Name: crispr gene editing tool for microrna cluster network analysis
Uploaded: 2022-04-25T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about CRISPR Gene Editing Tool for MicroRNA Cluster Network Analysis at JoVE.com

PC3-ML-Zelllinien wurden freundlicherweise von Mark Stearn (Drexel University College of Medicine) zur Verfügung gestellt. Justin Toxey half bei der PCR-Genotypisierung. Diese Arbeit wurde durch einen Zuschuss der Breedan Adams Foundation, einen Ryan Translational Research Fund und einen Zuschuss des Commonwealth Health Research Board (CHRB-274-11-20) an AE-K unterstützt.

1. Vorbereitung für die CRISPR-Genbearbeitung und das RNA-Leitdesign zur Generierung von miRNA-Cluster-Knockout-Zelllinien
<ol><li>Erstellen Sie eine DNA-Datei, die die vollständige genomische Sequenz der interessierenden miRNA-Clusterregion (intergen, intronic) und mindestens 1 kB der umgebenden genomischen Regionen enthält, indem Sie eine DNA-Sequenz-Annotationssoftware19 verwenden.<ol><li>Verwenden Sie ein Feature-Editing-Tool in der erstellten DNA-Datei,...

<ol>
	<li>Hasegawa, T., Lewis, H., Esquela-Kerscher, A., Laurence, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Translating MicroRNAs to the Clinic. , 329-369 (2017).</li><li>Lewis, H., Esquela-Kerscher, A., Thiagalingam, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Systems Biology of Cancer. , 134-153 (2015).</li><li>Esquela-Kerscher, A., Slack, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oncomirs+-+microRNAs+with+a+role+in+cancer.">Oncomirs - microRNAs with a role in cancer.</a> Nature Reviews Cancer. 6 (4), 259-269 (2006).</li><li>Breving, K., Esquela-Kerscher, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+complexities+of+microRNA+regulation:+mirandering+around+the+rules.">The complexities of microRNA regulation: mirandering around the rules.</a> The International Journal of Biochemistry &amp; Cell Biology. 42 (8), 1316-1329 (2010).</li><li>Griffiths-Jones, S., Saini, H. K., van Dongen, S., Enright, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=miRBase:+tools+for+microRNA+genomics.">miRBase: tools for microRNA genomics.</a> Nucleic Acids Research. 36, 154-158 (2008).</li><li>Kabekkodu, S. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clustered+miRNAs+and+their+role+in+biological+functions+and+diseases.">Clustered miRNAs and their role in biological functions and diseases.</a> Biological Reviews. 93 (4), 1955-1986 (2018).</li><li>Xiang, J., Wu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Feud+or+friend?+The+role+of+the+miR-17-92+cluster+in+tumorigenesis.">Feud or friend? The role of the miR-17-92 cluster in tumorigenesis.</a> Current Genomics. 11 (2), 129-135 (2010).</li><li>Aqeilan, R. I., Calin, G. A., Croce, C. 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M., Camp, N. J., Swensen, J., Tavtigian, S. V., Albright, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Confirmation+of+the+HPCX+prostate+cancer+predisposition+locus+in+large+Utah+prostate+cancer+pedigrees.">Confirmation of the HPCX prostate cancer predisposition locus in large Utah prostate cancer pedigrees.</a> Human Genetics. 116 (3), 179-185 (2005).</li><li>Brown, W. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hereditary+prostate+cancer+in+African+American+families:+linkage+analysis+using+markers+that+map+to+five+candidate+susceptibility+loci.">Hereditary prostate cancer in African American families: linkage analysis using markers that map to five candidate susceptibility loci.</a> British Journal Of Cancer. 90 (2), 510-514 (2004).</li><li>Bochum, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Confirmation+of+the+prostate+cancer+susceptibility+locus+HPCX+in+a+set+of+104+German+prostate+cancer+families.">Confirmation of the prostate cancer susceptibility locus HPCX in a set of 104 German prostate cancer families.</a> Prostate. 52 (1), 12-19 (2002).</li><li>Doudna, J. A., Charpentier, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+editing.+The+new+frontier+of+genome+engineering+with+CRISPR-Cas9.">Genome editing. The new frontier of genome engineering with CRISPR-Cas9.</a> Science. 346 (6213), 1258096 (2014).</li><li>Adli, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+CRISPR+tool+kit+for+genome+editing+and+beyond.">The CRISPR tool kit for genome editing and beyond.</a> Nature Communications. 9 (1), (2018).</li><li>Jinek, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+programmable+dual-RNA+guided+DNA+endonuclease+in+adaptive+bacterial+immunity.">A programmable dual-RNA guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity.</a> Science. 337 (6096), 816-821 (2012).</li><li>. SnapGene&#174; software (from Insightful Science; available at snapgene.com) Available from: <a target="_blank" href="https://www.snapgene.com">https://www.snapgene.com</a> (2022)</li><li>. Ensembl Release 104 genome browser (from EMBL-EBI) Available from: <a target="_blank" href="https://www.ensembl.org">https://www.ensembl.org</a> (2022)</li><li>Howe, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ensembl+2021.">Ensembl 2021.</a> Nucleic Acids Research. 49, 884-891 (2021).</li><li>. miRBase: the microRNA database, Release 22.1 (from Griffiths-Jones laboratory) Available from: <a target="_blank" href="https://www.mirbase.org">https://www.mirbase.org</a> (2022)</li><li>. Dharmacon CRISPR Design Tool (from Dharmacon) Available from: <a target="_blank" href="https://www.horizondiscovery.com/en/ordering-and-calculation-tools/crispr-dna-region-designer">https://www.horizondiscovery.com/en/ordering-and-calculation-tools/crispr-dna-region-designer</a> (2022)</li><li>. Off-Spotter (Venetia Pliatsika &amp; Isidore Rigoutsos of the Jefferson Computational Medicine Center) Available from: <a target="_blank" href="https://cm.jefferson.edu/Off-Spotter/">https://cm.jefferson.edu/Off-Spotter/</a> (2022)</li><li>Bao, X. R., Pan, Y., Lee, C. M., Davis, T. H., Bao, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tools+for+experimental+and+computational+analyses+of+off-target+editing+by+programmable+nucleases.">Tools for experimental and computational analyses of off-target editing by programmable nucleases.</a> Nature Protocols. 16 (1), 10-26 (2021).</li><li>. Dharmacon DharmaFECT Transfection Reagent Cell Type Guide. Choose Dharmacon DharmaFECT 1, 2, 3, or 4 for optimal transfection of siRNA or miRNA reagents Available from: <a target="_blank" href="https://horizondiscovery.com/-/media-Files/Horizon/resources/Selection-guides/dharmafect-cell-type-guidelines.pdf">https://horizondiscovery.com/-/media-Files/Horizon/resources/Selection-guides/dharmafect-cell-type-guidelines.pdf</a> (2022)</li><li>Baffoe-Bonnie, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+major+locus+for+hereditary+prostate+cancer+in+Finland:+localization+by+linkage+disequilibrium+of+a+haplotype+in+the+HPCX+region.">A major locus for hereditary prostate cancer in Finland: localization by linkage disequilibrium of a haplotype in the HPCX region.</a> Human Genetics. 117 (4), 307-316 (2005).</li><li>Zhang, R., Peng, Y., Wang, W., Su, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+evolution+of+an+X-linked+microRNA+cluster+in+primates.">Rapid evolution of an X-linked microRNA cluster in primates.</a> Genome Research. 17 (5), 612-617 (2007).</li><li>Ohnuki, Y., Marnell, M. M., Babcock, M. S., Lechner, J. F., Kaighn, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromosomal+analysis+of+human+prostatic+adenocarcinoma+cell+lines.">Chromosomal analysis of human prostatic adenocarcinoma cell lines.</a> Cancer Research. 40 (3), 524-534 (1980).</li><li>Beheshti, B., Karaskova, J., Park, P. C., Squire, J. A., Beatty, B. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+high+frequency+of+chromosomal+rearrangements+in+the+centromeric+regions+of+prostate+cancer+cell+lines+by+sequential+giemsa+banding+and+spectral+karyotyping.">Identification of a high frequency of chromosomal rearrangements in the centromeric regions of prostate cancer cell lines by sequential giemsa banding and spectral karyotyping.</a> Molecular Diagnosis. 5 (1), 23-32 (2000).</li></ol>

