Name: crispr gene editing tool for microrna cluster network analysis
Uploaded: 2022-04-25T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about CRISPR Gene Editing Tool for MicroRNA Cluster Network Analysis at JoVE.com

PC3-ML細胞株は、Mark Stearn(Drexel University College of Medicine)によって親切に提供された。ジャスティン・トキシーはPCRジェノタイピングを支援した。この研究は、Breedan Adams Foundation Grant、Ryan Translational Research Fund、Commonwealth Health Research Board Grant(CHRB-274-11-20)のAE-Kへの支援を受けました。

1. CRISPR遺伝子編集の準備とmiRNAクラスターノックアウト細胞株作製のためのガイドRNA設計
<ol><li>DNA配列アノテーションソフトウェアプログラム19を用いて、目的のmiRNAクラスター領域(遺伝子間、イントロニック)および周囲のゲノム領域の少なくとも1 kBの完全なゲノム配列を含むDNAファイルを作成する。<ol><li>作成したDNAファイルの特徴編集ツール?...

<ol>
	<li>Hasegawa, T., Lewis, H., Esquela-Kerscher, A., Laurence, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Translating MicroRNAs to the Clinic. , 329-369 (2017).</li><li>Lewis, H., Esquela-Kerscher, A., Thiagalingam, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Systems Biology of Cancer. , 134-153 (2015).</li><li>Esquela-Kerscher, A., Slack, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oncomirs+-+microRNAs+with+a+role+in+cancer.">Oncomirs - microRNAs with a role in cancer.</a> Nature Reviews Cancer. 6 (4), 259-269 (2006).</li><li>Breving, K., Esquela-Kerscher, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+complexities+of+microRNA+regulation:+mirandering+around+the+rules.">The complexities of microRNA regulation: mirandering around the rules.</a> The International Journal of Biochemistry &amp; Cell Biology. 42 (8), 1316-1329 (2010).</li><li>Griffiths-Jones, S., Saini, H. K., van Dongen, S., Enright, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=miRBase:+tools+for+microRNA+genomics.">miRBase: tools for microRNA genomics.</a> Nucleic Acids Research. 36, 154-158 (2008).</li><li>Kabekkodu, S. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clustered+miRNAs+and+their+role+in+biological+functions+and+diseases.">Clustered miRNAs and their role in biological functions and diseases.</a> Biological Reviews. 93 (4), 1955-1986 (2018).</li><li>Xiang, J., Wu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Feud+or+friend?+The+role+of+the+miR-17-92+cluster+in+tumorigenesis.">Feud or friend? The role of the miR-17-92 cluster in tumorigenesis.</a> Current Genomics. 11 (2), 129-135 (2010).</li><li>Aqeilan, R. I., Calin, G. A., Croce, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=miR-15a+and+miR-16-1+in+cancer:+discovery,+function+and+future+perspectives.">miR-15a and miR-16-1 in cancer: discovery, function and future perspectives.</a> Cell Death &amp; Differentiation. 17 (2), 215-220 (2010).</li><li>Hasegawa, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+and+evidence+of+the+miR-888+cluster+as+a+novel+cancer+network+in+prostate.">Characterization and evidence of the miR-888 cluster as a novel cancer network in prostate.</a> Molecular Cancer Research. , (2018).</li><li>Lewis, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=miR-888+is+an+expressed+prostatic+secretions-derived+microRNA+that+promotes+prostate+cell+growth+and+migration.">miR-888 is an expressed prostatic secretions-derived microRNA that promotes prostate cell growth and migration.