir vasküler sistemdir. Akciğerlerdeki pulmoner arterler, bronşiyal ağaca paralel dallar halinde düzenlenir, sonuçta birkaç alveol üzerinde sürekli olan ve son olarak venüller ve damarlar halinde bir araya gelen geniş bir kılcal damar ağı oluşturur. Pulmoner arterin vasküler tonusu, endotel ve vasküler düz kas hücreleri (VSMC'ler) arasındaki etkileşimi içeren çeşitli faktörler tarafından kontrol edilir1.
Bu çalışmada, intrapulmoner arterin (IPA) endotele bağımlı ve bağımsız vazogevşemesi üzerinde durulmuştur. Endotel bağımlı vazogevşeme ile ilgili olarak, endotel hücrelerinin yüzeyinde meydana gelen çeşitli mekanizmalar, hücre içi Ca 2+ konsantrasyonunu artırabilir (örneğin, muskarinik reseptör [M3] ile asetilkolin [ACh] bağlanır), nitrik oksit (NO), prostasiklin (PGl2) ve endotel kaynaklı hiperpolarize edici faktör (EDHF) oluşumuna yol açabilir (Şekil 1 ). NO, endotel nitrik oksit sentaz (eNOS)2 tarafından L-arginin'den sentezlenen ana endotel kaynaklı gevşetici faktördür, daha sonra endotel hücrelerinden VSMC'lere ayrışır (Şekil 1) ve çözünür guanilil siklaz (sGC) enzimini uyarır; Bu enzim guanosin trifosfatı (GTP) protein kinaz G'yi (PKG) aktive eden ve sitozolik Ca2+ seviyelerini azaltan ve böylece vazogevşemeye neden olan siklik guanozin monofosfata (cGMP) dönüştürür (Şekil 1). PGl2, endotel hücreleri tarafından siklo-oksijenaz (COX) yolu 3,4 üzerinden sentezlenir. VSMC'ler üzerindeki prostasiklin reseptörü (IP) ile bağlanır ve adenozin trifosfatı (ATP) siklik adenozin monofosfata (cAMP) dönüştüren adenilil siklaz (AC) enzimini uyarır (Şekil 1)3,4. cAMP, protein kinaz A'yı (PKA) aktive eder, sitozolik Ca2+ seviyelerini azaltır ve vazogevşemeye neden olur5 (Şekil 1). EDHF yolu ayrıca çeşitli endotel mediatörleri ve elektriksel olaylar yoluyla endotele bağımlı vazogevşemeye katılır. EDHF yolunun aktivasyonu, VSMC'lerin hiperpolarizasyonuna yol açar, böylece voltajla çalışan Ca 2 + kanallarını (VOCC'ler) kapatır, hücre içi Ca2 + seviyelerini azaltır ve vazogevşeme6'yı indükler. Endotelden bağımsız vazogevşeme, hücre içi Ca 2+ seviyesinin düşürülmesi, miyozin hafif zincir kinazının (MLCK) inhibisyonu, miyozin hafif zincirli fosfatazın (MLCP) aktivasyonu ve VSMC'lerin kontraktil makinelerine Ca2+ duyarlılığının azaltılması gibi çeşitli mekanizmalar yoluyla doğrudan VSMC'lerde meydana gelir. Bu çalışmada, çeşitli K+ kanallarının açılmasının neden olduğu vazogevşeme, VOCC'lerin blokajı ve sarkoplazmik retikulum7'den Ca 2+ salınımının inhibisyonuna odaklanıyoruz, bu da hücre içi Ca 2+ seviyelerinin azalmasına yol açan, böylece VSMC miyozin hafif zincir fosforilasyonunu ve miyoz-aktin bağlanmasını veya çapraz köprü oluşumunu azaltan, sonuçta vazogevşeme ile sonuçlanır.
İzole IPA'da vazokonstriksiyon ve vazogevşeme ölçümlerini değerlendirme tekniği kemirgenler için iyi kurulmuştur, ancak veriler deneysel protokollere bağlı olarak değişmiştir. Bu çalışmada, sinir sinyalleri, hormonlar, sitokinler, kan basıncı gibi in vivo vasküler yanıtı modüle eden dış faktörlerin yokluğunda yapılan sıçan IPA preparatlarının in vitro vasküler reaktivitelerini değerlendirmek için kullanılan yöntem açıklanmaktadır.
IPA'nın vasküler reaktivitelerini incelemek için bitki ekstraktını örnek olarak kullanan birkaç deneysel protokol kullandık. Bitki ekstresi tarafından indüklenen endotele bağımlı ve bağımsız vazogevşeme mekanizmalarını tanımlamak için çeşitli blokerler (Şekil 1) kullanılmıştır. Bununla birlikte, aynı protokoller, IPA'nın çeşitli pulmoner patolojilerin tedavisinde kullanılan herhangi bir ilaca, ekstrakta veya fitokimyasallara vasküler yanıtlarını değerlendirmek için uyarlanabilir.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1,4-dithiothreitol (DTT)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D0632 
			CAS NO. 348-12-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-aminopyridine (4-AP)</td>
			<td>Aldrich Chemical</td>
			<td>A78403 
			CAS NO. 504-24-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetylcholine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A6625 
			CAS NO. 60-31-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Apamin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9459 
			CAS NO. 24345-16-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A2153 
			CAS NO. 9048-46-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium choride</td>
			<td>Ajax Finechem</td>
			<td>AJA960 
			CAS NO. 1707055184</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Charybdotoxin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C7802 