Dieses CRISPR-Gen-Editing-Verfahren ermöglicht es dem Forscher, schnell ein ganzes Panel von Zelllinien zu generieren, die einzigartige miRNA-Cluster-Deletionskombinationen tragen. Die Transfektion von synthetischen Leit-RNAs, die aus 5'- und 3'-genomischen stellenspezifischen crRNAs bestehen, die mit synthetischer TracrRNA (1:1-Molverhältnis) in diesem Protokoll geglüht sind, vermeidet zeitaufwändiges Plasmidvektor-Subklonen und ermöglicht ein flexibleres und hochdurchsatzorientiertes experimentelles Design mit ein...

Bessere Forschungsinstrumente sind erforderlich, um den Beitrag nicht-kodierender RNAs bei menschlichen Krankheiten zu untersuchen. MiRNA-Dysregulation wird häufig bei menschlichen Erkrankungen wie Krebs beobachtet, wenn die Expressionsprofile dieser kleinen nicht-kodierenden RNAs in den Geweben und Körperflüssigkeiten (z. B. Blut, Urin) von Krebspatienten mit Nicht-Krebspatienten, gesunden Personen, unter Verwendung von Microarrays, quantitativer Echtzeit-PCR (qRT-PCR) und Tiefensequenzierungstechnologien der nächsten Generation verglichenwerden 1,2 . Jüngste Arbeiten haben eine große Teilmenge dieser miRNAs als Tumorsuppressor-, onkogene und Metastasenfaktoren charakterisiert, die die Tumorbildung, das Fortschreiten der Krankheit und die Arzneimittelresistenz kontrollieren. Experimentelle Überexpression und/oder Herunterregulierung/Verlust von miRNAs führen zu funktionellen und pleiotropen Konsequenzen in der Zelle, die das breite Spektrum der krebsassoziierten Aktivitäten widerspiegeln, die diese nicht-kodierenden RNAs koordinieren - Wachstum, Apoptose, Differenzierung, Chromatin-Remodeling, Angiogenese, epitheliale zu mesenchymale (EMT) und MET-Übergänge, Metabolismus und Immunantwort3.
MiRNAs werden als einzelne Gene kodiert oder befinden sich in genomischen Clustern, die im Zellkern transkribiert und umfassend verarbeitet werden, bevor sie die biologisch ausgereiften, einzelsträngigen ~ 22 Nukleotid (nt) miRNA-Spezies erzeugen, die im Zytoplasmalokalisiert sind 4. Diese kleinen RNAs üben ihre Wirkung posttranskriptionell aus und fungieren als negative Genregulatoren, die sequenzspezifisch an Boten-RNA (mRNA)-Ziele binden, um den katalytischen RNA-induzierten Silencing-Komplex (RISC) an die mRNA-Stelle zu bringen, was zu einem mRNA-Abbau und/oder einem Block in der Proteintranslation führt. MiRNAs sind eine extrem häufige Klasse von nicht-kodierenden RNAs in tierischen Systemen, und 2.654 reife miRNAs existieren im menschlichen Genom (miRBase release 22.1)5. MiRNAs assoziieren typischerweise mit unvollständiger Komplementarität zu ihren mRNA-Zielen4. Daher kann eine einzelne miRNA Dutzende bis Hunderte von verschiedenen mRNA-Zielen regulieren und funktionell eine große Bandbreite biologischer Signalwege beeinflussen. Um die Komplexität von miRNA-basierten Mechanismen zu erhöhen, kann eine einzelne mRNA durch mehrere, unterschiedliche miRNAs reguliert werden. Es ist daher schwierig zu untersuchen, wie die miRNA-Dysregulation das homöostatische Gleichgewicht des Körpers stört und zu menschlicher Malignität führt.
Die Mehrheit der veröffentlichten Studien hat sich bei der Charakterisierung ihrer Rolle bei Krankheitsereignissen auf eine einzelne miRNA konzentriert. ~ 30% der menschlichen miRNA-Gene sind jedoch in geclusterten Einheiten (typischerweise ~ 10 Kilobasen [kb]) organisiert, die oft in der gleichen Orientierung transkribiert und co-exprimiert werden, was auf ein koordiniertes und komplexes System der nicht-kodierenden RNA-Regulation6 hinweist. Der größte polycistronische humane miRNA-Cluster ist der 14q32-Cluster mit 54 miRNA-Vorläufern. Eine der am besten untersuchten geclusterten miRNA-Einheiten, die mit menschlichen Krebserkrankungen assoziiert sind, ist der polycistronische miR-17-92-Cluster, bestehend aus miR-17, miR-18a, miR-19a, miR-20a, miR-19b-1 und miR-92-1, die sich in Intron 3 der nichtkodierenden RNA c13orf25 befinden. Der miR-17-92-Cluster wird häufig bei hämatopoetischen Malignomen verstärkt und bei soliden Tumoren überexprimiert und hat onkogene Rollen bei der Förderung der Zellzyklusprogression, Apoptose und Angiogeneseetabliert 7. Darüber hinaus wird der tumorsuppressive miR-15a- und miR-16-1-Cluster, der sich im Intron des nicht-kodierenden Gens Leu2 befindet, häufig bei Leukämien gelöscht und bei einer Vielzahl von Krebsarten herunterreguliert, wodurch das Tumorwachstum blockiert wird, indem es auf das antiapoptotische Gen BCL2 und zusätzliche Zellzyklus-Progressionsgene8 abzielt. Der miR-888-Cluster ist bei Patienten mit hochgradigem Prostatakrebs erhöht und besteht aus sieben miRNA-Genen (miR-892c, -890, -888, -892a, -892b, -891b und -891a), die sich auf dem menschlichen Chromosom Xq27.3 9,10 befinden.
Der miR-888-Cluster bildet sich innerhalb des HPCX1-Locus (Hereditary Prostate Cancer, X-linked 1) über Xq27-2 ab, der durch Verknüpfungsanalyse der Stammbäume der erblichen Prostatakrebsfamilie 11,12,13,14,15,29 identifiziert wurde. Die funktionelle Charakterisierung einzelner miR-888-geclusterter Mitglieder unter Verwendung herkömmlicher miRNA-Fehlexpressionswerkzeuge - miRNA-Mimics und Antisense-Inhibitoren - zeigte, dass diese miRNAs überlappende Rollen bei der Regulierung des Wachstums und der Invasion von Prostatatumoren spielen 9,10. Diese experimentellen Methoden eignen sich jedoch nicht leicht für die Untersuchung, wie mehrere miR-888-Clustermitglieder synergistisch oder antagonistisch in einem nicht-kodierenden RNA-Netzwerk handeln, um die Gewebehomöostase und das Fortschreiten von Krebs zu kontrollieren. Dieses beschriebene optimierte Protokoll mit Hochdurchsatz-CRISPR-Gen-Editing-Technologie wird modifiziert, um molekular miRNA-Cluster zu sezieren, die mit menschlichen Krebsarten assoziiert sind (z. B. miR-888-Cluster), um diese Wissenslücke zu schließen.
Bakterielle CRISPR- und CRISPR-assoziierte (cas) Gene vermitteln adaptive Immunität gegen Bakteriophagen16. Die Entdeckung dieses uralten prokaryotischen Überwachungssystems wurde schnell als effizientes wissenschaftliches Werkzeug angepasst, um leicht jeden gewünschten genomischen Locus anzusprechen und DNA-Sequenzänderungen in einer Vielzahl von Tiersystemen und Zelltypen sowohl in vitro als auch in vivo vorzunehmen 16,17. Diese Technik ist vielversprechend als effektive Methode, um miRNA-Netzwerke im Kontext menschlicher Krankheiten zu untersuchen. Zu diesem Zweck wurde dieses Hochdurchsatz-CRISPR-Gen-Editing-Protokoll zur Untersuchung des miR-888-Clusters, der ~ 35 kb auf dem menschlichen Chromosom X in immortalisierten menschlichen Prostatakrebszelllinien (LNCaP, PC3-ML) umfasst, konstruiert, um zu untersuchen, wie Clustermitglieder Krebsprogressionswege koordinieren. Dieser Ansatz kann auf die Charakterisierung jedes miRNA-Clusters angewendet werden und ermöglicht es den Forschern, schnell menschliche Zelllinien zu erzeugen, die die gesamte miRNA-Cluster-Deletion und einzelne und kombinierte miRNA-Gen-Cluster-Deletionen innerhalb eines einzigen Experiments tragen.