</a> Cell Cycle. 13 (2), 227-239 (2014).</li><li>Xu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+a+prostate+cancer+susceptibility+locus+on+the+X+chromosome.">Evidence for a prostate cancer susceptibility locus on the X chromosome.</a> Nature Genetics. 20 (2), 175-179 (1998).</li><li>Schleutker, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genetic+epidemiological+study+of+hereditary+prostate+cancer+(HPC)+in+Finland:+frequent+HPCX+linkage+in+families+with+late-onset+disease.">A genetic epidemiological study of hereditary prostate cancer (HPC) in Finland: frequent HPCX linkage in families with late-onset disease.</a> Clinical Cancer Research. 6 (12), 4810-4815 (2000).</li><li>Farnham, J. M., Camp, N. J., Swensen, J., Tavtigian, S. V., Albright, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Confirmation+of+the+HPCX+prostate+cancer+predisposition+locus+in+large+Utah+prostate+cancer+pedigrees.">Confirmation of the HPCX prostate cancer predisposition locus in large Utah prostate cancer pedigrees.</a> Human Genetics. 116 (3), 179-185 (2005).</li><li>Brown, W. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hereditary+prostate+cancer+in+African+American+families:+linkage+analysis+using+markers+that+map+to+five+candidate+susceptibility+loci.">Hereditary prostate cancer in African American families: linkage analysis using markers that map to five candidate susceptibility loci.</a> British Journal Of Cancer. 90 (2), 510-514 (2004).</li><li>Bochum, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Confirmation+of+the+prostate+cancer+susceptibility+locus+HPCX+in+a+set+of+104+German+prostate+cancer+families.">Confirmation of the prostate cancer susceptibility locus HPCX in a set of 104 German prostate cancer families.</a> Prostate. 52 (1), 12-19 (2002).</li><li>Doudna, J. A., Charpentier, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+editing.+The+new+frontier+of+genome+engineering+with+CRISPR-Cas9.">Genome editing. The new frontier of genome engineering with CRISPR-Cas9.</a> Science. 346 (6213), 1258096 (2014).</li><li>Adli, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+CRISPR+tool+kit+for+genome+editing+and+beyond.">The CRISPR tool kit for genome editing and beyond.</a> Nature Communications. 9 (1), (2018).</li><li>Jinek, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+programmable+dual-RNA+guided+DNA+endonuclease+in+adaptive+bacterial+immunity.">A programmable dual-RNA guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity.</a> Science. 337 (6096), 816-821 (2012).</li><li>. SnapGene&#174; software (from Insightful Science; available at snapgene.com) Available from: <a target="_blank" href="https://www.snapgene.com">https://www.snapgene.com</a> (2022)</li><li>. Ensembl Release 104 genome browser (from EMBL-EBI) Available from: <a target="_blank" href="https://www.ensembl.org">https://www.ensembl.org</a> (2022)</li><li>Howe, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ensembl+2021.">Ensembl 2021.