Name: crispr gene editing tool for microrna cluster network analysis
Uploaded: 2022-04-25T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about CRISPR Gene Editing Tool for MicroRNA Cluster Network Analysis at JoVE.com

Le linee cellulari PC3-ML sono state gentilmente fornite da Mark Stearn (Drexel University College of Medicine). Justin Toxey ha aiutato nella genotipizzazione PCR. Questo lavoro è stato supportato da una sovvenzione della Fondazione Breedan Adams, un Fondo di ricerca traslazionale Ryan e una sovvenzione del Commonwealth Health Research Board (CHRB-274-11-20) ad AE-K.

1. Preparazione per l'editing genetico CRISPR e guida la progettazione dell'RNA per generare linee cellulari knockout di cluster di miRNA
<ol><li>Creare un file di DNA contenente la sequenza genomica completa della regione di interesse del cluster di miRNA (intergenica, intronica) e almeno 1 kB di regioni genomiche circostanti utilizzando un programma software di annotazione della sequenza di DNA19.<ol><li>Utilizzare uno strumento di modifica delle caratteristiche </stro...

<ol>
	<li>Hasegawa, T., Lewis, H., Esquela-Kerscher, A., Laurence, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Translating MicroRNAs to the Clinic. , 329-369 (2017).</li><li>Lewis, H., Esquela-Kerscher, A., Thiagalingam, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Systems Biology of Cancer. , 134-153 (2015).</li><li>Esquela-Kerscher, A., Slack, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oncomirs+-+microRNAs+with+a+role+in+cancer.">Oncomirs - microRNAs with a role in cancer.</a> Nature Reviews Cancer. 6 (4), 259-269 (2006).</li><li>Breving, K., Esquela-Kerscher, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+complexities+of+microRNA+regulation:+mirandering+around+the+rules.">The complexities of microRNA regulation: mirandering around the rules.</a> The International Journal of Biochemistry &amp; Cell Biology. 42 (8), 1316-1329 (2010).</li><li>Griffiths-Jones, S., Saini, H. K., van Dongen, S., Enright, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=miRBase:+tools+for+microRNA+genomics.">miRBase: tools for microRNA genomics.</a> Nucleic Acids Research. 36, 154-158 (2008).</li><li>Kabekkodu, S. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clustered+miRNAs+and+their+role+in+biological+functions+and+diseases.">Clustered miRNAs and their role in biological functions and diseases.</a> Biological Reviews. 93 (4), 1955-1986 (2018).</li><li>Xiang, J., Wu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Feud+or+friend?+The+role+of+the+miR-17-92+cluster+in+tumorigenesis.">Feud or friend? The role of the miR-17-92 cluster in tumorigenesis.</a> Current Genomics. 11 (2), 129-135 (2010).</li><li>Aqeilan, R. I., Calin, G. A., Croce, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=miR-15a+and+miR-16-1+in+cancer:+discovery,+function+and+future+perspectives.">miR-15a and miR-16-1 in cancer: discovery, function and future perspectives.</a> Cell Death &amp; Differentiation. 17 (2), 215-220 (2010).</li><li>Hasegawa, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+and+evidence+of+the+miR-888+cluster+as+a+novel+cancer+network+in+prostate.">Characterization and evidence of the miR-888 cluster as a novel cancer network in prostate.</a> Molecular Cancer Research. , (2018).</li><li>Lewis, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=miR-888+is+an+expressed+prostatic+secretions-derived+microRNA+that+promotes+prostate+cell+growth+and+migration.">miR-888 is an expressed prostatic secretions-derived microRNA that promotes prostate cell growth and migration.</a> Cell Cycle. 13 (2), 227-239 (2014).</li><li>Xu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+a+prostate+cancer+susceptibility+locus+on+the+X+chromosome.">Evidence for a prostate cancer susceptibility locus on the X chromosome.</a> Nature Genetics. 20 (2), 175-179 (1998).</li><li>Schleutker, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genetic+epidemiological+study+of+hereditary+prostate+cancer+(HPC)+in+Finland:+frequent+HPCX+linkage+in+families+with+late-onset+disease.">A genetic epidemiological study of hereditary prostate cancer (HPC) in Finland: frequent HPCX linkage in families with late-onset disease.</a> Clinical Cancer Research. 6 (12), 4810-4815 (2000).</li><li>Farnham, J. M., Camp, N. J., Swensen, J., Tavtigian, S. V., Albright, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Confirmation+of+the+HPCX+prostate+cancer+predisposition+locus+in+large+Utah+prostate+cancer+pedigrees.">Confirmation of the HPCX prostate cancer predisposition locus in large Utah prostate cancer pedigrees.</a> Human Genetics. 116 (3), 179-185 (2005).</li><li>Brown, W. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hereditary+prostate+cancer+in+African+American+families:+linkage+analysis+using+markers+that+map+to+five+candidate+susceptibility+loci.">Hereditary prostate cancer in African American families: linkage analysis using markers that map to five candidate susceptibility loci.