Bei diesem Verfahren werden stabile Zelllinien mit einem Doxycyclin (DOX)-induzierbaren lentiviralen Expressionssystem hergestellt, das es dem Prüfarzt ermöglicht, die Streptococcus pyogenes CRISPR-assoziierte Endonuklease Cas9 (csn1)- Genexpression durch den konstitutiven DOX-induzierbaren Promotor TRE3G zu kontrollieren. Das zweiteilige Tet-On 3G-System beinhaltet einen konstitutiven menschlichen Dehnungsfaktor 1 alpha (hEF1alpha) -Promotor, um die Transkription sowohl des Tet-On 3G-Gens als auch des Blasticidin-Resistenzgens (BlastR) als bizistronisches Transkript voranzutreiben. Das Tet-On 3G-Transaktivatorprotein bindet nur in Gegenwart von DOX an den TRE3G-Promotor , was zu einer robusten Cas9-Transkription führt. In Abwesenheit von DOX gibt es keine oder nur einen sehr minimalen basalen Cas9-Ausdruck. Daher kann der Prüfarzt während der CRISPR-Gen-Editing-Schritte eine hohe Cas9-Proteinproduktion in Zellen induzieren, die in mit DOX ergänzten Medien gezüchtet wurden, und die Kontrolle für eine schnelle CAS9-Protein-Clearance beim DOX-Entzug.
Dieses Protokoll beschreibt auch das Design von synthetischen CRISPR-RNA (crRNA)-Oligonukleotiden, die auf Regionen abzielen, die den gesamten miRNA-Cluster, einzelne miRNA-Haarnadelregionen (premiRNA) und/oder Untergruppen von miRNA-Genen innerhalb des Clusters flankieren. Jede entworfene crRNA enthält eine einzigartige 5'-terminale 20-nt-Leitliniensequenz (komplementär zur genomischen Sequenz von Interesse), gefolgt von einer invarianten 22 nt S. pyogenes Wiederholungssequenz (5'-XXXXXXXXXXXXXXXXXXXX-GUUUUAGAGCUAUGCUGUUUUG-3'), die eine Basenpaarung mit den universellen transaktivierenden CRISPR RNA (tracrRNA) Oligonukleotiden18 ermöglicht. Zusammen fungieren die geglühte crRNA und die tracrRNA (gemischtes 1:1-Verhältnis) als Leit-RNA für dieses Protokoll (Abbildung 1A). In jedem Experiment werden zwei synthetische Leit-RNAs in DOX-induzierte Zellen transfiziert, um das bakterielle Cas9-Protein mit den genomischen DNA-Stellen (5' und 3') zu assoziieren und zu eskortieren, die die zur Entfernung angestrebte miRNA-Clusterregion flankieren (Abbildung 1B).
Eine Protospacer Adjacent Motif (PAM)-Sequenz (5'-NGG-3' für Wildtyp S. pyogenes Cas9) muss im Zellgenom vorhanden sein und sich unmittelbar neben der 20-nt-DNA-Sequenz befinden, auf die die Leit-RNA17 abzielt. Die PAM-Sequenz dient als Bindungssignal und positioniert die katalytische Region des Endonuklease-Cas9-Enzyms auf der anvisierten genomischen DNA-Stelle, was anschließend zu einer gerichteten, doppelsträngigen (ds) DNA-Spaltung führt, die sich ~ 3 nt vor dem PAM befindet. Die DNA-Reparaturmaschinerie der Zelle repariert die gespaltenen DNA-Enden, was zu einer perfekten Ligatur führen kann, aber oft tritt eine nichthomologe Endverbindung (NHEJ) auf, was zu kleinen Insertionen oder Deletionen (Indels) an der Reparaturstelle führt. Da miRNAs nicht-kodierende Gene sind, die sich häufig in intergenen und intronischen Regionen befinden, bergen diese Indels ein geringes Risiko, unerwünschte Unsinns- / Missense-Mutationen zu erzeugen.
Durch den Einsatz von synthetischen RNA-Oligonukleotiden (geglühte crRNA und tracrRNA, Molverhältnis 1:1), die für den Leit-RNA-Komplex in diesen Experimenten kodieren, vermeidet diese Gen-Knockout-Strategie zeitaufwändiges DNA-Vektor-Subkloning und ermöglicht eine enorme Flexibilität bei der Transfizierung einzigartiger Leit-RNA-Kombinationen zu Zellen in einem 24-Well-Format. Die Herstellung von Rohzelllysaten für das PCR-Genotyp-Screening vermeidet auch teure und zeitaufwändige DNA-Aufreinigungsmethoden und ermöglicht gleichzeitig eine optimierte Einzelkolonie-Zellliniengenerierung und phänotypische Analyse. Tatsächlich wurde dieses Hochdurchsatz-CRISPR-Gen-Editing-Protokoll erfolgreich eingesetzt, um kultivierte Prostatakrebs-Zelllinien (LNCaP, PC3-ML) mit 32 einzigartigen Guide-RNA-Kombinationen in einem einzigen Experiment zu transfizieren und Knockout-Linien zu erzeugen, die Deletionen für die gesamte ~ 35 kb miR-888-Clusterregion tragen; kleinere Löschkombinationen für miR-888-Clustermitglieder, die zu den Familien miR-743 und miR-891a gehören; sowie Deletionen für einzelne miRNA-Mitglieder innerhalb des miR-888-Clusters. Studien wie diese werden eine klarere Untertreibung darüber liefern, wie geclusterte miRNAs kooperativ funktionieren, um Tumorwachstum, Aggressivität und Arzneimittelresistenz zu regulieren, bevor miRNAs als therapeutische und diagnostische Werkzeuge in die Klinik übertragen werden.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.2 mL PCR tubes, flat cap</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>14-230-225</td>
			<td>Plasticware</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL Microcentrifuge Tubes</td>
			<td>Seal-Rite</td>
			<td>1615-5500</td>
			<td>Plasticware</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well tissue culture plate</td>
			<td>Corning Costar</td>
			<td>&#160;09761146</td>
			<td>Plasticware</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5x Phusion HF Buffer</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>F-518L</td>
			<td>PCR reagent, genotyping</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well tissue culture plate</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>FB012927</td>
			<td>Plasticware</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well tissue culture plate</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>08-772-2C</td>
			<td>Plasticware</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-CRISPR-Cas9 antibody [7A9-3A3], Mouse monoclonal</td>
			<td>AbCam</td>
			<td>ab191468</td>
			<td>Western blot reagent; 160 kDa; dilution 1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic-Antimycotic (100x)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15240062</td>
			<td>Tisuue culture reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BLAST nucleotide search engine</td>
			<td>National Center for Biotechnology Information</td>
			<td>NA</td>
			<td>Freeware; website: blast.ncbi.nlm.nih.gov</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blasticidin S, Hydrochloride, Streptomyces griseochromogenes</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td>CAS 589205</td>
			<td>CRISPR reagent; Chemical, Working stock = 1 mg/mL in water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Countess 3 Automated Cell Counter</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A50298</td>
			<td>Equipment; Cell counter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryogenic tubes</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>50001012</td>
			<td>Plasticware</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dharmacon CRISPR Design Tool</td>
			<td>Horizon Discovery Ltd.</td>
			<td>NA</td>