</a> Nucleic Acids Research. 49, 884-891 (2021).</li><li>. miRBase: the microRNA database, Release 22.1 (from Griffiths-Jones laboratory) Available from: <a target="_blank" href="https://www.mirbase.org">https://www.mirbase.org</a> (2022)</li><li>. Dharmacon CRISPR Design Tool (from Dharmacon) Available from: <a target="_blank" href="https://www.horizondiscovery.com/en/ordering-and-calculation-tools/crispr-dna-region-designer">https://www.horizondiscovery.com/en/ordering-and-calculation-tools/crispr-dna-region-designer</a> (2022)</li><li>. Off-Spotter (Venetia Pliatsika &amp; Isidore Rigoutsos of the Jefferson Computational Medicine Center) Available from: <a target="_blank" href="https://cm.jefferson.edu/Off-Spotter/">https://cm.jefferson.edu/Off-Spotter/</a> (2022)</li><li>Bao, X. R., Pan, Y., Lee, C. M., Davis, T. H., Bao, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tools+for+experimental+and+computational+analyses+of+off-target+editing+by+programmable+nucleases.">Tools for experimental and computational analyses of off-target editing by programmable nucleases.</a> Nature Protocols. 16 (1), 10-26 (2021).</li><li>. Dharmacon DharmaFECT Transfection Reagent Cell Type Guide. Choose Dharmacon DharmaFECT 1, 2, 3, or 4 for optimal transfection of siRNA or miRNA reagents Available from: <a target="_blank" href="https://horizondiscovery.com/-/media-Files/Horizon/resources/Selection-guides/dharmafect-cell-type-guidelines.pdf">https://horizondiscovery.com/-/media-Files/Horizon/resources/Selection-guides/dharmafect-cell-type-guidelines.pdf</a> (2022)</li><li>Baffoe-Bonnie, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+major+locus+for+hereditary+prostate+cancer+in+Finland:+localization+by+linkage+disequilibrium+of+a+haplotype+in+the+HPCX+region.">A major locus for hereditary prostate cancer in Finland: localization by linkage disequilibrium of a haplotype in the HPCX region.</a> Human Genetics. 117 (4), 307-316 (2005).</li><li>Zhang, R., Peng, Y., Wang, W., Su, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+evolution+of+an+X-linked+microRNA+cluster+in+primates.">Rapid evolution of an X-linked microRNA cluster in primates.</a> Genome Research. 17 (5), 612-617 (2007).</li><li>Ohnuki, Y., Marnell, M. M., Babcock, M. S., Lechner, J. F., Kaighn, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromosomal+analysis+of+human+prostatic+adenocarcinoma+cell+lines.">Chromosomal analysis of human prostatic adenocarcinoma cell lines.</a> Cancer Research. 40 (3), 524-534 (1980).</li><li>Beheshti, B., Karaskova, J., Park, P. C., Squire, J. A., Beatty, B. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+high+frequency+of+chromosomal+rearrangements+in+the+centromeric+regions+of+prostate+cancer+cell+lines+by+sequential+giemsa+banding+and+spectral+karyotyping.">Identification of a high frequency of chromosomal rearrangements in the centromeric regions of prostate cancer cell lines by sequential giemsa banding and spectral karyotyping.</a> Molecular Diagnosis. 5 (1), 23-32 (2000).</li></ol>

