Name: crispr gene editing tool for microrna cluster network analysis
Uploaded: 2022-04-25T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about CRISPR Gene Editing Tool for MicroRNA Cluster Network Analysis at JoVE.com

PC3-ML cellijnen werden vriendelijk verstrekt door Mark Stearn (Drexel University College of Medicine). Justin Toxey hielp bij PCR genotypering. Dit werk werd ondersteund door een Breedan Adams Foundation Grant, een Ryan Translational Research Fund en een Commonwealth Health Research Board Grant (CHRB-274-11-20) aan AE-K.

1. Voorbereiding voor CRISPR-genbewerking en gids-RNA-ontwerp om miRNA-cluster knock-out cellijnen te genereren
<ol><li>Maak een DNA-bestand met de volledige genomische sequentie van het miRNA-clustergebied van belang (intergeen, intronisch) en ten minste 1 kB van de omliggende genomische gebieden met behulp van een DNA-sequentie-annotatiesoftwareprogramma19.<ol><li>Gebruik een functiebewerkingstool in het gemaakte DNA-bestand om de beoogde miRNA-clusterlocus (i...

<ol>
	<li>Hasegawa, T., Lewis, H., Esquela-Kerscher, A., Laurence, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Translating MicroRNAs to the Clinic. , 329-369 (2017).</li><li>Lewis, H., Esquela-Kerscher, A., Thiagalingam, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Systems Biology of Cancer. , 134-153 (2015).</li><li>Esquela-Kerscher, A., Slack, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oncomirs+-+microRNAs+with+a+role+in+cancer.">Oncomirs - microRNAs with a role in cancer.</a> Nature Reviews Cancer. 6 (4), 259-269 (2006).</li><li>Breving, K., Esquela-Kerscher, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+complexities+of+microRNA+regulation:+mirandering+around+the+rules.">The complexities of microRNA regulation: mirandering around the rules.</a> The International Journal of Biochemistry &amp; Cell Biology. 42 (8), 1316-1329 (2010).</li><li>Griffiths-Jones, S., Saini, H. K., van Dongen, S., Enright, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=miRBase:+tools+for+microRNA+genomics.">miRBase: tools for microRNA genomics.</a> Nucleic Acids Research. 36, 154-158 (2008).</li><li>Kabekkodu, S. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clustered+miRNAs+and+their+role+in+biological+functions+and+diseases.">Clustered miRNAs and their role in biological functions and diseases.</a> Biological Reviews. 93 (4), 1955-1986 (2018).</li><li>Xiang, J., Wu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Feud+or+friend?+The+role+of+the+miR-17-92+cluster+in+tumorigenesis.">Feud or friend? The role of the miR-17-92 cluster in tumorigenesis.</a> Current Genomics. 11 (2), 129-135 (2010).</li><li>Aqeilan, R. I., Calin, G. A., Croce, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=miR-15a+and+miR-16-1+in+cancer:+discovery,+function+and+future+perspectives.">miR-15a and miR-16-1 in cancer: discovery, function and future perspectives.</a> Cell Death &amp; Differentiation. 17 (2), 215-220 (2010).</li><li>Hasegawa, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+and+evidence+of+the+miR-888+cluster+as+a+novel+cancer+network+in+prostate.">Characterization and evidence of the miR-888 cluster as a novel cancer network in prostate.</a> Molecular Cancer Research. , (2018).</li><li>Lewis, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=miR-888+is+an+expressed+prostatic+secretions-derived+microRNA+that+promotes+prostate+cell+growth+and+migration.">miR-888 is an expressed prostatic secretions-derived microRNA that promotes prostate cell growth and migration.</a> Cell Cycle. 13 (2), 227-239 (2014).</li><li>Xu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+a+prostate+cancer+susceptibility+locus+on+the+X+chromosome.">Evidence for a prostate cancer susceptibility locus on the X chromosome.</a> Nature Genetics. 20 (2), 175-179 (1998).</li><li>Schleutker, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genetic+epidemiological+study+of+hereditary+prostate+cancer+(HPC)+in+Finland:+frequent+HPCX+linkage+in+families+with+late-onset+disease.">A genetic epidemiological study of hereditary prostate cancer (HPC) in Finland: frequent HPCX linkage in families with late-onset disease.</a> Clinical Cancer Research. 6 (12), 4810-4815 (2000).</li><li>Farnham, J. M., Camp, N. J., Swensen, J., Tavtigian, S. V., Albright, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Confirmation+of+the+HPCX+prostate+cancer+predisposition+locus+in+large+Utah+prostate+cancer+pedigrees.">Confirmation of the HPCX prostate cancer predisposition locus in large Utah prostate cancer pedigrees.</a> Human Genetics. 116 (3), 179-185 (2005).</li><li>Brown, W. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hereditary+prostate+cancer+in+African+American+families:+linkage+analysis+using+markers+that+map+to+five+candidate+susceptibility+loci.">Hereditary prostate cancer in African American families: linkage analysis using markers that map to five candidate susceptibility loci.</a> British Journal Of Cancer. 90 (2), 510-514 (2004).</li><li>Bochum, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Confirmation+of+the+prostate+cancer+susceptibility+locus+HPCX+in+a+set+of+104+German+prostate+cancer+families.">Confirmation of the prostate cancer susceptibility locus HPCX in a set of 104 German prostate cancer families.</a> Prostate. 52 (1), 12-19 (2002).</li><li>Doudna, J. A., Charpentier, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+editing.+The+new+frontier+of+genome+engineering+with+CRISPR-Cas9.">Genome editing. The new frontier of genome engineering with CRISPR-Cas9.</a> Science. 346 (6213), 1258096 (2014).</li><li>Adli, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+CRISPR+tool+kit+for+genome+editing+and+beyond.">The CRISPR tool kit for genome editing and beyond.</a> Nature Communications. 9 (1), (2018).</li><li>Jinek, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+programmable+dual-RNA+guided+DNA+endonuclease+in+adaptive+bacterial+immunity.">A programmable dual-RNA guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity.</a> Science. 337 (6096), 816-821 (2012).</li><li>. SnapGene&#174; software (from Insightful Science; available at snapgene.com) Available from: <a target="_blank" href="https://www.snapgene.com">https://www.snapgene.com</a> (2022)</li><li>. Ensembl Release 104 genome browser (from EMBL-EBI) Available from: <a target="_blank" href="https://www.ensembl.org">https://www.ensembl.org</a> (2022)</li><li>Howe, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ensembl+2021.">Ensembl 2021.</a> Nucleic Acids Research. 49, 884-891 (2021).</li><li>. miRBase: the microRNA database, Release 22.1 (from Griffiths-Jones laboratory) Available from: <a target="_blank" href="https://www.mirbase.org">https://www.mirbase.org</a> (2022)</li><li>. Dharmacon CRISPR Design Tool (from Dharmacon) Available from: <a target="_blank" href="https://www.horizondiscovery.com/en/ordering-and-calculation-tools/crispr-dna-region-designer">https://www.horizondiscovery.com/en/ordering-and-calculation-tools/crispr-dna-region-designer</a> (2022)</li><li>. Off-Spotter (Venetia Pliatsika &amp; Isidore Rigoutsos of the Jefferson Computational Medicine Center) Available from: <a target="_blank" href="https://cm.jefferson.edu/Off-Spotter/">https://cm.jefferson.edu/Off-Spotter/</a> (2022)</li><li>Bao, X. R., Pan, Y., Lee, C. M., Davis, T. H., Bao, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tools+for+experimental+and+computational+analyses+of+off-target+editing+by+programmable+nucleases.">Tools for experimental and computational analyses of off-target editing by programmable nucleases.</a> Nature Protocols. 16 (1), 10-26 (2021).</li><li>. Dharmacon DharmaFECT Transfection Reagent Cell Type Guide. Choose Dharmacon DharmaFECT 1, 2, 3, or 4 for optimal transfection of siRNA or miRNA reagents Available from: <a target="_blank" href="https://horizondiscovery.com/-/media-Files/Horizon/resources/Selection-guides/dharmafect-cell-type-guidelines.pdf">https://horizondiscovery.com/-/media-Files/Horizon/resources/Selection-guides/dharmafect-cell-type-guidelines.pdf</a> (2022)</li><li>Baffoe-Bonnie, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+major+locus+for+hereditary+prostate+cancer+in+Finland:+localization+by+linkage+disequilibrium+of+a+haplotype+in+the+HPCX+region.">A major locus for hereditary prostate cancer in Finland: localization by linkage disequilibrium of a haplotype in the HPCX region.</a> Human Genetics. 117 (4), 307-316 (2005).</li><li>Zhang, R., Peng, Y., Wang, W., Su, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+evolution+of+an+X-linked+microRNA+cluster+in+primates.">Rapid evolution of an X-linked microRNA cluster in primates.</a> Genome Research. 17 (5), 612-617 (2007).</li><li>Ohnuki, Y., Marnell, M. M., Babcock, M. S., Lechner, J. F., Kaighn, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromosomal+analysis+of+human+prostatic+adenocarcinoma+cell+lines.">Chromosomal analysis of human prostatic adenocarcinoma cell lines.</a> Cancer Research. 40 (3), 524-534 (1980).</li><li>Beheshti, B., Karaskova, J., Park, P. C., Squire, J. A., Beatty, B. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+high+frequency+of+chromosomal+rearrangements+in+the+centromeric+regions+of+prostate+cancer+cell+lines+by+sequential+giemsa+banding+and+spectral+karyotyping.">Identification of a high frequency of chromosomal rearrangements in the centromeric regions of prostate cancer cell lines by sequential giemsa banding and spectral karyotyping.</a> Molecular Diagnosis. 5 (1), 23-32 (2000).</li></ol>