			<td>Freeware; website: horizondiscovery.com/en/ordering-and-calculation-tools/crispr-dna-region-designer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DharmaFECT siRNA Transfection Reagent #2</td>
			<td>Dharmacon, Inc.</td>
			<td>T-2002-02</td>
			<td>Transfection reagent; LNCaP and PC3-ML cell lines</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>&#160;BP231100</td>
			<td>Tisuue culture reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM Medium with L-Glutamine, 4.5g/L Glucose and Sodium Pyruvate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>MT10013CV</td>
			<td>Tisuue culture reagent; Media for PC3-ML cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Doxycycline Hydrochloride, Ready Made Solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D3072-1ML</td>
			<td>CRISPR reagent; Chemical, Working stock = 1 mg/mL stock in water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS, no calcium, no magnesium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190144</td>
			<td>Tisuue culture reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Edit-R CRISPR-Cas9 Synthetic tracrRNA, 20 nmol, designed</td>
			<td>Dharmacon, Inc.</td>
			<td>U-002005-20</td>
			<td>CRISPR reagent; Universal tracrRNA oligonucleotides</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Edit-R Modified Synthetic crRNA, 
			desalted/deprotected, 2 nmol</td>
			<td>Dharmacon, Inc.</td>
			<td>crRNA-460XXX</td>
			<td>CRISPR reagent; Designed crRNA oligonucleotides</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EditR Inducible Lentiviral hEF1aBlastCas9 Nuclease Particles, 50 &#956;L, 107 TU/mL</td>
			<td>Dharmacon, Inc.</td>
			<td>VCAS11227</td>
			<td>CRISPR reagent; Lenti-iCas9; Doxycycline-inducible lentiviral Streptococcus pyogenes Cas9 vector system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ensembl genomic viewer</td>
			<td>Ensembl</td>
			<td>NA</td>
			<td>Freeware; website: [ensembl.org] Use: Genome browser to identify a nucleotide seuqnces containing the miRNA cluster and surrounding gene/regulatory sequences.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GAPDH Antibody (FL-335), rabbit polyclonal</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc25778</td>
			<td>Western blot reagent; 37 kDa; dilution 1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel/PCR DNA Fragment Extraction Kit</td>
			<td>IBI Scientific</td>
			<td>IB47010</td>
			<td>Nucleic acid gel electrophoresis reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco Fetal Bovine Serum, certified</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>16000044</td>
			<td>Tisuue culture reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hexadimethrine bromide</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>H9268</td>
			<td>CRISPR reagent; Chemical, Working stock = 0.8 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immobilon-FL PVDF Membrane</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>IPFL10100</td>
			<td>Western blot reagent; nitrocellulose</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Intercept (TBS) Blocking Buffer</td>
			<td>LI-COR</td>
			<td>927-60001</td>
			<td>Western blot reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IRDye 680RD Goat anti-Mouse IgG Secondary Antibody</td>
			<td>LI-COR</td>
			<td>926-68070</td>
			<td>Western blot reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IRDye 800CW Goat anti-Rabbit IgG Secondary Antibody</td>
			<td>LI-COR</td>
			<td>926-32211</td>
			<td>Western blot reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>&#160;5425 R</td>
			<td>Plasticware</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>miRBase microRNA viewer</td>
			<td>miRBase</td>
			<td>NA</td>
			<td>Freeware; website: [mirbase.org] Use: Borowser lists all annotated miRNA hairpins, mature miRNA sequences and associated clustered miRNAs mapping within 10 kb.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NuPAGE 4 to 12%, Bis-Tris, 1.0 mm, Mini Protein Gel, 10-well</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>NP0321BOX</td>
			<td>Western blot reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Odyssey CLx Imaging System</td>
			<td>LI-COR</td>
			<td>CLx</td>
			<td>Equipment; Western blot imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM Reduced Serum Medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>31985062</td>
			<td>Transfection reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Owl D2 Wide-Gel Electrophoresis System</td>
			<td>Owl</td>
			<td>D2-BP</td>
			<td>Equipment; Nucleic acid gel electrophoresis system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR Primers, designed (single-stranded DNA oligonucleotides)</td>
			<td>Integrated DNA Technology</td>
			<td>NA</td>
			<td>PCR reagent, genotyping</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phusion High-Fidelity DNA Polymerase (2 U/&#181;L)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>F530S</td>
			<td>PCR reagent, genotyping</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RIPA Lysis Buffer 10x</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>20-188</td>
			<td>Western blot reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K Solution (20 mg/mL), RNA grade</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>25530049</td>
			<td>PCR reagent, genotyping</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase A, DNase and protease-free (10 mg/mL)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>EN0531</td>
			<td>PCR reagent, genotyping</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640 Medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>MT10041CV</td>
			<td>Tisuue culture reagent; Media for LNCaP cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SnapGene Viewer</td>
			<td>Snap Gene</td>
			<td>NA</td>
			<td>Freeware; website: [snapgene.com]&#160;Use: DNA sequence annotation software program to create a DNA file for gRNA design and which&#160; highlights the miRNA cluster locus (intergenic, intronic), each individual miRNA hairpin sequence belonging to the miRNA cluster, and other nearby coding and non-coding genes and/or regulatory features</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE Select Enzyme (1x), no phenol red</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12563029</td>
			<td>Tisuue culture reagent; Recombinant trypsin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure Agarose</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>16500100</td>
			<td>Nucleic acid gel electrophoresis reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Veriti 96-Well Fast Thermal Cycler</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>4375305</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XCell SureLock Mini-Cell Electrophoresis System</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>EI0001</td>
			<td>Equipment; Protein gel electrophoresis system</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