			CAS NO. 95751-30-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase type 1A</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C9891 
			CAS NO. 9001-12-1</td>
			<td>From Clostridium histolyticum</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D(+)-Glucose monohydrate</td>
			<td>Millipore Corporation</td>
			<td>K50876942 924 
			CAS NO. 14431-43-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D4540 
			CAS NO. 67-68-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylene glycol-bis (2-aminoethylether)-N,N,N&#8217;,N&#8217;-tetraacetic acid (EGTA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E3889 
			CAS NO. 67-42-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E9884 
			CAS NO. 60-00-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps 11 cm.</td>
			<td>Rustless Dumoxel</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps 14 cm.</td>
			<td>Rustless Dumoxel</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glibenclamide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G6039 
			CAS NO. 16673-34-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GraphPad Prism program</td>
			<td>Software version 5.0 (San Diego, CA, USA)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H3375 
			CAS NO. 7365-45-9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iberiotoxin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I5904 
			CAS NO. 1002546960</td>
			<td>recombinant from Mesobuthus tamulus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Indomethacin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I7378 
			CAS NO. 53-86-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Labchart Program</td>
			<td>Software version 7.0 (A.D. Instrument, Castle Hill, Australia).</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride</td>
			<td>Ajax Finechem</td>
			<td>296 
			CAS NO. 1506254995</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Male Wistar rats</td>
			<td>Nomura Siam International Co. Ltd., Bangkok, Thailand</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NG-nitro-L-arginine methyl ester (L-NAME)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>N5751 
			CAS NO. 51298-62-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nicardipine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>N7510 
			CAS NO. 54527-84-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Organ bath 15 mL.</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Specific order by the researchers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Papain</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4762 
			CAS NO. 9001-73-4</td>
			<td>FromPapaya Latex</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenal red</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5530 
			CAS NO. 34487-61-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenylephrine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P6126 
			CAS NO. 61-76-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>Kemaus</td>
			<td>KA383 
			CAS NO. 7447-40-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium dihydrogenphosphate</td>
			<td>Aldrich Chemical</td>
			<td>EC231-913-4 
			CAS NO. 7778-77-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>S+A2:E36odium chloride</td>
			<td>Kemaus</td>
			<td>KA465 
			CAS NO. 7647-14-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissors 11 cm.</td>
			<td>Spall Stainless</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissors 14 cm.</td>
			<td>Spall Stainless</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium bicarbonate</td>
			<td>Ajax Finechem</td>
			<td>475 
			CAS NO. 912466</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dihydrogenphosphate</td>
			<td>Aldrich Chemical</td>
			<td>33,198-8 
			CAS NO. 7558-80-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide</td>
			<td>Ajax Finechem</td>
			<td>482 
			CAS NO. 1506196602</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium thiopental</td>
			<td>Anesthal</td>
			<td>JPN3010002 
			CAS NO. 1C 314/47</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taurine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T0625 
			CAS NO. 107-35-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Waterbath WBU 45</td>
			<td>Memmert</td>
			<td>2766 
			CAS NO. -</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of intrapulmonary artery and smooth muscle cells to investigate vascular responses