Deze CRISPR-genbewerkingsprocedure stelt de onderzoeker in staat om snel een heel panel van cellijnen te genereren met unieke miRNA-clusterdeletiecombinaties. De transfectie van synthetische geleidings-RNA's bestaande uit 5' en 3' genomische site-specifieke crRNA's gegloeid met synthetisch tracrRNA (1:1 molaire verhouding) in dit protocol voorkomt tijdrovende plasmidevectorsubcloning en maakt een flexibeler en high-throughput experimenteel ontwerp mogelijk met behulp van een 24-well-formaat. De generatie van cellijnen me...

Er zijn betere onderzoeksinstrumenten nodig om de bijdrage van niet-coderende RNA's aan ziekten bij de mens te onderzoeken. MiRNA-ontregeling wordt vaak waargenomen bij menselijke aandoeningen zoals kanker bij het vergelijken van de expressieprofielen van deze kleine niet-coderende RNA's in de weefsels en lichaamsvloeistoffen (bijv. Bloed, urine) van kankerpatiënten versus niet-kanker, gezonde personen, met behulp van microarrays, kwantitatieve real-time PCR (qRT-PCR) en diepe sequencingtechnologieën van de volgende generatie 1,2 . Recent werk heeft een grote subset van deze miRNA's gekarakteriseerd als tumorsuppressor, oncogene en metastasefactoren die tumorvorming, ziekteprogressie en medicijnresistentie beheersen. Experimentele overexpressie en/of downregulatie/verlies van miRNA's resulteren in functionele en pleiotrope gevolgen in de cel, als gevolg van het brede scala aan kankergerelateerde activiteiten die deze niet-coderende RNA's coördineren - groei, apoptose, differentiatie, chromatineremodellering, angiogenese, epitheliale naar mesenchymale (EMT) en MET-overgangen, metabolisme en immuunrespons3.
MiRNA's worden gecodeerd als enkele genen of verblijven in genomische clusters, die in de kern worden getranscribeerd en uitgebreid worden verwerkt voordat de biologisch volwassen, enkelstrengs ~ 22 nucleotide (nt) miRNA-soorten worden gegenereerd die zijn gelokaliseerd in het cytoplasma4. Deze kleine RNA's oefenen hun effecten post-transcriptioneel uit en fungeren als negatieve genregulatoren die zich op een sequentiespecifieke manier binden aan messenger-RNA (mRNA) -doelen om het katalytische RNA-geïnduceerde uitschakelingscomplex (RISC) naar de mRNA-site te brengen, wat resulteert in mRNA-afbraak en / of een blok in eiwittransformatie. MiRNA's zijn een extreem overvloedige klasse van niet-coderende RNA's in dierlijke systemen en er bestaan 2.654 volwassen miRNA's in het menselijk genoom (miRBase release 22.1)5. MiRNA's associëren meestal met onvolledige complementariteit met hun mRNA-doelen4. Daarom kan een enkel miRNA tientallen tot honderden verschillende mRNA-doelen reguleren en functioneel een groot aantal biologische routes beïnvloeden. Om de complexiteit van miRNA-gebaseerde mechanismen te vergroten, kan een enkel mRNA worden gereguleerd door meerdere, verschillende miRNA's. Het is dus een uitdaging om te onderzoeken hoe miRNA-ontregeling de homeostatische balans van het lichaam verstoort en leidt tot menselijke maligniteit.
De meerderheid van de gepubliceerde studies hebben zich gericht op een enkel miRNA bij het karakteriseren van hun rol in ziektegebeurtenissen. ~30% van de menselijke miRNA-genen zijn echter georganiseerd in geclusterde eenheden (meestal ~ 10 kilobases [kb]) die vaak in dezelfde oriëntatie worden getranscribeerd en mede tot expressie worden gebracht, wat wijst op een gecoördineerd en complex systeem van niet-coderende RNA-regulatie6. De grootste polycistronische menselijke miRNA-cluster is de 14q32-cluster bestaande uit 54 miRNA-voorlopers. Een van de meest goed bestudeerde geclusterde miRNA-eenheden geassocieerd met menselijke kankers is de miR-17-92 polycistronische cluster bestaande uit miR-17, miR-18a, miR-19a, miR-20a, miR-19b-1 en miR-92-1 die zich bevinden in intron 3 van het niet-coderende RNA, c13orf25. De miR-17-92-cluster wordt vaak versterkt in hematopoietische maligniteiten en overexpressie in solide tumoren en heeft oncogene rollen vastgesteld bij het bevorderen van celcyclusprogressie, apoptose en angiogenese7. Bovendien wordt de tumorsuppressieve miR-15a- en miR-16-1-cluster in het intron van het niet-coderende gen Leu2 vaak verwijderd bij leukemieën en gedownreguleerd in een groot aantal kankers, waardoor tumorgroei wordt geblokkeerd door zich te richten op het antiapoptotische gen BCL2 en aanvullende celcyclusprogressiegenen8. De miR-888-cluster is verhoogd bij patiënten met hooggradige prostaatkanker en bestaat uit zeven miRNA-genen (miR-892c, -890, -888, -892a, -892b, -891b en -891a) op menselijk chromosoom Xq27.3 9,10.
De miR-888 cluster kaarten binnen de HPCX1 locus (Erfelijke Prostaatkanker, X-gebonden 1) verspreid over Xq27-2, die werd geïdentificeerd door koppelingsanalyse van erfelijke prostaatkanker familie stambomen 11,12,13,14,15,29. Functionele karakterisering van individuele miR-888 geclusterde leden met behulp van conventionele miRNA-misexpressietools - miRNA-mimics en antisense-remmers - gaf aan dat deze miRNA's overlappende rollen spelen bij het reguleren van prostaattumorgroei en invasie 9,10. Deze experimentele methoden lenen zich echter niet gemakkelijk om te bestuderen hoe meerdere miR-888 geclusterde leden synergetisch of antagonistisch werken in een niet-coderend RNA-netwerk om weefselhomeostase en kankerprogressie te beheersen. Dit beschreven gestroomlijnde protocol met behulp van crispr-genbewerkingstechnologie met hoge doorvoer wordt aangepast om miRNA-clusters geassocieerd met menselijke kankers (bijv. miR-888-cluster) moleculair te ontleden om deze kenniskloof te overbruggen.
Bacteriële CRISPR- en CRISPR-geassocieerde (cas) genen bemiddelen adaptieve immuniteit tegen bacteriofagen16. De ontdekking van dit oude procaryotische surveillancesysteem werd snel aangepast als een efficiënt wetenschappelijk hulpmiddel om gemakkelijk elke gewenste genomische locus aan te pakken en DNA-sequentieveranderingen aan te brengen binnen een groot aantal diersystemen en celtypen, zowel in vitro als in vivo16,17. Deze techniek is veelbelovend als een effectieve methode om miRNA-netwerken te ondervragen in de context van menselijke ziekten. Hiertoe is dit high-throughput CRISPR-genbewerkingsprotocol om het miR-888-cluster van ~ 35 kb op menselijk chromosoom X in onsterfelijk gemaakte menselijke prostaatkankercellijnen (LNCaP, PC3-ML) te bestuderen, geconstrueerd om te onderzoeken hoe clusterleden kankerprogressieroutes coördineren. Deze aanpak kan worden toegepast op het karakteriseren van elk miRNA-cluster en stelt onderzoekers in staat om snel menselijke cellijnen te genereren die de volledige miRNA-clusterdeletie en individuele en gecombineerde miRNA-genclusterdeleties binnen een enkel experiment dragen.