crispr gene editing tool for microrna cluster network analysis

MicroRNAs (miRNAs) haben sich als wichtige zelluläre Regulatoren (Tumorsuppressoren, pro-onkogene Faktoren) von Krebs und Metastasen herausgestellt. Die meisten veröffentlichten Studien konzentrieren sich auf eine einzelne miRNA, wenn es darum geht, die Rolle kleiner RNAs bei Krebs zu charakterisieren. ~ 30% der menschlichen miRNA-Gene sind jedoch in geclusterten Einheiten organisiert, die oft co-exprimiert werden, was auf ein komplexes und koordiniertes System der nicht-kodierenden RNA-Regulation hinweist. Eine klarere Untertreibung der Art und Weise, wie geclusterte miRNA-Netzwerke kooperativ funktionieren, um Tumorwachstum, Krebsaggressivität und Arzneimittelresistenz zu regulieren, ist erforderlich, bevor nicht-kodierende kleine RNAs in die Klinik übersetzt werden.
Die Verwendung eines CRISPR-vermittelten Gen-Editing-Verfahrens (High-Throughput-Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats) wurde eingesetzt, um die onkogene Rolle eines genomischen Clusters von sieben miRNA-Genen zu untersuchen, die sich in einem Locus mit einer Länge von ~ 35.000 bp im Zusammenhang mit Prostatakrebs befinden. Für diesen Ansatz wurden humane Krebszelllinien mit einem Lentivirus-Vektor für Doxycyclin (DOX)-induzierbare Cas9-Nuklease infiziert, der 48 h lang in DOX-haltigem Medium gezüchtet wurde. Die Zellen wurden anschließend mit synthetischer transaktivierender CRISPR-RNA (tracrRNA) ko-transfiziert, die mit genomischen ortsspezifischen CRISPR-RNA (crRNA)-Oligonukleotiden komplexiert wurde, um die schnelle Erzeugung von Krebszelllinien zu ermöglichen, die die gesamte miRNA-Clusterdeletion und einzelne oder kombinierte miRNA-Gencluster-Deletionen innerhalb eines einzigen Experiments tragen.
Die Vorteile dieses Hochdurchsatz-Gen-Editing-Systems sind die Möglichkeit, zeitaufwändiges Subklonen von DNA-Vektoren zu vermeiden, die Flexibilität bei der Transfektion von Zellen mit einzigartigen Guide-RNA-Kombinationen in einem 24-Well-Format und die kostengünstigere PCR-Genotypisierung mit Rohzelllysaten. Studien, die diesen optimierten Ansatz verwenden, versprechen, funktionelle Redundanzen und synergistische/antagonistische Interaktionen zwischen miRNA-Clustermitgliedern aufzudecken, was dazu beitragen wird, die komplexen kleinen nicht-kodierenden RNA-Netzwerke zu charakterisieren, die an menschlichen Krankheiten beteiligt sind, und das zukünftige therapeutische Design besser zu informieren.