</a> British Journal Of Cancer. 90 (2), 510-514 (2004).</li><li>Bochum, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Confirmation+of+the+prostate+cancer+susceptibility+locus+HPCX+in+a+set+of+104+German+prostate+cancer+families.">Confirmation of the prostate cancer susceptibility locus HPCX in a set of 104 German prostate cancer families.</a> Prostate. 52 (1), 12-19 (2002).</li><li>Doudna, J. 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The new frontier of genome engineering with CRISPR-Cas9.</a> Science. 346 (6213), 1258096 (2014).</li><li>Adli, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+CRISPR+tool+kit+for+genome+editing+and+beyond.">The CRISPR tool kit for genome editing and beyond.</a> Nature Communications. 9 (1), (2018).</li><li>Jinek, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+programmable+dual-RNA+guided+DNA+endonuclease+in+adaptive+bacterial+immunity.">A programmable dual-RNA guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity.</a> Science. 337 (6096), 816-821 (2012).</li><li>. SnapGene&#174; software (from Insightful Science; available at snapgene.com) Available from: <a target="_blank" href="https://www.snapgene.com">https://www.snapgene.com</a> (2022)</li><li>. Ensembl Release 104 genome browser (from EMBL-EBI) Available from: <a target="_blank" href="https://www.ensembl.org">https://www.ensembl.org</a> (2022)</li><li>Howe, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ensembl+2021.">Ensembl 2021.</a> Nucleic Acids Research. 49, 884-891 (2021).</li><li>. miRBase: the microRNA database, Release 22.1 (from Griffiths-Jones laboratory) Available from: <a target="_blank" href="https://www.mirbase.org">https://www.mirbase.org</a> (2022)</li><li>. Dharmacon CRISPR Design Tool (from Dharmacon) Available from: <a target="_blank" href="https://www.horizondiscovery.com/en/ordering-and-calculation-tools/crispr-dna-region-designer">https://www.horizondiscovery.com/en/ordering-and-calculation-tools/crispr-dna-region-designer</a> (2022)</li><li>. Off-Spotter (Venetia Pliatsika &amp; Isidore Rigoutsos of the Jefferson Computational Medicine Center) Available from: <a target="_blank" href="https://cm.jefferson.edu/Off-Spotter/">https://cm.jefferson.edu/Off-Spotter/</a> (2022)</li><li>Bao, X. R., Pan, Y., Lee, C. M., Davis, T. H., Bao, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tools+for+experimental+and+computational+analyses+of+off-target+editing+by+programmable+nucleases.">Tools for experimental and computational analyses of off-target editing by programmable nucleases.</a> Nature Protocols. 16 (1), 10-26 (2021).</li><li>. Dharmacon DharmaFECT Transfection Reagent Cell Type Guide. Choose Dharmacon DharmaFECT 1, 2, 3, or 4 for optimal transfection of siRNA or miRNA reagents Available from: <a target="_blank" href="https://horizondiscovery.com/-/media-Files/Horizon/resources/Selection-guides/dharmafect-cell-type-guidelines.pdf">https://horizondiscovery.com/-/media-Files/Horizon/resources/Selection-guides/dharmafect-cell-type-guidelines.pdf</a> (2022)</li><li>Baffoe-Bonnie, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+major+locus+for+hereditary+prostate+cancer+in+Finland:+localization+by+linkage+disequilibrium+of+a+haplotype+in+the+HPCX+region.">A major locus for hereditary prostate cancer in Finland: localization by linkage disequilibrium of a haplotype in the HPCX region.</a> Human Genetics. 117 (4), 307-316 (2005).</li><li>Zhang, R., Peng, Y., Wang, W., Su, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+evolution+of+an+X-linked+microRNA+cluster+in+primates.">Rapid evolution of an X-linked microRNA cluster in primates.</a> Genome Research. 17 (5), 612-617 (2007).</li><li>Ohnuki, Y., Marnell, M. M., Babcock, M. S., Lechner, J. F., Kaighn, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromosomal+analysis+of+human+prostatic+adenocarcinoma+cell+lines.">Chromosomal analysis of human prostatic adenocarcinoma cell lines.</a> Cancer Research. 40 (3), 524-534 (1980).</li><li>Beheshti, B., Karaskova, J., Park, P. C., Squire, J. A., Beatty, B. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+high+frequency+of+chromosomal+rearrangements+in+the+centromeric+regions+of+prostate+cancer+cell+lines+by+sequential+giemsa+banding+and+spectral+karyotyping.">Identification of a high frequency of chromosomal rearrangements in the centromeric regions of prostate cancer cell lines by sequential giemsa banding and spectral karyotyping.</a> Molecular Diagnosis. 5 (1), 23-32 (2000).</li></ol>

Questa procedura di modifica del gene CRISPR consente allo sperimentatore di generare rapidamente un intero pannello di linee cellulari che trasportano combinazioni uniche di delezione di cluster di miRNA. La trasfezione di RNA guida sintetici composti da crRNA genomici sito-specifici da 5' e 3' ricotti con tracrRNA sintetico (rapporto molare 1:1) in questo protocollo evita la sottoclonazione del vettore plasmidico dispendioso in termini di tempo e consente un design sperimentale più flessibile e ad alto rendimento util...