In deze procedure worden stabiele cellijnen vastgesteld met een doxycycline (DOX) -induceerbaar lentiviral expression-systeem dat de onderzoeker in staat stelt streptococcus pyogenes CRISPR-geassocieerde endonuclease Cas9 (csn1) genexpressie te controleren via de constitutieve DOX-induceerbare promotor TRE3G. Het Tet-On 3G bipartiete systeem omvat een constitutieve menselijke rekfactor 1 alfa (hEF1alpha) promotor om de transcriptie van zowel het Tet-On 3G gen als het blasticidin resistentie gen (BlastR) als een bicistronisch transcript aan te sturen. Het Tet-On 3G-transactivatoreiwit bindt alleen aan de TRE3G-promotor in aanwezigheid van DOX, wat resulteert in robuuste Cas9-transcriptie. Bij afwezigheid van DOX is er geen of zeer minimale basale Cas9-expressie. Daarom kan de onderzoeker een hoge Cas9-eiwitproductie induceren in cellen die zijn gekweekt in media aangevuld met DOX tijdens de CRISPR-genbewerkingsstappen en controle voor snelle CAS9-eiwitklaring bij DOX-terugtrekking.
Dit protocol beschrijft ook het ontwerp van synthetische CRISPR-RNA (crRNA) oligonucleotiden gericht op regio's die het hele miRNA-cluster flankeren, individuele miRNA-haarspeld (premiRNA) -regio's en / of subsets van miRNA-genen binnen het cluster. Elk ontworpen crRNA bevat een unieke 5'-terminale 20 nt gidssequentie (complementair aan de genomische sequentie van belang die moet worden gericht), gevolgd door een invariante 22 nt S. pyogenes repeat sequence (5'-XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX-GUUUUAGAGCUAUGCUGUUUUG-3') die base-pairing met het universele trans-activerende CRISPR RNA (tracrRNA) oligonucleotiden18 mogelijk maakt. Samen fungeren het gegloeide crRNA en tracrRNA (gemengde 1:1-verhouding) als gids-RNA voor dit protocol (figuur 1A). In elk experiment worden twee synthetische gids-RNA's getransfecteerd in DOX-geïnduceerde cellen om het bacteriële Cas9-eiwit te associëren en te escorteren naar de genomische DNA-sites (5 'en 3 ') die het miRNA-clustergebied flankeren dat is bedoeld voor verwijdering (figuur 1B).
Een protospacer adjacent motif (PAM) sequentie (5'-NGG-3' voor wild type S. pyogenes Cas9) moet aanwezig zijn in het celgenoom en zich direct naast de 20 nt DNA-sequentie bevinden waarop de gids RNA17 zich richt. De PAM-sequentie dient als een bindend signaal en positioneert het katalytische gebied van het endonuclease Cas9-enzym op de beoogde genomische DNA-site, wat vervolgens leidt tot gerichte, dubbelstrengs (ds) DNA-splitsing die zich ~ 3 nt stroomopwaarts van de PAM bevindt. De DNA-reparatiemachines van de cel repareren de gespleten DNA-uiteinden, wat kan resulteren in perfecte ligatie, maar vaak treedt niet-homologe eindverbinding (NHEJ) op, waardoor kleine inserties of deleties (indels) op de reparatielocatie ontstaan. Omdat miRNA's niet-coderende genen zijn die zich vaak in intergene en intronische regio's bevinden, hebben deze indels een laag risico op het creëren van ongewenste onzin / missense-mutaties.
Door synthetische RNA-oligonucleotiden (gegloeid crRNA en tracrRNA, 1:1 molaire ratio) te gebruiken die coderen voor het gids-RNA-complex in deze experimenten, vermijdt deze gen knock-outstrategie tijdrovende DNA-vectorsubcloning en zorgt voor enorme flexibiliteit bij het transfecteren van unieke gids-RNA-combinaties naar cellen in een 24-well-formaat. Voorbereiding van ruwe cellysaten voor PCR-genotypescreening vermijdt ook dure en tijdrovende DNA-zuiveringsmethoden, terwijl gestroomlijnde cellijngeneratie van één kolonie en fenotypische analyse mogelijk is. Inderdaad, dit high-throughput CRISPR-genbewerkingsprotocol is met succes gebruikt om gekweekte prostaatkankercellijnen (LNCaP, PC3-ML) te transfecteren met 32 unieke gids-RNA-combinaties in één experiment en knock-outlijnen te genereren die deleties dragen voor het hele clustergebied van ~ 35 kb miR-888; kleinere deletiecombinaties voor miR-888 clusterleden die behoren tot de miR-743- en miR-891a-families; evenals deleties voor individuele miRNA-leden binnen het miR-888-cluster. Studies zoals deze zullen een duidelijker onderschatting geven van hoe geclusterde miRNA's samenwerken om tumorgroei, agressiviteit en medicijnresistentie te reguleren voordat miRNA's naar de kliniek worden vertaald als therapeutische en diagnostische hulpmiddelen.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.2 mL PCR tubes, flat cap</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>14-230-225</td>
			<td>Plasticware</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL Microcentrifuge Tubes</td>
			<td>Seal-Rite</td>
			<td>1615-5500</td>
			<td>Plasticware</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well tissue culture plate</td>
			<td>Corning Costar</td>
			<td>&#160;09761146</td>
			<td>Plasticware</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5x Phusion HF Buffer</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>F-518L</td>
			<td>PCR reagent, genotyping</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well tissue culture plate</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>FB012927</td>
			<td>Plasticware</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well tissue culture plate</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>08-772-2C</td>
			<td>Plasticware</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-CRISPR-Cas9 antibody [7A9-3A3], Mouse monoclonal</td>
			<td>AbCam</td>
			<td>ab191468</td>
			<td>Western blot reagent; 160 kDa; dilution 1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic-Antimycotic (100x)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15240062</td>
			<td>Tisuue culture reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BLAST nucleotide search engine</td>
			<td>National Center for Biotechnology Information</td>
			<td>NA</td>
			<td>Freeware; website: blast.ncbi.nlm.nih.gov</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blasticidin S, Hydrochloride, Streptomyces griseochromogenes</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td>CAS 589205</td>
			<td>CRISPR reagent; Chemical, Working stock = 1 mg/mL in water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Countess 3 Automated Cell Counter</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A50298</td>
			<td>Equipment; Cell counter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryogenic tubes</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>50001012</td>
			<td>Plasticware</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dharmacon CRISPR Design Tool</td>
			<td>Horizon Discovery Ltd.</td>
			<td>NA</td>
			<td>Freeware; website: horizondiscovery.com/en/ordering-and-calculation-tools/crispr-dna-region-designer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DharmaFECT siRNA Transfection Reagent #2</td>
			<td>Dharmacon, Inc.</td>
			<td>T-2002-02</td>