Dieses Hochdurchsatz-CRISPR-Deletionsprotokoll wurde erfolgreich unter Verwendung der Transfektion von Cas9-induzierbaren LNCaP- und PC3-ML-Zelllinien für den menschlichen Krebs mit synthetischen Oligonukleotid-Guide-RNAs eingesetzt, die auf den miR-888-Cluster abzielen und im Zusammenhang mit Prostatakrebs untersucht wurden. Der miR-888-Cluster wurde zunächst in einem Expressionsprofilierungsbildschirm als erhöht bei Prostatakrebspatienten mit hochgradiger Erkrankung im Vergleich zu Patienten mit niedrigem Grad und N...

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CRISPR Gene Editing Tool for MicroRNA Cluster Network Analysis

Dieses Protokoll beschreibt einen Hochdurchsatz-Cluster-Clustered-Regular-Interspaced-Short-Palindromic-Repeats-Gen-Editing-Workflow für die microRNA-Cluster-Netzwerkanalyse, der die schnelle Generierung eines Panels genetisch veränderter Zelllinien mit einzigartigen miRNA-Cluster-Deletionskombinationen von bis zu 35 kb innerhalb eines einzigen Experiments ermöglicht.

CRISPR-Gen-Editing-Tool für die MicroRNA-Cluster-Netzwerkanalyse

MicroRNAs (miRNAs) have emerged as important cellular regulators (tumor suppressors, pro-oncogenic factors) of cancer and metastasis. Most published ...