Sono necessari migliori strumenti di ricerca per studiare il contributo degli RNA non codificanti nelle malattie umane. La disregolazione dei miRNA è spesso osservata in disturbi umani come il cancro quando si confrontano i profili di espressione di questi piccoli RNA non codificanti nei tessuti e nei fluidi corporei (ad esempio, sangue, urina) di pazienti oncologici rispetto a individui sani non cancerogeni, che impiegano microarray, PCR quantitativa in tempo reale (qRT-PCR) e tecnologie di sequenziamento profondo di prossima generazione 1,2 . Lavori recenti hanno caratterizzato un ampio sottoinsieme di questi miRNA come fattori oncosoppressori, oncogeni e metastasi che controllano la formazione del tumore, la progressione della malattia e la resistenza ai farmaci. La sovraespressione sperimentale e/o la downregulation/perdita di miRNA provocano conseguenze funzionali e pleiotropiche nella cellula, riflettendo l'ampia gamma di attività associate al cancro coordinate da questi RNA non codificanti- crescita, apoptosi, differenziazione, rimodellamento della cromatina, angiogenesi, transizioni da epiteliale a mesenchimale (EMT) e MET, metabolismo e risposta immunitaria3.
I miRNA sono codificati come singoli geni o risiedono in cluster genomici, che vengono trascritti nel nucleo e ampiamente elaborati prima di generare le specie di miRNA biologicamente mature, a singolo filamento ~ 22 nucleotide (nt) localizzate nel citoplasma4. Questi piccoli RNA esercitano i loro effetti post-trascrizionalmente e agiscono come regolatori genici negativi che si legano ai bersagli dell'RNA messaggero (mRNA) in modo specifico per sequenza per portare il complesso di silenziamento indotto dall'RNA catalitico (RISC) al sito dell'mRNA, con conseguente degradazione dell'mRNA e / o un blocco nella traduzione delle proteine. I miRNA sono una classe estremamente abbondante di RNA non codificanti nei sistemi animali e nel genoma umano esistono 2.654 miRNA maturi (miRBase release 22.1)5. I miRNA si associano tipicamente a una complementarità incompleta ai loro bersagli mRNA4. Pertanto, un singolo miRNA può regolare da decine a centinaia di bersagli mRNA distinti e avere un impatto funzionale su una vasta gamma di percorsi biologici. Per aumentare la complessità dei meccanismi basati sui miRNA, un singolo mRNA può essere regolato da miRNA multipli e distinti. È quindi difficile indagare su come la disregolazione del miRNA interrompa l'equilibrio omeostatico del corpo e porti alla malignità umana.
La maggior parte degli studi pubblicati si sono concentrati su un singolo miRNA quando caratterizzano il loro ruolo negli eventi di malattia. Tuttavia, ~ 30% dei geni miRNA umani sono organizzati in unità raggruppate (tipicamente ~ 10 kilobasi [kb]) che sono spesso trascritte nello stesso orientamento e co-espresse, indicando un sistema coordinato e complesso di regolazione dell'RNA non codificante6. Il più grande cluster di miRNA umani policistronici è l'ammasso 14q32 che comprende 54 precursori di miRNA. Una delle unità di miRNA cluster più ben studiate associate ai tumori umani è il cluster policistronico miR-17-92 composto da miR-17, miR-18a, miR-19a, miR-20a, miR-19b-1 e miR-92-1 residenti all'interno dell'introne 3 dell'RNA non codificante, c13orf25. Il cluster miR-17-92 è frequentemente amplificato nelle neoplasie ematopoietiche e sovraespresso nei tumori solidi e ha stabilito ruoli oncogeni nel promuovere la progressione del ciclo cellulare, l'apoptosi e l'angiogenesi7. Inoltre, il cluster soppressivo del tumore miR-15a e miR-16-1 situato all'interno dell'introne del gene non codificante Leu2 viene spesso eliminato nelle leucemie e sottoregolato in una vasta gamma di tumori, funzionando per bloccare la crescita tumorale prendendo di mira il gene antiapoptotico BCL2 e ulteriori geni di progressione del ciclo cellulare8. Il cluster miR-888 è elevato nei pazienti con carcinoma prostatico di alto grado ed è costituito da sette geni miRNA (miR-892c, -890, -888, -892a, -892b, -891b e -891a) situati sul cromosoma umano Xq27.3 9,10.
Il cluster miR-888 mappa all'interno del locus HPCX1 (Hereditary Prostate Cancer, X-linked 1) che copre Xq27-2, che è stato identificato dall'analisi di linkage dei pedigree ereditari della famiglia del cancro alla prostata 11,12,13,14,15,29. La caratterizzazione funzionale dei singoli membri raggruppati di miR-888 utilizzando strumenti convenzionali di errata espressione del miRNA - imitazioni di miRNA e inibitori antisenso - ha indicato che questi miRNA svolgono ruoli sovrapposti nella regolazione della crescita e dell'invasione del tumore alla prostata 9,10. Tuttavia, questi metodi sperimentali non si prestano facilmente a studiare come più membri raggruppati di miR-888 agiscono sinergicamente o antagonisticamente in una rete di RNA non codificante per controllare l'omeostasi tissutale e la progressione del cancro. Questo protocollo semplificato descritto che utilizza la tecnologia di editing genico CRISPR ad alto rendimento viene modificato per sezionare molecolarmente i cluster di miRNA associati ai tumori umani (ad esempio, cluster miR-888) per colmare questa lacuna di conoscenza.