このCRISPR遺伝子編集手順により、研究者は、ユニークなmiRNAクラスター欠失の組み合わせを持つ細胞株のパネル全体を迅速に生成することができます。このプロトコルでは、合成tracrRNA(1:1モル比)でアニーリングされた5'および3'ゲノム部位特異的crRNAで構成される合成ガイドRNAのトランスフェクションにより、時間のかかるプラスミドベクターのサブクローニングが回避され、24ウェル形式を?...

ヒト疾患におけるノンコーディングRNAの寄与を調査するには、より良い研究ツールが必要である。MiRNAの調節不全は、がん患者の組織および体液(血液、尿など)におけるこれらの小さなノンコーディングRNAの発現プロファイルと非がん、健常人、マイクロアレイ、定量的リアルタイムPCR(qRT-PCR)、および次世代ディープシーケンシング技術を採用した1,2.最近の研究は、これらのmiRNAの大部分のサブセットを、腫瘍形成、疾患進行、および薬剤耐性を制御する腫瘍抑制因子、腫瘍原性因子、および転移因子として特徴付けている。miRNAの実験的過剰発現および/またはダウンレギュレーション/喪失は、これらの非コードRNAが調整する幅広い癌関連活性(増殖、アポトーシス、分化、クロマチンリモデリング、血管新生、上皮間葉(EMT)およびMET転移、代謝、および免疫応答)を反映して、細胞内で機能的および多面的結果をもたらす3。
MiRNAは、単一遺伝子としてコードされるか、またはゲノムクラスターに存在し、それらは核内で転写され、生物学的に成熟した、細胞質に局在する〜22ヌクレオチド(nt)miRNA種を生成する前に広範囲に処理される4。これらの小さなRNAは、転写後にその効果を発揮し、メッセンジャーRNA(mRNA)標的に配列特異的に結合する負の遺伝子調節因子として作用し、触媒RNA誘導サイレンシング複合体(RISC)をmRNA部位にもたらし、mRNA分解および/またはタンパク質翻訳のブロックをもたらす。MiRNAは動物系において極めて豊富なクラスのノンコーディングRNAであり、ヒトゲノムには2,654個の成熟miRNAが存在する(miRBaseリリース22.1)5。MiRNAは通常、そのmRNA標的に対して不完全な相補性を有する4。したがって、単一のmiRNAは、数十から数百の異なるmRNA標的を調節し、広範囲の生物学的経路に機能的に影響を与えることができる。miRNAベースのメカニズムの複雑さを増すために、単一のmRNAを複数の別個のmiRNAによって調節することができる。したがって、miRNAの調節不全が身体の恒常性バランスをどのように破壊し、ヒトの悪性腫瘍につながるかを調べることは困難です。
発表された研究の大部分は、疾患事象におけるそれらの役割を特徴付ける際に、単一のmiRNAに焦点を当てている。しかし、ヒトmiRNA遺伝子の約30%はクラスター化された単位(典型的には約10キロ塩基[kb])で組織化されており、それらはしばしば同じ向きで転写され、共発現され、非コードRNA調節の配位した複雑な系を示す6。最大のポリシストロニックヒトmiRNAクラスターは、54個のmiRNA前駆体を含む14q32クラスターである。ヒト癌に関連する最もよく研究されたクラスター化されたmiRNAユニットの1つは、非コードRNA、c13orf25のイントロン3内に存在するmiR-17、miR-18a、miR-19a、miR-20a、miR-19b-1、およびmiR-92-1からなるmiR-17-92ポリシストロニッククラスターである。miR-17-92クラスターは、造血悪性腫瘍において頻繁に増幅され、固形腫瘍において過剰発現し、細胞周期の進行、アポトーシス、および血管新生を促進する上で発癌性の役割を確立している7。さらに、非コード遺伝子Leu2のイントロン内に位置する腫瘍抑制性miR−15aおよびmiR−16−1クラスターは、白血病においてしばしば欠失し、広範囲の癌においてダウンレギュレートされ、抗アポトーシス遺伝子BCL2および追加の細胞周期進行遺伝子8を標的とすることによって腫瘍増殖を遮断するように機能する。miR-888クラスターは、高悪性度前立腺癌患者において上昇し、ヒト染色体Xq27.3 9,10に位置する7つのmiRNA遺伝子(miR-892c、-890、-888、-892a、-892b、-891b、および-891a)からなる。
miR-888クラスターは、Xq27-2にまたがるHPCX1遺伝子座(遺伝性前立腺癌、X-linked 1)内にマップされ、これは遺伝性前立腺癌ファミリー血統11、12、13、14、15、29の連鎖解析によって同定された。従来のmiRNAミス発現ツール(miRNA模倣物およびアンチセンス阻害剤)を用いた個々のmiR-888クラスター化メンバーの機能的特徴付けは、これらのmiRNAが前立腺腫瘍の成長および浸潤の調節において重複する役割を果たすことを示した9,10。しかし、これらの実験方法は、複数のmiR-888クラスター化されたメンバーが、組織の恒常性および癌進行を制御するために、非コードRNAネットワークにおいて相乗的または拮抗的にどのように作用するかを研究するのに容易には役立たない。ハイスループットCRISPR遺伝子編集技術を用いたこの記載された合理化されたプロトコルは、この知識ギャップを埋めるためにヒト癌に関連するmiRNAクラスター(例えば、miR−888クラスター)を分子的に解剖するように改変される。
細菌CRISPRおよびCRISPR関連(cas)遺伝子は、バクテリオファージに対する適応免疫を媒介する16。この古代の原核生物監視システムの発見は、インビトロとインビボの両方で、任意の所望のゲノム遺伝子座を容易に標的にし、広範囲の動物系および細胞型内でDNA配列を変更するための効率的な科学的ツールとして迅速に適応された16,17。この技術は、ヒトの疾患の文脈でmiRNAネットワークを調査する効果的な方法として大きな期待を寄せています。この目的のために、不死化ヒト前立腺癌細胞株(LNCaP、PC3-ML)におけるヒトX染色体上の〜35kbにまたがるmiR−888クラスターを研究するためのこのハイスループットCRISPR遺伝子編集プロトコルは、クラスターメンバーが癌進行経路をどのように調整するかを調査するために構築される。このアプローチは、任意のmiRNAクラスターの特性評価に適用することができ、研究者は、miRNAクラスター全体の欠失および個々のおよび組み合わせmiRNA遺伝子クラスター欠失を有するヒト細胞株を単一の実験内で迅速に生成することができる。
この手順では、ドキシサイクリン(DOX)誘導性レンチウイルス発現系を保有する安定な細胞株が確立され、これにより、研究者は構成的DOX誘導性プロモーターTRE3Gを介してストレプトコッカス・ピオゲネスCRISPR関連エンドヌクレアーゼCas9(csn1)遺伝子発現を制御することができます。Tet-On 3G二者構成系は、構成的ヒト伸長因子1アルファ(hEF1α)プロモーターを含み、Tet-On 3G遺伝子とブラストシジン耐性遺伝子(ブラストR)の両方の転写をバイシストロニック転写産物として駆動する。Tet-On 3Gトランスアクチベータータンパク質は、DOXの存在下でのみTRE3Gプロモーターに結合し、堅牢なCas9転写をもたらす。DOXがない場合、基底Cas9発現がないか、または非常に最小限である。したがって、研究者らは、CRISPR遺伝子編集ステップ中にDOXを添加した培地で増殖させた細胞において高いCas9タンパク質産生を誘導し、DOX離脱時の迅速なCAS9タンパク質クリアランスを制御することができる。