Dieses Protokoll verwendet einen Hochdurchsatz-CRISPR-Gen-Editing-Workflow, um Mikro-RNA-Gene molekular zu sezieren, organisierte und gruppierte Einheiten. Und um zu bestimmen, wie diese nicht-kodierenden RNA-Netzwerke Krebsprogressionswege koordinieren. Dieses CRISPR-Gen-Editing-Verfahren ermöglicht es dem Forscher, schnell ein ganzes Panel von Zelllinien zu generieren, die einzigartige Mikro-RNA-Cluster-Deletionskombinationen tragen, während zeitaufwändige DNA-Vektor-Sub-Klonierung vermieden wird.Diese Methode wird ein klareres Verständnis dafür liefern, wie geclusterte Mikro-RNAs kooperativ funktionieren, um Tumorwachstum, Aggressivität und Arzneimittelresistenz zu regulieren, bevor Mikro-RNAs als therapeutische und diagnostische Werkzeuge in die Klinik übersetzt werden. Grace Yi, eine wissenschaftliche Mitarbeiterin in meinem Labor, demonstriert das Verfahren. Erstellen Sie zunächst eine DNA-Datei, die die vollständige genomische Sequenz der interessierenden Mikro-RNA-Clusterregion in mindestens einem Kilobyte umgebender genomischer Regionen enthält, indem Sie ein DNA-Sequenz-Annotations-Softwareprogramm verwenden.Als nächstes entwerfen Sie vier einzigartige CRISPR-RNAs für jeden gezielten Mikro-RNA-Locus. Zwei entworfene CRISPR-RNAs, um komplementäre DNA-Sequenzen unmittelbar fünf Prime des Mikro-RNA-Haarnadelclusters und zwei entworfene CRISPR-RNAs zu adressieren, um komplementäre DNA-Sequenzen unmittelbar drei Prime des Mikro-RNA-Haarnadelclusters anzugreifen. Verwenden Sie ein Feature-Bearbeitungswerkzeug in der erstellten DNA-Datei, um die DNA-Zielsequenz für jede entworfene CRISPR-RNA zu markieren, die synthetisiert werden soll.Entwickelte und synthetisierte PCR-Primer, die die anvisierten Mikro-RNA-Clusterregionen für die Genotypisierung von CRISPR-Zelllinien flankieren. Führen Sie eine Doxycyclin-Konzentrationskurve an neu erzeugten Lenti-induzierbaren Cas9-Zelllinien durch, um die optimalen Bedingungen für die Cas9-Proteininduktion zu bestimmen. Fünfmal 10 der vierten Zellen pro Vertiefung jeder sechs Vertiefungsplatte und wachsen bei 37 Grad Celsius, 5% Kohlendioxid, im bevorzugten Medium für 24 Stunden.Dox wird im bevorzugten Medium mit einer endgültigen Dox-Konzentrationskurve im Bereich von 0 5100, 150, 250 bis 500 Nanogramm pro Milliliter verdünnt. Beschriften Sie die Vertiefungen jeder sitzenden Sechs-Well-Platte von eins bis sechs. Entfernen Sie das Medium und ersetzen Sie es durch die entsprechenden Dox-Konzentrationen.Wachsen Sie Platten ein bis vier bis 24 Stunden, 48 Stunden und 72 Stunden Dox-Induktion und 120 Stunden nach dem Dox-Entzug. Ernten Sie die Vertiefungen der Platte zu jedem Zeitpunkt. Verarbeiten Sie die Zellpellets und den Ripa-Puffer für die Lysatisolierung.Führen Sie eine Western-Blot-Analyse mit 40 Mikrogramm Protein durch, um die Cas9-Proteininduktion zu messen und die optimale Cas9-Konzentration zu bestimmen. Kartieren Sie auf Papier die fünf primären und drei primären CRISPR-RNA-Paarkombinationen, die in jede Vertiefung einer 24-Well-Platte transekt werden, die auf den gesamten Mikro-RNA-Cluster, verschiedene Cluster-Mikro-RNA-Genkombinationen sowie einzelne Mikro-RNA-Clustermitglieder abzielt. Die Lenti-induzierbare gegossene Neunzelllinie wird fünfmal 10 bis zur vierten Zelle pro Vertiefung einer 24-Well-Platte in das bevorzugte Medium gelegt, das die optimierte Dox-Konzentration enthält.Züchten Sie die Zellen für 24 bis 48 Stunden bei 37 Grad Celsius, 5% Kohlendioxid, um Cas9-Proteinexpression zu induzieren. Transfizieren Sie die Lenti-induzierbaren Cas9-Zellen mit einer vorbereiteten fünf Prime- und drei Prime-Guide-RNAs. Markieren Sie vier 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen pro Ziel-Mikro-RNA-Locus.Mischen Sie in jedem Röhrchen ein zu eins molares Verhältnis von Tracer-RNA und einzigartigen CRISPR-RNAs zusammen, um die beiden mikromolaren Guide-RNA-Komplexe zu bilden. Fügen Sie 2,5 Mikroliter Tracer-RNA, 1,25 Mikroliter der fünf primär positionierten CRISPR-RNA, 1,25 Mikroliter der drei primär positionierten CRISPR-RNA und fünf Mikroliter 10 Millimolar Tris hcl pH 7,5-Puffer zu einem 1,5-Milliliter-Zentrifugenröhrchen hinzu. Mikrozentrifuge für 30 Sekunden bei 16.000 mal G mischen.Bei Raumtemperatur fünf Minuten inkubieren. Zu jedem Röhrchen werden 40 Mikroliter Serummedium auf die 10 Mikroliter Guide-RNA-Komplexreaktion reduziert. Mischen Sie vorsichtig, indem Sie auf und ab pipettieren.In einem sauberen 1,5-Milliliter-Zentrifugenröhrchen zwei Mikroliter des Transfektionsreagenz und 48 Mikroliter reduziertes Serummedium vorsichtig durch Auf- und Abpipettieren gemischt. Bei Raumtemperatur fünf Minuten inkubieren. Zu jedem Röhrchen, das die 50 Mikroliter Guide-RNA-Mischung enthält, werden die 50 Mikroliter des verdünnten Transfektionsreagenzes hinzugefügt.Pipetten Sie die Mischung langsam einmal auf und ab, um sie zu mischen. Bei Raumtemperatur 20 Minuten inkubieren. Fügen Sie 400 Mikroliter antibiotikafreies Medium, ergänzt mit Doxycyclin, zu jedem Röhrchen hinzu, das die 100 Mikroliter der Guide-RNA-Transfektionsmischung enthält.Zum Mischen vorsichtig pipetten. Entfernen Sie das Medium aus den Doxycyclin-induzierten Lenti-induzierbaren Cas9-Zellen. Fügen Sie 500 Mikroliter Medien-Doxycyclin-Guide-RNA-Transformationsmischung basierend auf der experimentellen Karte mit 24 Bohrlochplatten hinzu.Inkubieren Sie die transfizierten Zellen für 48 Stunden bei 37 Grad Celsius in 5% Kohlendioxid. Ersetzen Sie das Medium durch das frisch zubereitete Medium ohne Doxycyclin. Lassen Sie die Zellen weitere 24 bis 48 Stunden bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid erholen.Ernten Sie die transfizierten Zellen und bereiten Sie sich auf Genotypisierung und einzellige Wahnvorstellungen vor. Trennen Sie die 150 Mikroliter resuspendierter Zellen in drei Teile. Frieren Sie ein Drittel der transfizierten Zellen in Medium plus 10% DMSO in Kryofläschchen für die Langzeitlagerung ein.Ein Drittel der transfizierten Zellen wird zur Genotypisierung in ein sauberes 0,2-Milliliter-PCRÖHRCHEN überführt. Bereiten Sie das letzte Drittel der transfizierten Zellen zum Zählen und Verdünnen in einem 96-Well-Plattenformat vor, um Einzelzellkolonien zu erzeugen. Unter Verwendung eines 12-Kanal-Multipipetters und eines sterilen Reagenzienreservoirs werden für jede Verdünnung 100 Mikroliter verdünnte Zellen pro Vertiefung in zwei Reihen der Platte gegeben.Lassen Sie vier bis sechs Wochen, bis die Zellen zu Kofluenz für die Expansion einzelner Zellkolonien wachsen. Sammeln Sie etwa 10 bis 15 einzellige Kolonien für die Genotypisierung. Identifizieren Sie mindestens drei unabhängige Knockout-Einzelzellkolonielinien für jeden Ziel-Mikro-RNA-Locus.Behalten Sie einzelne Wildtyp-Linien als Steuerelemente bei. Resuspendiert wurde das Zellpellet in vier Mikrolitern fünf X-DNA-Polymerase-Puffer, einem Mikroliter Proteinase K, einem Mikroliter RNase A und nukleasefreiem Wasser bis zu einem Gesamtvolumen von 20 Mikrolitern. Läuse die Zellen im Thermocycler bei 56 Grad Celsius für 30 Minuten und 96 Grad Celsius für fünf Minuten.Lagern Sie die Zelllysate bei minus 20 Grad Celsius, bis sie für die PCR-Genotypisierung bereit sind. Führen Sie eine PCR-Genotypisierungsreaktion mit den entworfenen PCR-Primern durch, die die Guide-RNA an fünf primären und drei primären Guide-RNA-Zielstellen flankieren. Führen Sie die PCR-Reaktion in einem Thermocycler mit dem im Textmanuskript genannten Programm durch.Laden Sie die PCR-Produkte auf ein 1%Agarose-Gel für die Elektrophorese-Analyse. Extrahieren Sie DNA aus den isolierten PCR-Fragmenten der vorhergesagten Molekülgröße für die Knockout-Genotypen. Bereiten Sie die Proben für die DNA-Sequenzierung vor.Überprüfen Sie, ob die CRISPR-Reaktion erfolgreich war, und führen Sie eine DNA-Sequenzierung der isolierten PCR-Fragmente durch, um die Cas9-Spaltstelle zu identifizieren und die Deletion des Mikro-RNA-Locus zu bestätigen. Es wurden einzigartige CRISPR-RNAs entwickelt, die auf die gesamte 35-Kilo-Basen-miR-888-Clusterregion abzielen. Kleinere Clusterkombinationen innerhalb der miR-743-Familie oder der miR-891-Familie sowie micro-RNA-Deletionen.Die Gelelektrophorese-Analyse der PCR-Reaktionen zeigte, dass die vorhergesagte DNA-Fragmentgröße, die den Knockout-Genotyp repräsentiert, für jede CRISPR-Transfektion amplifiziert wurde. Einzelzellkolonien wurden sequenziell mittels PCR genotypisiert. Die DNA-Sequenzierung dieser isolierten Knockout-PCR-Fragmente bestätigte, dass die transfizierten fünf Prime- und drei Prime-Guide-RNAs die Cas9-Spaltligatur etwa drei Nukleotide stromaufwärts der PAM-Stellen steuerten und den genomischen Verlust des Ziel-Mikro-RNA-Locus validierten.WST-1-Proliferationstests, die miR-891a-Knockout- und Wildtyp-Zellen vergleichen, bestätigen, dass die Überexpression von Mikro-RNA-mimic lentiviralen Vektoren das Wachstum von Prostatazellen induziert, und daher wurde vorhergesagt, dass miR-891 a Verlust Wechselwirkungen zeigen würde. Neben einem sorgfältigen Führungs-RNA-Design ist es wichtig, schnell einzelne Zellkolonien durch jede Mikro-RNA-Knockout-Linie zu erzeugen. Es ist besonders relevant, wenn die Mikro-RNA-Knockout-Zellen das Wachstum der Lebensfähigkeit reduziert haben und in gemischten Populationen mit Wildtyp-Zellen leicht überholt werden würden.Zusätzliche Methoden wie quantitative realtime PCR, Northern Blot und RNA-Sequenzierung sollten durchgeführt werden, um zu bestätigen, dass die CRISPR-Knockout-Zelllinien keine reife Mikro-RNA für den gelöschten Locus exprimieren.