Sıçan akciğerlerinden izole edilen intrapulmoner arter (IPA) ve vasküler düz kas hücreleri (VSMC'ler), vazokonstriksiyon ve vazogevşemenin altında yatan mekanizmaları incelemek için kullanılabilir. IPA ve VSMC'ler izole edildikten sonra, fizyolojik ve patolojik durumlarda vasküler yanıtların özellikleri, sinir sinyalleri, hormonlar, sitokinler vb. gibi dışsal faktörlerin yokluğunda değerlendirilebilir. Bu nedenle, IPA ve VSMC'ler, farmakolojik ajanlarla modülasyon, yama-kelepçeli elektrofizyolojik analiz, kalsiyum görüntüleme gibi çeşitli deneysel araştırmalarla birlikte vasküler fizyoloji / patofizyolojiyi incelemek için mükemmel modeller olarak hizmet eder. Burada, bir organ banyosu kurulumunda vasküler yanıtları araştırmak için IPA'yı izole etmek için bir teknik kullandık. IPA segmentleri intraluminal teller vasıtasıyla organ banyosu odasına monte edildi ve çeşitli farmakolojik ajanlarla uyarıldı. IPA vasküler tonusundaki değişiklikler (yani vazokonstriksiyon ve vazogevşeme), izometrik kuvvet dönüştürücü ve fizyolojik veri analizi yazılım programı kullanılarak kaydedildi. Fitokimyasal veya sentetik ilaçların farmakolojik aktivitelerini incelemek için vazogevşeme / vazokonstriksiyon mekanizmalarını araştırmak için uyarlanabilen birkaç deneysel protokol uyguladık. Protokoller, pulmoner arteriyel hipertansiyon da dahil olmak üzere çeşitli hastalıkların modülasyonunda ilaçların rollerini değerlendirmek için de kullanılabilir. IPA modeli, ilaçların farmakodinamik parametrelerinin değerlendirilmesinde çok önemli olan konsantrasyon-yanıt eğrisini araştırmamıza izin verir.