I geni batterici CRISPR e CRISPR-associated (cas) mediano l'immunità adattativa contro i batteriofagi16. La scoperta di questo antico sistema di sorveglianza procariotica è stata rapidamente adattata come un efficace strumento scientifico per colpire facilmente qualsiasi luogo genomico desiderato e apportare alterazioni della sequenza del DNA all'interno di una vasta gamma di sistemi animali e tipi di cellule sia in vitro che in vivo16,17. Questa tecnica è molto promettente come metodo efficace per interrogare le reti di miRNA nel contesto della malattia umana. A tal fine, questo protocollo di editing genetico CRISPR ad alto rendimento per studiare il cluster miR-888 che copre ~ 35 kb sul cromosoma X umano in linee cellulari di cancro alla prostata umano immortalizzato (LNCaP, PC3-ML) è costruito per interrogare come i membri del cluster coordinano i percorsi di progressione del cancro. Questo approccio può essere applicato alla caratterizzazione di qualsiasi cluster di miRNA e consente ai ricercatori di generare rapidamente linee cellulari umane che trasportano l'intera delezione del cluster di miRNA e delezioni di cluster di miRNA individuali e combinate all'interno di un singolo esperimento.
In questa procedura, vengono stabilite linee cellulari stabili che trasportano un sistema di espressione lentivirale inducibile da doxiciclina (DOX) che consente allo sperimentatore di controllare l'espressione genica dell'endonucleasi Cas9 (csn1) associata a Streptococcus pyogenes CRISPR attraverso il promotore costitutivo inducibile DOX TRE3G. Il sistema bipartito Tet-On 3G coinvolge un promotore costitutivo del fattore di allungamento umano 1 alfa (hEF1alpha) per guidare la trascrizione sia del gene Tet-On 3G che del gene di resistenza alla blastidina (BlastR) come trascrizione bicistronica. La proteina transattivante Tet-On 3G si lega al promotore TRE3G solo in presenza di DOX, con conseguente robusta trascrizione Cas9. In assenza di DOX, non vi è alcuna o molto minima espressione basale di Cas9. Pertanto, lo sperimentatore può indurre un'elevata produzione di proteina Cas9 in cellule cresciute in mezzi integrati con DOX durante le fasi di modifica del gene CRISPR e il controllo per una rapida clearance della proteina CAS9 al momento del ritiro di DOX.
Questo protocollo descrive anche la progettazione di oligonucleotidi sintetici crispr RNA (crRNA) mirati a regioni che fiancheggiano l'intero cluster di miRNA, singole regioni di miRNA hairpin (premiRNA) e / o sottoinsiemi di geni miRNA all'interno del cluster. Ogni crRNA progettato contiene una sequenza guida 5'-terminale da 20 nt (complementare alla sequenza genomica di interesse da prendere di mira), seguita da una sequenza di ripetizione S. pyogenes invariante da 22 nt (5'-XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX-GUUUUAGAGCUAUGCUGUUUUG-3') che consente l'accoppiamento di basi con gli oligonucleotidi universali trans-attivanti CRISPR RNA (tracrRNA)18. Insieme, il crRNA ricotto e il tracrRNA (rapporto misto 1:1) funzionano come RNA guida per questo protocollo (Figura 1A). In ogni esperimento, due RNA guida sintetici vengono trasfettati in cellule indotte da DOX per associare e scortare la proteina batterica Cas9 ai siti del DNA genomico (5' e 3') che fiancheggiano la regione del cluster di miRNA bersaglio per la rimozione (Figura 1B).
Una sequenza di motivo adiacente protospaziale (PAM) (5'-NGG-3' per il tipo selvaggio S. pyogenes Cas9) deve essere presente nel genoma cellulare e situata immediatamente adiacente alla sequenza di DNA da 20 nt bersaglio dell'RNA guida17. La sequenza PAM funge da segnale di legame e posiziona la regione catalitica dell'enzima Cas9 dell'endonucleasi sul sito del DNA genomico mirato, portando successivamente alla scissione diretta del DNA a doppio filamento (ds) situata ~ 3 nt a monte del PAM. Il macchinario di riparazione del DNA della cellula ripara le estremità del DNA scisso, il che può comportare una legatura perfetta, ma spesso si verifica un'unione finale non omologa (NHEJ), causando piccole inserzioni o delezioni (indels) nel sito di riparazione. Poiché i miRNA sono geni non codificanti spesso situati all'interno di regioni intergeniche e introniche, questi indel comportano un basso rischio di creare mutazioni indesiderate senza senso / missenso.