Research

JoVE Journal

Biology

Microarray Analysis for Saccharomyces cerevisiae

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In this protocol, gene expression in yeast (Saccharomyces cerevisiae) is changed after exposure to oxidative stress induced by the addition of hydrogen ...

Forschung

Biologie

Using SecM Arrest Sequence as a Tool to Isolate Ribosome Bound Polypeptides

Mit SECM Arrest Sequenz als Werkzeug zum Ribosom gebunden Polypeptide isolieren

Extensive research has provided ample evidences suggesting that protein folding in the cell is a co-translational process1-5. However, the exact pathway ...

Analysis of Autophagy in Penicillium chrysogenum by Using Starvation Pads in Combination With Fluorescence Microscopy

Analysis of Autophagy in Penicillium chrysogenum by Using Starvation Pads in Combination With Fluorescence Microscopy

Die Analyse der Autophagie in<em&gt; Penicillium chrysogenum</em&gt; Mithilfe von Starvation Pads in Kombination mit Fluoreszenzmikroskopie

The study of cellular quality control systems has emerged as a highly dynamic and relevant field of contemporary research. It has become clear that cells ...

Silencing the Spark: CRISPR/Cas9 Genome Editing in Weakly Electric Fish

Den Funken zum Schweigen bringen: CRISPR/Cas9 Genome Editing in Weakly Electric Fish

Electroreception and electrogenesis have changed in the evolutionary history of vertebrates. There is a striking degree of convergence in these ...

Pupal and Adult Injections for RNAi and CRISPR Gene Editing in Nasonia vitripennis

Pupal and Adult Injections for RNAi and CRISPR Gene Editing in Nasonia vitripennis

Puppen- und Erwachseneninjektionen zur RNAi- und CRISPR-Genbearbeitung bei Nasonia vitripennis

The jewel wasp, Nasonia vitripennis, has become an efficient model system to study epigenetics of haplo-diploid sex determination, B-chromosome biology, ...

TGF-&#946;-mediated Endothelial to Mesenchymal Transition (EndMT) and the Functional Assessment of EndMT Effectors using CRISPR/Cas9 Gene Editing

TGF-ÃƒÅ½Ã‚Â²-mediated Endothelial to Mesenchymal Transition EndMT and the Functional Assessment of EndMT Effectors using CRISPR/Cas9 Gene Editing

TGF-β-vermittelter endothelialer zu mesenchymaler Übergang (EndMT) und die funktionelle Bewertung von EndMT-Effektoren mittels CRISPR/Cas9-Gen-Editing

In response to specific external cues and the activation of certain transcription factors, endothelial cells can differentiate into a mesenchymal-like ...

In Vitro Analysis of E3 Ubiquitin Ligase Function

In Vitro Analysis of E3 Ubiquitin Ligase Function

In vitro Analyse der E3-Ubiquitin-Ligase-Funktion

The covalent attachment of ubiquitin (Ub) to internal lysine residue(s) of a substrate protein, a process termed ubiquitylation, represents one of the ...

CRISPR/Cas9 Gene Editing of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells for Gene Therapy Applications

CRISPR/Cas9-Gen-Editing von hämatopoetischen Stamm- und Vorläuferzellen für gentherapeutische Anwendungen

CRISPR/Cas9 is a highly versatile and efficient gene-editing tool adopted widely to correct various genetic mutations. The feasibility of gene ...

Embryo Injection Technique for Gene Editing in the Black-Legged Tick, Ixodes scapularis

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Embryo-Injektionstechnik zur Gen-Editierung bei der Schwarzbeinigen Zecke (Ixodes scapularis)

Ticks can transmit various viral, bacterial, and protozoan pathogens and are therefore considered vectors of medical and veterinary importance. Despite ...

Protocols for CRISPR/Cas9 Mutagenesis of the Oriental Fruit Fly Bactrocera dorsalis

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Protokolle für CRISPR/Cas9-Mutagenese der Orientalischen Fruchtfliege Bactrocera dorsalis

The Oriental fruit fly, Bactrocera dorsalis, is a highly invasive and adaptive pest species that causes damage to citrus and over 150 other fruit crops ...