Bu çalışmadaki protokol, izole IPA preparatlarının vasküler yanıtlarında gözlenen fizyolojik fenomenleri ölçmek için en uygun deneysel koşulları belirlemek için geliştirilmiştir. Pilot deneyler, bitki ekstraktının vazogevşetici etkisinin vasküler etkilerinin ve mekanik temelinin anlaşılmasına yardımcı olan potansiyel sonuçları aşağıdaki gibi tanımlamak için gerçekleştirilmiştir.
Bitki ekstraktının vazorelaxant etkisi Şekil 6A,B'de gös...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Intrapulmonary Artery and Smooth Muscle Cells to Investigate Vascular Responses at JoVE.com

Isolation of Intrapulmonary Artery and Smooth Muscle Cells to Investigate Vascular Responses

Arteriyel pulmoner dolaşımın vasküler yanıtları intrapulmoner arter (IPA) ve vasküler düz kas hücreleri (VSMC'ler) kullanılarak araştırılabilir. Bu çalışmada IPA'nın izolasyonu ayrıntılı olarak ve fizyolojik uyaranlara yanıt olarak vazogevşemenin araştırılmasında kullanılan protokoller açıklanmaktadır.

Vasküler Yanıtları Araştırmak için İntrapulmoner Arter ve Düz Kas Hücrelerinin İzolasyonu

The intrapulmonary artery (IPA) and vascular smooth muscle cells (VSMCs) isolated from rat lungs can be used to study the underlying mechanisms of ...