Impiegando oligonucleotidi sintetici di RNA (crRNA ricotto e tracrRNA, rapporto molare 1:1) che codificano per il complesso dell'RNA guida in questi esperimenti, questa strategia di knockout genico evita la sottoclonazione del vettore del DNA che richiede tempo e consente un'enorme flessibilità nel trasfettare combinazioni di RNA guida uniche alle cellule in un formato a 24 pozzetti. La preparazione di lisati di cellule grezze per lo screening del genotipo PCR evita anche costosi e dispendiosi in termini di tempo i metodi di purificazione del DNA, consentendo al contempo la generazione semplificata della linea cellulare a singola colonia e l'analisi fenotipica. In effetti, questo protocollo di editing genetico CRISPR ad alto rendimento è stato utilizzato con successo per trasfettare le linee cellulari del cancro alla prostata in coltura (LNCaP, PC3-ML) con 32 combinazioni di RNA guida uniche in un singolo esperimento e generare linee knockout che trasportano delezioni per l'intera regione del cluster miR-888 da ~ 35 kb; combinazioni di delezione più piccole per i membri del cluster miR-888 appartenenti alle famiglie miR-743 e miR-891a; così come delezioni per singoli membri di miRNA all'interno del cluster miR-888. Studi come questi forniranno una sottovalutazione più chiara di come i miRNA raggruppati funzionino in modo cooperativo per regolare la crescita del tumore, l'aggressività e la resistenza ai farmaci prima di tradurre i miRNA in clinica come strumenti terapeutici e diagnostici.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.2 mL PCR tubes, flat cap</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>14-230-225</td>
			<td>Plasticware</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL Microcentrifuge Tubes</td>
			<td>Seal-Rite</td>
			<td>1615-5500</td>
			<td>Plasticware</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well tissue culture plate</td>
			<td>Corning Costar</td>
			<td>&#160;09761146</td>
			<td>Plasticware</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5x Phusion HF Buffer</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>F-518L</td>
			<td>PCR reagent, genotyping</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well tissue culture plate</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>FB012927</td>
			<td>Plasticware</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well tissue culture plate</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>08-772-2C</td>
			<td>Plasticware</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-CRISPR-Cas9 antibody [7A9-3A3], Mouse monoclonal</td>
			<td>AbCam</td>
			<td>ab191468</td>
			<td>Western blot reagent; 160 kDa; dilution 1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic-Antimycotic (100x)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15240062</td>
			<td>Tisuue culture reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BLAST nucleotide search engine</td>
			<td>National Center for Biotechnology Information</td>
			<td>NA</td>
			<td>Freeware; website: blast.ncbi.nlm.nih.gov</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blasticidin S, Hydrochloride, Streptomyces griseochromogenes</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td>CAS 589205</td>
			<td>CRISPR reagent; Chemical, Working stock = 1 mg/mL in water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Countess 3 Automated Cell Counter</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A50298</td>
			<td>Equipment; Cell counter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryogenic tubes</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>50001012</td>
			<td>Plasticware</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dharmacon CRISPR Design Tool</td>
			<td>Horizon Discovery Ltd.</td>
			<td>NA</td>
			<td>Freeware; website: horizondiscovery.com/en/ordering-and-calculation-tools/crispr-dna-region-designer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DharmaFECT siRNA Transfection Reagent #2</td>
			<td>Dharmacon, Inc.</td>
			<td>T-2002-02</td>
			<td>Transfection reagent; LNCaP and PC3-ML cell lines</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>&#160;BP231100</td>
			<td>Tisuue culture reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM Medium with L-Glutamine, 4.5g/L Glucose and Sodium Pyruvate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>MT10013CV</td>
			<td>Tisuue culture reagent; Media for PC3-ML cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Doxycycline Hydrochloride, Ready Made Solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D3072-1ML</td>
			<td>CRISPR reagent; Chemical, Working stock = 1 mg/mL stock in water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS, no calcium, no magnesium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190144</td>
			<td>Tisuue culture reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Edit-R CRISPR-Cas9 Synthetic tracrRNA, 20 nmol, designed</td>
			<td>Dharmacon, Inc.</td>
			<td>U-002005-20</td>
			<td>CRISPR reagent; Universal tracrRNA oligonucleotides</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Edit-R Modified Synthetic crRNA, 
			desalted/deprotected, 2 nmol</td>
			<td>Dharmacon, Inc.</td>
			<td>crRNA-460XXX</td>
			<td>CRISPR reagent; Designed crRNA oligonucleotides</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EditR Inducible Lentiviral hEF1aBlastCas9 Nuclease Particles, 50 &#956;L, 107 TU/mL</td>
			<td>Dharmacon, Inc.</td>
			<td>VCAS11227</td>
			<td>CRISPR reagent; Lenti-iCas9; Doxycycline-inducible lentiviral Streptococcus pyogenes Cas9 vector system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ensembl genomic viewer</td>
			<td>Ensembl</td>
			<td>NA</td>
			<td>Freeware; website: [ensembl.org] Use: Genome browser to identify a nucleotide seuqnces containing the miRNA cluster and surrounding gene/regulatory sequences.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GAPDH Antibody (FL-335), rabbit polyclonal</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc25778</td>
			<td>Western blot reagent; 37 kDa; dilution 1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel/PCR DNA Fragment Extraction Kit</td>
			<td>IBI Scientific</td>
			<td>IB47010</td>
			<td>Nucleic acid gel electrophoresis reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco Fetal Bovine Serum, certified</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>16000044</td>
			<td>Tisuue culture reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hexadimethrine bromide</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>H9268</td>
			<td>CRISPR reagent; Chemical, Working stock = 0.8 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immobilon-FL PVDF Membrane</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>IPFL10100</td>
			<td>Western blot reagent; nitrocellulose</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Intercept (TBS) Blocking Buffer</td>