			<td>Transfection reagent; LNCaP and PC3-ML cell lines</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>&#160;BP231100</td>
			<td>Tisuue culture reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM Medium with L-Glutamine, 4.5g/L Glucose and Sodium Pyruvate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>MT10013CV</td>
			<td>Tisuue culture reagent; Media for PC3-ML cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Doxycycline Hydrochloride, Ready Made Solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D3072-1ML</td>
			<td>CRISPR reagent; Chemical, Working stock = 1 mg/mL stock in water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS, no calcium, no magnesium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190144</td>
			<td>Tisuue culture reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Edit-R CRISPR-Cas9 Synthetic tracrRNA, 20 nmol, designed</td>
			<td>Dharmacon, Inc.</td>
			<td>U-002005-20</td>
			<td>CRISPR reagent; Universal tracrRNA oligonucleotides</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Edit-R Modified Synthetic crRNA, 
			desalted/deprotected, 2 nmol</td>
			<td>Dharmacon, Inc.</td>
			<td>crRNA-460XXX</td>
			<td>CRISPR reagent; Designed crRNA oligonucleotides</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EditR Inducible Lentiviral hEF1aBlastCas9 Nuclease Particles, 50 &#956;L, 107 TU/mL</td>
			<td>Dharmacon, Inc.</td>
			<td>VCAS11227</td>
			<td>CRISPR reagent; Lenti-iCas9; Doxycycline-inducible lentiviral Streptococcus pyogenes Cas9 vector system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ensembl genomic viewer</td>
			<td>Ensembl</td>
			<td>NA</td>
			<td>Freeware; website: [ensembl.org] Use: Genome browser to identify a nucleotide seuqnces containing the miRNA cluster and surrounding gene/regulatory sequences.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GAPDH Antibody (FL-335), rabbit polyclonal</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc25778</td>
			<td>Western blot reagent; 37 kDa; dilution 1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel/PCR DNA Fragment Extraction Kit</td>
			<td>IBI Scientific</td>
			<td>IB47010</td>
			<td>Nucleic acid gel electrophoresis reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco Fetal Bovine Serum, certified</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>16000044</td>
			<td>Tisuue culture reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hexadimethrine bromide</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>H9268</td>
			<td>CRISPR reagent; Chemical, Working stock = 0.8 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immobilon-FL PVDF Membrane</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>IPFL10100</td>
			<td>Western blot reagent; nitrocellulose</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Intercept (TBS) Blocking Buffer</td>
			<td>LI-COR</td>
			<td>927-60001</td>
			<td>Western blot reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IRDye 680RD Goat anti-Mouse IgG Secondary Antibody</td>
			<td>LI-COR</td>
			<td>926-68070</td>
			<td>Western blot reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IRDye 800CW Goat anti-Rabbit IgG Secondary Antibody</td>
			<td>LI-COR</td>
			<td>926-32211</td>
			<td>Western blot reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>&#160;5425 R</td>
			<td>Plasticware</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>miRBase microRNA viewer</td>
			<td>miRBase</td>
			<td>NA</td>
			<td>Freeware; website: [mirbase.org] Use: Borowser lists all annotated miRNA hairpins, mature miRNA sequences and associated clustered miRNAs mapping within 10 kb.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NuPAGE 4 to 12%, Bis-Tris, 1.0 mm, Mini Protein Gel, 10-well</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>NP0321BOX</td>
			<td>Western blot reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Odyssey CLx Imaging System</td>
			<td>LI-COR</td>
			<td>CLx</td>
			<td>Equipment; Western blot imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM Reduced Serum Medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>31985062</td>
			<td>Transfection reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Owl D2 Wide-Gel Electrophoresis System</td>
			<td>Owl</td>
			<td>D2-BP</td>
			<td>Equipment; Nucleic acid gel electrophoresis system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR Primers, designed (single-stranded DNA oligonucleotides)</td>
			<td>Integrated DNA Technology</td>
			<td>NA</td>
			<td>PCR reagent, genotyping</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phusion High-Fidelity DNA Polymerase (2 U/&#181;L)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>F530S</td>
			<td>PCR reagent, genotyping</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RIPA Lysis Buffer 10x</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>20-188</td>
			<td>Western blot reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K Solution (20 mg/mL), RNA grade</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>25530049</td>
			<td>PCR reagent, genotyping</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase A, DNase and protease-free (10 mg/mL)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>EN0531</td>
			<td>PCR reagent, genotyping</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640 Medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>MT10041CV</td>
			<td>Tisuue culture reagent; Media for LNCaP cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SnapGene Viewer</td>
			<td>Snap Gene</td>
			<td>NA</td>
			<td>Freeware; website: [snapgene.com]&#160;Use: DNA sequence annotation software program to create a DNA file for gRNA design and which&#160; highlights the miRNA cluster locus (intergenic, intronic), each individual miRNA hairpin sequence belonging to the miRNA cluster, and other nearby coding and non-coding genes and/or regulatory features</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE Select Enzyme (1x), no phenol red</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12563029</td>
			<td>Tisuue culture reagent; Recombinant trypsin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure Agarose</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>16500100</td>
			<td>Nucleic acid gel electrophoresis reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Veriti 96-Well Fast Thermal Cycler</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>4375305</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XCell SureLock Mini-Cell Electrophoresis System</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>EI0001</td>
			<td>Equipment; Protein gel electrophoresis system</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