Bu çalışmada sıçan intrapulmoner arter ve vasküler düz kas hücrelerinin izole edilmesi anlatılmaktadır. İntrapulmoner arterin vasküler yanıtını araştırmak için organ banyosu tekniğini kullanmak gibi çeşitli deneysel protokoller kullanılmıştır. İntrapulmoner arterler ve vasküler düz kas hücreleri, vasküler fizyoloji ve patofizyolojiyi incelemek için mükemmel modellerdir.Bu tekniğin adaptasyonları, herhangi bir ilacın, ekstraktın veya fitokimyasalın vasküler yanıtlarını değerlendirebilir. İzole intrapulmoner arteriyel halkanın bir organ banyosuna monte edilmesi, bir ilacın pulmoner hipertansiyon da dahil olmak üzere çeşitli hastalıkların modülasyonundaki rolünü değerlendirmek için izole intrapulmoner arterlerin kullanılmasını sağlar. Deneysel protokoller teknik olarak uygulanabilir, ancak önemli adımlar karmaşık ve başarı için gereklidir, bu nedenle görsel bir gösterime sahip olmak anlamayı ve takip etmeyi kolaylaştırır.Prosedürü gösteren, Naresuan Üniversitesi Tıp Fakültesi Fizyoloji Bölümü, Kardiyovasküler Araştırma Birimi Laboratuvarı'ndan fizyoloji alanında yüksek lisans öğrencisi olan Kittiwoot To-on olacak. Akciğerin tek bir lobunu 11 santimetrelik makasla dilimleyerek ve medial tarafı veya akciğerin kökü yukarı bakacak şekilde dokuz santimetrelik bir Petri kabına yerleştirerek başlayın. Damar, bronş ve arterin yukarıdan aşağıya hizalanmasını gözlemleyin ve tanımlayın.Bronşu makasla uzunlamasına kesin. Ardından bronşun ucunu tutmak için 11 santimetrelik forseps kullanın. Bronş ve damarları yavaşça disseke edin ve akciğerden çıkarın.İntrapulmoner arterin ucunu tutmak için forsepsleri kullanın ve makasla akciğer dokusundan dikkatlice diseke edin. İzole intrapulmoner arteri, organ banyosu düzeneği kurulana kadar soğuk Krebs çözeltisinde tutun. İntrapulmoner arteri izole ettikten sonra, intrapulmoner arterin ana dalını 11 santimetrelik makasla uzunlamasına kesin ve iki milimetrelik şeritler halinde kesin.İntrapulmoner arter şeritlerini DM'ye batırın, daha sonra şeritleri mililitre papain,% 0.04 BSA ve% 0.4 milimolar DTT içeren DM'de dört santigrat derecede bir saat boyunca inkübe edin. Daha sonra 15 dakika boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin. DM'de mililitre kollajenaz Tip IA başına bir miligram ekleyin ve beş dakika boyunca 37 santigrat derecede tekrar inkübe edin.Dokuları taze DM'ye aktarın ve bir cam Pasteur pipet kullanarak nazik tritürasyonla dağıtın. İzole vasküler düz kas hücreleri mikroskop altında banyo çözeltisinde görünür hale gelene kadar tritürasyona devam edin. Daha önce gösterildiği gibi intrapulmoner arteri izole edin ve intrapulmoner arterin ana dalını yaklaşık iki milimetre uzunluğundaki halkalara kesin.İntrapulmoner arter halkalarını organ banyosu odacıklarına 40 mikrometre çapında iki paslanmaz çelik tel üzerine geçirerek yapıştırın. İntrapulmoner arter halkaları ile monte edilmiş paslanmaz çelik telleri, veri toplama cihazına bağlı izometrik kuvvet dönüştürücülere ve veri kaydı ve analizi için uygun fizyolojik yazılımla kurulan bilgisayar sistemine takın. Daha sonra intrapulmoner arter halkasının gerginliğini yavaşça bir grama yükseltin.Damar segmentlerinin bir gramlık bir dinlenme geriliminde yaklaşık 45 dakika boyunca dengelenmesine izin verin. Dengeleme süresi boyunca, Krebs çözeltisinin her 15 dakikada bir düzenli olarak değiştirildiğinden emin olun. Dengeden sonra, yüksek hücre dışı potasyum çözeltisine vazokonstriksiyonlarını ölçerek damarların yaşayabilirliğini test edin.PE ile önceden kontrakte edilmiş halkalarda asetilkoline gevşeme yanıtını hesaplayarak endotel varlığını veya yokluğunu değerlendirin. Denudasyonu indüklemek için kabın içini küçük bir telle hafifçe ovalayarak endoteli mekanik olarak çıkarın. Daha sonra test deneylerinin başlamasından önce arteriyel halkaları 30 dakika boyunca dengeleyin. Bitki ekstraktının gevşetici etkisini, intrapulmoner arter halkalarını PE ile önceden daraltarak araştırın. Daha sonra, vazogevşemeyi indüklemek ve konsantrasyona bağlı bir yanıt eğrisi elde etmek için bitki ekstraktının mililitresi başına 0.1 ila 1000 mikrogramı dikkatlice endotel bozulmamış halkalara ve endotel ile indüklenmiş halkalara kümülatif olarak ekleyin.Bir çözücü olarak kullanılan etkili DMSO'nun da negatif kontrol görevi görecek şekilde benzer şekilde değerlendirildiğinden emin olun. Metin yazısında belirtildiği gibi bitki ekstraktının vazogevşetici etki mekanizmasını değerlendirir. Daha sonra PE stabilize için kasılmalardan sonra, bitki ekstraktının kümülatif konsantrasyonlarını ekleyin.İnhibitörlerin varlığında intrapulmoner arter halkalarının inhibitörlerin varlığında gevşeme yüzdesi olarak bitki ekstresinin etkilerini, inhibitörsüz intrapulmoner arter halkalarının yanıtına kıyasla sunar ve konsantrasyon yanıt eğrisini oluşturur. Endotel sağlam intrapulmoner arterde, bitki ekstresi vazoresyonun konsantrasyona bağımlı bir yanıtını ortaya çıkardı. Endotelin eradikasyonu, EC50'deki artışın 2.2 kat artmasıyla yansıtıldığı gibi, bitki ekstraktının neden olduğu vazogevşemeyi derinden azalttı, eNOS ve EDHF'nin inhibisyonu bitki ekstraktına verilen vazorelaxant tepkisini açıkça azalttı.Bu, konsantrasyon tepki eğrisini sağa kaydırdı ve E max değerlerini değiştirmeden EC50'yi artırdı. Aksine, Indometazin, bitki ekstraktına vazogevşetici yanıt üzerinde hiçbir etki göstermedi. Endotel ile indüklenmiş intrapulmoner arter halkalarında, kalsiyum ile aktive edilen potasyum kanal blokerleri, bitki ekstraktına vazogevşetici yanıtı azaltmıştır.Voltaj kapılı veya ATP'ye duyarlı potasyum kanallarının blokerleri ise sapma göstermedi. Bitki özü ile ön inkübasyon, kalsiyum-klorür kaynaklı kasılmayı inhibe etti. Endotel ile indüklenen intrapulmoner arter halkaları, kalsiyum içermeyen Krebs solüsyonu ve PE ile önceden inkübe edilerek geçici bir kasılma meydana getirdi.Araca kıyasla, bitki özleri PE tarafından indüklenen büzülmeyi önemli ölçüde azaltmıştır. İşlem sırasında, damar, bronş ve arteri erken yaşta açıkça tanımlamalıdır. Arterin kesilmesi veya zarar görmesi, uzunluğunu azaltacak ve vasküler yanıtları etkileyecektir. Bu teknik, pulmoner arteriyel hipertansiyon gibi pulmoner vasküler hastalıkların tedavisi için prototip görevi görebilecek bileşikleri araştırmak için uyarlanabilir.