			<td>LI-COR</td>
			<td>927-60001</td>
			<td>Western blot reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IRDye 680RD Goat anti-Mouse IgG Secondary Antibody</td>
			<td>LI-COR</td>
			<td>926-68070</td>
			<td>Western blot reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IRDye 800CW Goat anti-Rabbit IgG Secondary Antibody</td>
			<td>LI-COR</td>
			<td>926-32211</td>
			<td>Western blot reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>&#160;5425 R</td>
			<td>Plasticware</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>miRBase microRNA viewer</td>
			<td>miRBase</td>
			<td>NA</td>
			<td>Freeware; website: [mirbase.org] Use: Borowser lists all annotated miRNA hairpins, mature miRNA sequences and associated clustered miRNAs mapping within 10 kb.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NuPAGE 4 to 12%, Bis-Tris, 1.0 mm, Mini Protein Gel, 10-well</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>NP0321BOX</td>
			<td>Western blot reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Odyssey CLx Imaging System</td>
			<td>LI-COR</td>
			<td>CLx</td>
			<td>Equipment; Western blot imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM Reduced Serum Medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>31985062</td>
			<td>Transfection reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Owl D2 Wide-Gel Electrophoresis System</td>
			<td>Owl</td>
			<td>D2-BP</td>
			<td>Equipment; Nucleic acid gel electrophoresis system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR Primers, designed (single-stranded DNA oligonucleotides)</td>
			<td>Integrated DNA Technology</td>
			<td>NA</td>
			<td>PCR reagent, genotyping</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phusion High-Fidelity DNA Polymerase (2 U/&#181;L)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>F530S</td>
			<td>PCR reagent, genotyping</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RIPA Lysis Buffer 10x</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>20-188</td>
			<td>Western blot reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K Solution (20 mg/mL), RNA grade</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>25530049</td>
			<td>PCR reagent, genotyping</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase A, DNase and protease-free (10 mg/mL)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>EN0531</td>
			<td>PCR reagent, genotyping</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640 Medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>MT10041CV</td>
			<td>Tisuue culture reagent; Media for LNCaP cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SnapGene Viewer</td>
			<td>Snap Gene</td>
			<td>NA</td>
			<td>Freeware; website: [snapgene.com]&#160;Use: DNA sequence annotation software program to create a DNA file for gRNA design and which&#160; highlights the miRNA cluster locus (intergenic, intronic), each individual miRNA hairpin sequence belonging to the miRNA cluster, and other nearby coding and non-coding genes and/or regulatory features</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE Select Enzyme (1x), no phenol red</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12563029</td>
			<td>Tisuue culture reagent; Recombinant trypsin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure Agarose</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>16500100</td>
			<td>Nucleic acid gel electrophoresis reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Veriti 96-Well Fast Thermal Cycler</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>4375305</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XCell SureLock Mini-Cell Electrophoresis System</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>EI0001</td>
			<td>Equipment; Protein gel electrophoresis system</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

crispr gene editing tool for microrna cluster network analysis

I microRNA (miRNA) sono emersi come importanti regolatori cellulari (soppressori tumorali, fattori pro-oncogeni) del cancro e delle metastasi. La maggior parte degli studi pubblicati si concentra su un singolo miRNA quando caratterizza il ruolo dei piccoli RNA nel cancro. Tuttavia, circa il 30% dei geni dei miRNA umani sono organizzati in unità raggruppate che sono spesso co-espresse, indicando un sistema complesso e coordinato di regolazione dell'RNA non codificante. Una sottovalutazione più chiara di come le reti di miRNA raggruppate funzionino in modo cooperativo per regolare la crescita del tumore, l'aggressività del cancro e la resistenza ai farmaci è necessaria prima di tradurre piccoli RNA non codificanti in clinica.
L'uso di una procedura di editing genico mediata da brevi ripetizioni palindrome raggruppate regolarmente intervallate (CRISPR) ad alto rendimento è stato impiegato per studiare il ruolo oncogenico di un cluster genomico di sette geni miRNA situati all'interno di un locus che copre ~ 35.000 bp di lunghezza nel contesto del cancro alla prostata. Per questo approccio, le linee cellulari tumorali umane sono state infettate da un vettore di lentivirus per la nucleasi Cas9 inducibile da doxiciclina (DOX) coltivata in mezzo contenente DOX per 48 ore. Le cellule sono state successivamente co-trasfettate con RNA CRISPR trans-attivante sintetico (tracrRNA) complessato con oligonucleotidi CRISPR RNA (crRNA) sito-specifici genomici per consentire la rapida generazione di linee cellulari tumorali che trasportano l'intera delezione del cluster di miRNA e delezioni di cluster di geni miRNA individuali o combinati all'interno di un singolo esperimento.
I vantaggi di questo sistema di editing genetico ad alto rendimento sono la capacità di evitare la sottoclonazione del vettore del DNA che richiede tempo, la flessibilità nel trasfettare le cellule con combinazioni uniche di RNA guida in un formato a 24 pozzetti e la genotipizzazione PCR a basso costo utilizzando lisati di cellule grezze. Gli studi che utilizzano questo approccio semplificato promettono di scoprire ridondanze funzionali e interazioni sinergiche / antagoniste tra i membri del cluster di miRNA, che aiuteranno a caratterizzare le complesse piccole reti di RNA non codificanti coinvolte nella malattia umana e informeranno meglio la futura progettazione terapeutica.

Questo protocollo di delezione CRISPR ad alto rendimento è stato impiegato con successo utilizzando la trasfezione di linee cellulari tumorali umane LNCaP e PC3-ML inducibili Cas9 con RNA guida oligonucleotidica sintetici mirati al cluster miR-888, che sono stati studiati nel contesto del cancro alla prostata. Il cluster miR-888 è stato inizialmente identificato in uno screening di profilazione dell'espressione come elevato nei pazienti con cancro alla prostata con malattia di alto grado rispetto ai pazienti di basso g...