crispr gene editing tool for microrna cluster network analysis

MicroRNA's (miRNA's) zijn naar voren gekomen als belangrijke cellulaire regulatoren (tumoronderdrukkers, pro-oncogene factoren) van kanker en metastase. De meeste gepubliceerde studies richten zich op een enkel miRNA bij het karakteriseren van de rol van kleine RNA's bij kanker. ~30% van de menselijke miRNA-genen zijn echter georganiseerd in geclusterde eenheden die vaak co-expressie zijn, wat wijst op een complex en gecoördineerd systeem van niet-coderende RNA-regulatie. Een duidelijker onderschatting van hoe geclusterde miRNA-netwerken samenwerken om tumorgroei, kankeragressiviteit en medicijnresistentie te reguleren, is vereist voordat niet-coderende kleine RNA's naar de kliniek worden vertaald.
Het gebruik van een high-throughput geclusterde regelmatig interspaced short palindromic repeats (CRISPR)-gemedieerde genbewerkingsprocedure is gebruikt om de oncogene rol van een genomisch cluster van zeven miRNA-genen te bestuderen binnen een locus met een lengte van ~ 35.000 bp in de context van prostaatkanker. Voor deze aanpak werden menselijke kankercellijnen geïnfecteerd met een lentivirusvector voor doxycycline (DOX)-induceerbare Cas9-nuclease gekweekt in DOX-bevattend medium gedurende 48 uur. De cellen werden vervolgens getransfecteerd met synthetisch trans-activerend CRISPR-RNA (tracrRNA) gecomplexeerd met genomische site-specifieke CRISPR-RNA (crRNA) oligonucleotiden om de snelle generatie van kankercellijnen mogelijk te maken die de volledige miRNA-clusterdeletie en individuele of gecombineerde miRNA-genclusterdeleties binnen een enkel experiment dragen.
De voordelen van dit high-throughput genbewerkingssysteem zijn de mogelijkheid om tijdrovende DNA-vectorsubcloning te vermijden, de flexibiliteit bij het transfecteren van cellen met unieke gids-RNA-combinaties in een 24-well-formaat en de goedkopere PCR-genotypering met behulp van ruwe cellysaten. Studies die deze gestroomlijnde aanpak gebruiken, beloven functionele redundanties en synergetische / antagonistische interacties tussen miRNA-clusterleden te ontdekken, wat zal helpen bij het karakteriseren van de complexe kleine niet-coderende RNA-netwerken die betrokken zijn bij menselijke ziekten en beter informeren over toekomstig therapeutisch ontwerp.

Dit crispr-deletieprotocol met hoge doorvoer werd met succes gebruikt met behulp van transfectie van Cas9-induceerbare LNCaP- en PC3-ML-menselijke kankercellijnen met synthetische oligonucleotidegids RNA's gericht op het miR-888-cluster, die werden bestudeerd in de context van prostaatkanker. Het miR-888-cluster werd aanvankelijk geïdentificeerd in een expressieprofileringsscherm als verhoogd bij prostaatkankerpatiënten met een hooggradige ziekte in vergelijking met laaggradige en niet-kankerpat...

Watch this Scientific Journal Video about CRISPR Gene Editing Tool for MicroRNA Cluster Network Analysis at JoVE.com

CRISPR Gene Editing Tool for MicroRNA Cluster Network Analysis

Dit protocol beschrijft een high-throughput clustered regular interspaced short palindromic repeats (CRISPR) genbewerkingsworkflow voor microRNA-clusternetwerkanalyse die de snelle generatie van een panel van genetisch gemodificeerde cellijnen met unieke miRNA-clusterliddeletiecombinaties zo groot als 35 kb binnen een enkel experiment mogelijk maakt.

CRISPR Gene Editing Tool voor MicroRNA Cluster Network Analyse

MicroRNAs (miRNAs) have emerged as important cellular regulators (tumor suppressors, pro-oncogenic factors) of cancer and metastasis. Most published ...