Research

JoVE Journal

Medicine

Mesenteric Artery Contraction and Relaxation Studies Using Automated Wire Myography

Otomatik Tel kasılmaların kâğıda çizilmesi Yüklü daralma ve Rahatlama Çalışmaları

Proximal resistance vessels, such as the mesenteric arteries, contribute substantially to the peripheral resistance. These small vessels of between ...

Training a Sophisticated Microsurgical Technique: Interposition of External Jugular Vein Graft in the Common Carotid Artery in Rats

Sıçanlarda Common Karotid Arter interpozisyon Harici Juguler Ven Greft: Gelişmiş Mikrocerrahi Tekniği Eğitimi

Neointimal hyperplasia is one the primary causes of stenosis in arterialized veins that are of great importance in arterial coronary bypass surgery, in ...

Assessment of Right Ventricular Structure and Function in Mouse Model of Pulmonary Artery Constriction by Transthoracic Echocardiography

Transtorasik Ekokardiyografi ile Pulmoner Arter Konstrüksiyon Fare Modeli sağ ventrikül yapı ve fonksiyonlarının değerlendirilmesi

Emerging clinical data support the notion that RV dysfunction is critical to the pathogenesis of cardiovascular disease and heart failure1-3. Moreover, ...

Bladder Smooth Muscle Strip Contractility as a Method to Evaluate Lower Urinary Tract Pharmacology

Alt Üriner Sistem Farmakoloji değerlendirin bir Yöntem olarak mesane düz kas Şerit Kasılabilme

We describe an in vitro method to measure bladder smooth muscle contractility, and its use for investigating physiological and pharmacological properties ...

Embolic Middle Cerebral Artery Occlusion (MCAO) for Ischemic Stroke with Homologous Blood Clots in Rats

Embolic Middle Cerebral Artery Occlusion MCAO for Ischemic Stroke with Homologous Blood Clots in Rats

Sıçanlar Homolog Kan pıhtısı ile İskemik İnme emboli Orta Serebral Arter Tıkanıklığı (MCAO)

Clinically, thrombolytic therapy with use of recombinant tissue plasminogen activator (tPA) remains the most effective treatment for acute ischemic ...

Vascular Balloon Injury and Intraluminal Administration in Rat Carotid Artery

Sıçan Karotis Arter Vasküler Balon Yaralanma ve intraluminal İdaresi

The carotid artery balloon injury model in rats has been well established for over two decades. It remains an important method to study the molecular and ...

Permanent Ligation of the Left Anterior Descending Coronary Artery in Mice: A Model of Post-myocardial Infarction Remodelling and Heart Failure

Farelerde Sol Ön İnen Koroner Arter Daimi ligasyonu: Post-miyokard Enfarktüs Remodelling ve Kalp Yetmezliği Bir Model

Heart failure is a syndrome in which the heart fails to pump blood at a rate commensurate with cellular oxygen requirements at rest or during stress. It ...

Ultrasound Based Assessment of Coronary Artery Flow and Coronary Flow Reserve Using the Pressure Overload Model in Mice

Farelerde Basınç Aşırı Modeli Koroner Arter Akış ve Koroner Akım Rezervi Ultrason Dayalı Değerlendirme

Transthoracic Doppler echocardiography (TTDE) is a clinically useful, noninvasive tool for studying coronary artery flow velocity and coronary flow ...

Ferric Chloride-induced Thrombosis Mouse Model on Carotid Artery and Mesentery Vessel

Ferric Klorür kaynaklı Karotis Arter ve Mezenter Gemi Tromboz Fare Modeli

Severe thrombosis and its ischemic consequences such as myocardial infarction, pulmonary embolism and stroke are major worldwide health issues. The ferric ...

Calcification of Vascular Smooth Muscle Cells and Imaging of Aortic Calcification and Inflammation

Aort Kalsifikasyon ve Enflamasyon Vasküler düz kas hücrelerinin ve Görüntüleme Kalsifikasyon

Cardiovascular disease is the leading cause of morbidity and mortality in the world.  Atherosclerotic plaques, consisting of lipid-laden macrophages and ...