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CRISPR Gene Editing Tool for MicroRNA Cluster Network Analysis

Questo protocollo descrive un flusso di lavoro di editing genico CRISPR (Short Palindromic Repeats) ad alto rendimento per l'analisi della rete di cluster di microRNA che consente la rapida generazione di un pannello di linee cellulari geneticamente modificate che trasportano combinazioni uniche di delezione dei membri del cluster di miRNA fino a 35 kb all'interno di un singolo esperimento.

Strumento di editing genetico CRISPR per l'analisi della rete di cluster microRNA

MicroRNAs (miRNAs) have emerged as important cellular regulators (tumor suppressors, pro-oncogenic factors) of cancer and metastasis. Most published ...

Questo protocollo utilizza un flusso di lavoro di editing genetico CRISPR ad alto rendimento per sezionare molecolarmente i geni micro RNA organizzati e raggruppati di unità. E per determinare come queste reti di RNA non codificanti coordinano i percorsi di progressione del cancro. Questa procedura di modifica genetica CRISPR consente allo sperimentatore di generare rapidamente un intero pannello di linee cellulari che trasportano combinazioni uniche di delezione di cluster di micro RNA, evitando al contempo la lunga clonazione del vettore DNA.Questo metodo fornirà una comprensione più chiara di come i micro RNA raggruppati funzionano in modo cooperativo per regolare la crescita tumorale, l'aggressività e la resistenza ai farmaci prima di tradurre i micro RNA nella clinica come strumenti terapeutici e diagnostici. A dimostrare la procedura sarà Grace Yi, un'assistente di ricerca nel mio laboratorio. Per iniziare, creare un file DNA contenente la sequenza genomica completa della regione del cluster di micro RNA di interesse in almeno un kilobyte di regioni genomiche circostanti utilizzando un programma software di annotazione della sequenza di DNA.Successivamente, progettare quattro RNA CRISPR unici per ogni locus micro RNA mirato. Due RNA CRISPR progettati per colpire immediatamente sequenze di DNA complementari cinque primi del cluster di forcine micro RNA e due RNA CRISPR progettati per colpire immediatamente sequenze di DNA complementari tre primi del cluster di forcine micro RNA. Utilizzare uno strumento di modifica delle caratteristiche nel file DNA creato per contrassegnare la sequenza target del DNA per ogni RNA CRISPR progettato da sintetizzare.Primer PCR progettati e sintetizzati che fiancheggiano le regioni di cluster di micro RNA mirate per la genotipizzazione di linee cellulari CRISPR. Eseguire una curva di concentrazione di doxiciclina su linee cellulari Cas9 inducibili da lenti di nuova generazione per determinare le condizioni ottimali per l'induzione della proteina Cas9. Piastra cinque volte 10 delle quarte cellule per pozzetto di ogni piastra a sei pozzetti e crescere a 37 gradi Celsius, 5% di anidride carbonica, nel mezzo preferito per 24 ore.Diluire dox nel mezzo preferito con una curva di concentrazione finale di dox compresa tra 0 5100, 150, 250 e 500 nanogrammi per millilitro. Etichettare i pozzetti di ogni piastra a sei pozzetti seduti da uno a sei. Rimuovere il mezzo e sostituirlo con le concentrazioni di dox appropriate.Coltiva le piastre da uno a quattro fino a 24 ore, 48 ore e 72 ore di induzione dox e 120 ore dopo il ritiro dox. Raccogli i pozzetti del piatto in ogni punto temporale. Elaborare i pellet cellulari e il tampone ripa per l'isolamento del lisato.Eseguire l'analisi western blot con 40 microgrammi di proteine per misurare l'induzione della proteina Cas9 e determinare la concentrazione ottimale di Cas9. Sulla carta, mappare le cinque combinazioni di coppie di RNA CRISPR prime e tre prime che saranno transettate in ciascun pozzetto di una piastra a 24 pozzetti mirata all'intero cluster di micro RNA, varie combinazioni di geni micro RNA raggruppati, nonché singoli membri del cluster di micro RNA. Placcare la linea di nove cellule inducibili a cinque volte 10 alla quarta cella per pozzetto di una piastra da 24 pozzetti nel mezzo preferito contenente la concentrazione di dox ottimizzata.Coltiva le cellule per 24-48 ore a 37 gradi Celsius, 5% di anidride carbonica per indurre l'espressione della proteina Cas9. Transfettare le cellule Cas9 inducibili lenti con cinque RNA guida primi e tre primi preparati. Etichettare quattro provette da microcentrifuga da 1,5 millilitri per locus micro RNA mirato.In ogni provetta, mescolare un rapporto molare di RNA tracciante e RNA CRISPR unici insieme per formare il complesso di RNA guida micromolare. Aggiungere 2,5 microlitri di RNA tracciante, 1,25 microlitri dei cinque RNA CRISPR posizionati in primo piano, 1,25 microlitri dei tre RNA CRISPR posizionati in primo piano e cinque microlitri di tampone tris hcl pH 7,5 da 10 millimolari a una provetta da centrifuga da 1,5 millilitri. Microcentrifuga per 30 secondi a 16.000 volte G per miscelare.Incubare a temperatura ambiente per cinque minuti. Ad ogni tubo a 40 microlitri di mezzo sierico ridotto ai 10 microlitri di reazione del complesso RNA guida. Mescolare delicatamente pipettando su e giù.In una provetta da centrifuga pulita da 1,5 millilitri, mescolare