Dit protocol maakt gebruik van een crispr-genbewerkingsworkflow met hoge doorvoer om micro-RNA-genen georganiseerd en geclusterd te ontleden. En om te bepalen hoe deze niet-coderende RNA-netwerken de progressieroutes van kanker coördineren. Deze CRISPR-genbewerkingsprocedure stelt de onderzoeker in staat om snel een heel panel van cellijnen te genereren met unieke micro-RNA-clusterdeletiecombinaties, terwijl tijdrovende DNA-vectorsubklonen wordt vermeden.Deze methode zal een duidelijker inzicht geven in hoe geclusterde micro-RNA's samenwerken om tumorgroei, agressiviteit en medicijnresistentie te reguleren voordat micro-RNA's in de kliniek worden vertaald als therapeutische en diagnostische hulpmiddelen. De procedure wordt gedemonstreerd door Grace Yi, een onderzoeksassistent in mijn laboratorium. Maak om te beginnen een DNA-bestand met de volledige genomische sequentie van het micro-RNA-clustergebied van belang in ten minste één kilobytes van de omliggende genomische regio's met behulp van een DNA-sequentie-annotatiesoftwareprogramma.Ontwerp vervolgens vier unieke CRISPR-RNA's voor elke beoogde micro-RNA-locus. Twee ontworpen CRISPR-RNA's om zich onmiddellijk te richten op complementaire DNA-sequenties vijf prime van de micro-RNA-haarspeldcluster en twee ontworpen CRISPR-RNA's om complementaire DNA-sequenties onmiddellijk drie prime van de micro-RNA-haarspeldcluster te targeten. Gebruik een functiebewerkingstool in het gemaakte DNA-bestand om de DNA-doelsequentie te markeren voor elk ontworpen CRISPR-RNA dat moet worden gesynthetiseerd.Ontworpen en gesynthetiseerde PCR-primers die de beoogde micro-RNA-clustergebieden flankeren voor genotypering van CRISPR-cellijnen. Voer een doxycyclineconcentratiecurve uit op nieuw gegenereerde lenti-induceerbare Cas9-cellijnen om de optimale omstandigheden voor Cas9-eiwitinductie te bepalen. Plaat vijf keer 10 van de vierde cellen per put van elke zes putplaat en groeit bij 37 graden Celsius, 5% koolstofdioxide, in het gewenste medium gedurende 24 uur.Verdun dox in het gewenste medium met een uiteindelijke doxconcentratiecurve variërend van 0 5100, 150, 250 tot 500 nanogram per milli liter. Label de putten van elke zittende zes putplaat van één tot zes. Verwijder het medium en vervang door de juiste doxconcentraties.Kweekplaten één tot vier tot 24 uur, 48 uur en 72 uur dox-inductie en 120 uur na dox-terugtrekking. Oogst de putten van de plaat op elk tijdstip. Verwerk de celpellets en ripabuffer voor lysaatisolatie.Voer western blot-analyse uit met 40 microgram eiwit om Cas9-eiwitinductie te meten en de optimale Cas9-concentratie te bepalen. Breng op papier de vijf priem- en drie prime CRISPR-RNA-paarcombinaties in kaart die in elke put van een 24-putplaat worden getransecteerd die gericht is op het hele micro-RNA-cluster, verschillende geclusterde micro-RNA-gencombinaties en individuele micro-RNA-clusterleden. Plaat de lenti induceerbare gegoten negen cellijn op vijf maal 10 tot de vierde cellen per put van een 24 putplaat in het voorkeursmedium met de geoptimaliseerde doxconcentratie.Laat de cellen 24 tot 48 uur groeien bij 37 graden Celsius, 5% koolstofdioxide om Cas9-eiwitexpressie te induceren. Transfecteer de lenti induceerbare Cas9-cellen met een voorbereide vijf priem- en drie priemgeleidings-RNA's. Label vier microcentrifugebuizen van 1,5 milliliter per beoogde micro-RNA-locus.Meng in elke buis één op één molaire verhouding van tracer-RNA en unieke CRISPR-RNA's samen om het twee micromolaire gids-RNA-complex te vormen. Voeg 2,5 microliter tracer-RNA, 1,25 microliter van de vijf primair gepositioneerde CRISPR-RNA, 1,25 microliter van de drie prime gepositioneerde CRISPR-RNA en vijf microliter 10 millilar tris hcl pH 7,5 buffer toe aan een centrifugebuis van 1,5 milliliter. Microcentrifuge gedurende 30 seconden op 16.000 maal G om te mengen.Incubeer bij kamertemperatuur gedurende vijf minuten. Aan elke buis bij 40 microliter gereduceerd serummedium tot de 10 microliter gids-RNA-complexreactie. Meng voorzichtig door op en neer te pipetteren.Meng in een schone centrifugebuis van 1,5 milliliter twee microliter van het transfectieregens en 48 microliter gereduceerd serummedium voorzichtig door op en neer te pipetteren. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende vijf minuten. Voeg aan elke buis die de 50 microliter geleidings-RNA-mix bevat, de 50 microliter van het verdunde transfectiereagens toe.Pipetteer het mengsel langzaam op en neer om te mengen. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 20 minuten. Voeg 400 microliter antibioticumvrij medium aangevuld met doxycycline toe aan elke buis die de 100 microliter van de gids-RNA-transfectiemix bevat.Pipetteer voorzichtig om te mengen. Verwijder het medium uit de door doxycycline geïnduceerde lenti induceerbare Cas9-cellen. Voeg 500 microliter media-doxycycline geleidings-RNA-transformatiemix toe op basis van de experimentele kaart met 24 putplaten.Incubeer de getransfecteerde cellen gedurende 48 uur bij 37 graden Celsius in 5% koolstofdioxide. Vervang het medium door het vers bereide medium zonder doxycycline. Laat de cellen nog 24 tot 48 uur herstellen bij 37 graden Celsius en 5% koolstofdioxide.Oogst de getransfecteerde cellen en bereid je voor op genotypering en eencellige wanen. Scheid de 150 microliter geresuspendeerde cellen in drie delen. Vries een derde van de getransfecteerde cellen in medium plus 10% DMSO in cryoflacons voor langdurige opslag.Breng een derde van de getransfecteerde cellen over in een schone PCR-buis van 0,2 milliliter voor genotypering. Bereid het laatste derde deel van de getransfecteerde cellen voor op tellen en verdunning in een plaatformaat van 96 putten om eencellige kolonies te genereren. Gebruik een 12-kanaals multipipeter en een steriel reagensreservoir en voeg voor elke verdunning 100 microliter verdunde cellen per put toe aan twee rijen van de plaat.Laat de cellen vier tot zes weken groeien tot cofluency voor eencellige kolonie-uitbreiding. Verzamel ongeveer 10 tot 15 eencellige kolonies voor genotypering. Identificeer ten minste drie onafhankelijke knock-out eencellige kolonielijnen voor elke beoogde micro-RNA-locus.Behoud wildtypelijnen met één cel als besturingselementen. Resuspend was de celpellet in vier microliter van vijf X DNA-polymerasebuffer, één microliter proteïnase K, één microliter RNase A en nucleasevrij water tot een totaal volume van 20 microliter. Luizen de cellen in de thermo cycler bij 56 graden Celsius gedurende 30 minuten en 96 graden Celsius gedurende vijf minuten.Bewaar de cellysaten bij min 20 graden Celsius totdat ze klaar zijn voor PCR-genotypering. Voer een PCR-genotyperingsreactie uit met behulp van de ontworpen PCR-primers die de geleide-RNA vijf prime- en drie prime guide-RNA-doellocaties flankeren. Voer de PCR-reactie uit in een thermocycler met behulp van het programma dat in het tekstmanuscript wordt vermeld.Laad de PCR-producten op een 1% agarose-gel voor elektroforeseanalyse. Extraheer DNA uit de geïsoleerde PCR-fragmenten van de voorspelde moleculaire grootte voor de knock-out genotypen. Bereid de monsters voor op DNA-sequencing.Valideer dat de CRISPR-reactie succesvol was en voer DNA-sequencing uit van de geïsoleerde PCR-fragmenten om de Cas9-splitsingsplaats te identificeren en de micro-RNA-locusdeletie te bevestigen. Er werden unieke CRISPR RNA's ontworpen die gericht waren op de gehele 35 kilo zware basen miR-888 clusterregio. Kleinere clustercombinaties binnen de miR-743-familie of de miR-891-familie en micro-RNA-deleties.Gel-elektroforeseanalyse van de PCR-reacties gaf aan dat de voorspelde DNA-fragmentgrootte die het knock-outgenotype vertegenwoordigt, werd versterkt voor elke CRISPR-transfectie. Eencellige kolonies werden gegenotypeerd door PCR in volgorde geverifieerd. DNA-sequencing van deze geïsoleerde knock-out PCR-fragmenten bevestigde dat de getransfecteerde vijf priem- en drie prime guide RNA's Cas9-splitsingsligatie ongeveer drie nucleotide stroomopwaarts van de PAM-sites stuurden en genomisch verlies van de beoogde micro-RNA-locus valideerden.WST-1 proliferatietests die miR-891a knock-out en wild type cellen vergelijken, bevestigen dat overexpressie van micro-RNA nabootsing lentivirale vector prostaatcelgroei induceert en daarom werd voorspeld dat miR-891 een verlies zou vertonen wederkerige effecten. Naast een zorgvuldig gids-RNA-ontwerp is het belangrijk om snel enkelvoudige celkolonies te genereren via elke micro-RNA knock-outlijn. Het is vooral relevant als de micro-RNA knock-outcellen de groei van de levensvatbaarheid hebben verminderd en gemakkelijk zouden worden weggeconcurreerd in gemengde populaties met wildtype cellen.Aanvullende methoden zoals kwantitatieve realtime PCR, northern blot en RNA-sequencing moeten worden uitgevoerd om te bevestigen dat de CRISPR knock-out cellijnen geen volwassen micro-RNA tot expressie brengen voor de verwijderde locus.