delicatamente due microlitri del reagente di trasfezione e 48 microlitri di mezzo sierico ridotto mediante pipettaggio su e giù. Incubare a temperatura ambiente per cinque minuti. A ciascuna provetta contenente i 50 microlitri di miscela di RNA guida, aggiungere i 50 microlitri del reagente di trasfezione diluito.Pipettare lentamente la miscela su e giù una volta per mescolare. Incubare a temperatura ambiente per 20 minuti. Aggiungere 400 microlitri di terreno privo di antibiotici integrato con doxiciclina a ciascuna provetta contenente i 100 microlitri della miscela di trasfezione dell'RNA guida.Pipettare delicatamente per mescolare. Rimuovere il mezzo dalle cellule Cas9 inducibili dalla doxiciclina indotte dalle lenti. Aggiungere 500 microlitri di mix di trasformazione dell'RNA guida doxiciclina media basato sulla mappa sperimentale della piastra a 24 pozzetti.Incubare le cellule trasfettate per 48 ore a 37 gradi Celsius in anidride carbonica al 5%. Sostituire il mezzo con il mezzo preparato fresco senza doxiciclina. Consentire alle cellule di recuperare per altre 24-48 ore a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica.Raccogli le cellule trasfettate e preparati per la genotipizzazione e le delusioni a singola cellula. Separare i 150 microlitri di celle risospese in tre parti. Congelare un terzo delle cellule trasfettate in media più 10% DMSO in fiale criogeniche per la conservazione a lungo termine.Trasferire un terzo delle cellule trasfettate in una provetta PCR pulita da 0,2 millilitri per la genotipizzazione. Preparare l'ultimo terzo delle cellule trasfettate per il conteggio e la diluizione in un formato a piastra a 96 pozzetti per generare colonie a singola cellula. Utilizzando un multi pipetter a 12 canali e un serbatoio di reagente sterile, aggiungere 100 microlitri di celle diluite per pozzetto a due file di piastra per ogni diluizione.Lasciare da quattro a sei settimane affinché le cellule crescano fino alla cofluenza per l'espansione della colonia a singola cellula. Raccogliere circa 10-15 colonie monocellulari per la genotipizzazione. Identificare almeno tre linee indipendenti di colonie monocellulari knockout per ogni locus micro RNA mirato.Mantenere le linee a cella singola di tipo wild come controlli. Risospendere il pellet cellulare in quattro microlitri di cinque tampone X DNA polimerasi, un microlitro di proteinasi K, un microlitro di RNasi A e acqua priva di nucleasi fino ad un volume totale di 20 microlitri. Pidocchi le cellule nel termo ciclatore a 56 gradi Celsius per 30 minuti e 96 gradi Celsius per cinque minuti.Conservare i lisati cellulari a meno 20 gradi Celsius fino al momento della genotipizzazione PCR. Eseguire una reazione di genotipizzazione PCR utilizzando i primer PCR progettati che fiancheggiano i cinque siti mirati all'RNA guida e tre siti mirati all'RNA guida principale. Eseguire la reazione PCR in un termociclatore utilizzando il programma menzionato nel manoscritto testuale.Caricare i prodotti PCR su un gel di agarosio all'1% per l'analisi dell'elettroforesi. Estrarre il DNA dai frammenti di PCR isolati della dimensione molecolare prevista per i genotipi knockout. Preparare i campioni per il sequenziamento del DNA.Convalidare che la reazione CRISPR abbia avuto successo ed eseguire il sequenziamento del DNA dei frammenti di PCR isolati per identificare il sito di scissione Cas9 e confermare la delezione del locus del micro RNA. Sono stati progettati RNA CRISPR unici che hanno preso di mira l'intera regione del cluster miR-888 di 35 chili di basi. Combinazioni di cluster più piccole all'interno della famiglia miR-743 o della famiglia miR-891 e delezioni di micro RNA.L'analisi dell'elettroforesi su gel delle reazioni PCR ha indicato che la dimensione prevista del frammento di DNA che rappresenta il genotipo knockout è stata amplificata per ogni trasfezione CRISPR. Le colonie monocellulari sono state genotipizzate mediante PCR in sequenza verificata. Il sequenziamento del DNA di questi frammenti isolati di knockout PCR ha confermato che i cinque RNA guida primi e tre primi trasfettati hanno diretto la legatura della scissione Cas9 di circa tre nucleotidi a monte dei siti PAM e hanno convalidato la perdita genomica del locus micro RNA mirato.I saggi di proliferazione di WST-1 che confrontano le cellule knockout di miR-891a e wild type confermano che la sovraespressione del vettore lentivirale mimica micro RNA induce la crescita delle cellule prostatiche e quindi è stato previsto che la perdita di miR-891 avrebbe mostrato effetti reciproci. Oltre a un'attenta progettazione dell'RNA guida, è importante generare rapidamente colonie di singole cellule attraverso ogni linea di knockout del micro RNA. È particolarmente rilevante se le cellule knockout del micro RNA hanno una ridotta crescita di vitalità e sarebbero facilmente superate in popolazioni miste con cellule wild type.Ulteriori metodi come la PCR quantitativa in tempo reale, il northern blot e il sequenziamento dell'RNA dovrebbero essere eseguiti per confermare che le linee cellulari knockout CRISPR non esprimono micro RNA maturo per il locus eliminato.

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