Research

JoVE Journal

Biology

Microarray Analysis for Saccharomyces cerevisiae

Microarray Analysis for Saccharomyces cerevisiae

Microarray analyse voor Saccharomyces cerevisiae</em

In this protocol, gene expression in yeast (Saccharomyces cerevisiae) is changed after exposure to oxidative stress induced by the addition of hydrogen ...

Using SecM Arrest Sequence as a Tool to Isolate Ribosome Bound Polypeptides

Met behulp van SecM Arrestatie sequentie als een Tool om Ribosoom Bound Polypeptiden Isoleer

Extensive research has provided ample evidences suggesting that protein folding in the cell is a co-translational process1-5. However, the exact pathway ...

Analysis of Autophagy in Penicillium chrysogenum by Using Starvation Pads in Combination With Fluorescence Microscopy

Analysis of Autophagy in Penicillium chrysogenum by Using Starvation Pads in Combination With Fluorescence Microscopy

Analyse van autofagie in<em&gt; Penicillium chrysogenum</em&gt; Door gebruikmaken van uithongering pads in combinatie met fluorescentiemicroscopie

The study of cellular quality control systems has emerged as a highly dynamic and relevant field of contemporary research. It has become clear that cells ...

Silencing the Spark: CRISPR/Cas9 Genome Editing in Weakly Electric Fish

Uitschakeling van de vonk: CRISPR/Cas9 genoom bewerken in zwak elektrische vis

Electroreception and electrogenesis have changed in the evolutionary history of vertebrates. There is a striking degree of convergence in these ...

Pupal and Adult Injections for RNAi and CRISPR Gene Editing in Nasonia vitripennis

Pupal and Adult Injections for RNAi and CRISPR Gene Editing in Nasonia vitripennis

Pupal en volwassen injecties voor RNAi en CRISPR Gen editing in Nasonia vitripennis

The jewel wasp, Nasonia vitripennis, has become an efficient model system to study epigenetics of haplo-diploid sex determination, B-chromosome biology, ...

TGF-&#946;-mediated Endothelial to Mesenchymal Transition (EndMT) and the Functional Assessment of EndMT Effectors using CRISPR/Cas9 Gene Editing

TGF-ÃƒÅ½Ã‚Â²-mediated Endothelial to Mesenchymal Transition EndMT and the Functional Assessment of EndMT Effectors using CRISPR/Cas9 Gene Editing

TGF-β-gemedieerde Endotheel naar Mesenchymal Transition (EndMT) en de functionele beoordeling van EndMT-effectoren met crispr/cas9 genbewerking

In response to specific external cues and the activation of certain transcription factors, endothelial cells can differentiate into a mesenchymal-like ...

In Vitro Analysis of E3 Ubiquitin Ligase Function

In Vitro Analysis of E3 Ubiquitin Ligase Function

In vitro Analyse van E3 Ubiquitine Ligase Functie

The covalent attachment of ubiquitin (Ub) to internal lysine residue(s) of a substrate protein, a process termed ubiquitylation, represents one of the ...

CRISPR/Cas9 Gene Editing of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells for Gene Therapy Applications

CRISPR/Cas9-genbewerking van hematopoietische stam- en voorlopercellen voor gentherapietoepassingen

CRISPR/Cas9 is a highly versatile and efficient gene-editing tool adopted widely to correct various genetic mutations. The feasibility of gene ...

Embryo Injection Technique for Gene Editing in the Black-Legged Tick, Ixodes scapularis

Embryo Injection Technique for Gene Editing in the Black-Legged Tick, Ixodes scapularis

Embryo-injectietechniek voor genbewerking in de zwartpootteek, Ixodes scapularis

Ticks can transmit various viral, bacterial, and protozoan pathogens and are therefore considered vectors of medical and veterinary importance. Despite ...

Protocols for CRISPR/Cas9 Mutagenesis of the Oriental Fruit Fly Bactrocera dorsalis

Protocols for CRISPR/Cas9 Mutagenesis of the Oriental Fruit Fly Bactrocera dorsalis

Protocollen voor CRISPR/Cas9 Mutagenese van de Oosterse Fruitvlieg Bactrocera dorsalis

The Oriental fruit fly, Bactrocera dorsalis, is a highly invasive and adaptive pest species that causes damage to citrus and over 150 other fruit crops ...