このプロトコルはまた、miRNAクラスター全体、個々のmiRNAヘアピン(premiRNA)領域、および/またはクラスター内のmiRNA遺伝子のサブセットに隣接する領域を標的とする合成CRISPR RNA(crRNA)オリゴヌクレオチドの設計についても記載しています。各設計されたcrRNAは、固有の5'末端20ntガイド配列(標的とする目的のゲノム配列に相補的)を含み、続いて、普遍的なトランス活性化CRISPR RNA(tracrRNA)オリゴヌクレオチド18との塩基対形成を可能にする不変22nt S. pyogenes反復配列(5'-XXXXXXXXXXXXXXXXX-GUUUUAGAGCUAUGCUGUUUUG-3')を含む。アニーリングされたcrRNAとtracrRNA(混合1:1の比率)は一緒になって、このプロトコルのガイドRNAとして機能します(図1A)。各実験では、2つの合成ガイドRNAをDOX誘導細胞にトランスフェクトし、細菌Cas9タンパク質を、除去対象のmiRNAクラスター領域に隣接するゲノムDNA部位(5'および3')に会合およびエスコートします(図1B)。
プロトスペーサー隣接モチーフ(PAM)配列(野生型 S. pyogenes Cas9の場合は5'-NGG-3')が細胞ゲノム中に存在し、ガイドRNA17によって標的とされる20nt DNA配列のすぐ隣に位置していなければならない。PAM配列は結合シグナルとして機能し、エンドヌクレアーゼCas9酵素の触媒領域を標的ゲノムDNA部位に配置し、続いてPAMの〜3nt上流に位置する指向性二本鎖(ds)DNA切断をもたらす。細胞のDNA修復機構は、切断されたDNA末端を修復し、完全なライゲーションをもたらすことができるが、しばしば非相同末端結合(NHEJ)が起こり、修復部位で小さな挿入または欠失(インデル)を引き起こす。miRNAは遺伝子間領域およびイントロニック領域内に位置することが多い非コード遺伝子であるため、これらのインデルは望ましくないナンセンス/ミスセンス変異を引き起こすリスクが低い。
これらの実験でガイドRNA複合体をコードする合成RNAオリゴヌクレオチド(アニーリングされたcrRNAとtracrRNA、1:1モル比)を採用することにより、この遺伝子ノックアウト戦略は、時間のかかるDNAベクターのサブクローニングを回避し、独自のガイドRNAの組み合わせを24ウェルフォーマットで細胞にトランスフェクトする際の大きな柔軟性を可能にします。PCR遺伝子型スクリーニング用の粗細胞溶解液の調製は、高価で時間のかかるDNA精製方法を回避し、合理化されたシングルコロニー細胞株の生成および表現型解析を可能にします。実際、このハイスループットCRISPR遺伝子編集プロトコルは、培養前立腺癌細胞株(LNCaP、PC3-ML)を32のユニークなガイドRNAの組み合わせで単一の実験でトランスフェクトし、〜35 kb miR-888クラスター領域全体に対して欠失を有するノックアウト株を生成するために首尾よく使用されてきました。miR-743およびmiR-891aファミリーに属するmiR-888クラスターメンバーに対するより小さな欠失の組み合わせ;miR-888クラスター内の個々のmiRNAメンバーの欠失も同様です。このような研究は、miRNAを治療および診断ツールとして診療所に翻訳する前に、クラスター化されたmiRNAが腫瘍増殖、攻撃性、および薬剤耐性を調節するためにどのように協調的に機能するかをより明確に過小評価するのに役立つでしょう。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.2 mL PCR tubes, flat cap</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>14-230-225</td>
			<td>Plasticware</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL Microcentrifuge Tubes</td>
			<td>Seal-Rite</td>
			<td>1615-5500</td>
			<td>Plasticware</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well tissue culture plate</td>
			<td>Corning Costar</td>
			<td>&#160;09761146</td>
			<td>Plasticware</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5x Phusion HF Buffer</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>F-518L</td>
			<td>PCR reagent, genotyping</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well tissue culture plate</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>FB012927</td>
			<td>Plasticware</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well tissue culture plate</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>08-772-2C</td>
			<td>Plasticware</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-CRISPR-Cas9 antibody [7A9-3A3], Mouse monoclonal</td>
			<td>AbCam</td>
			<td>ab191468</td>
			<td>Western blot reagent; 160 kDa; dilution 1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic-Antimycotic (100x)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15240062</td>
			<td>Tisuue culture reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BLAST nucleotide search engine</td>
			<td>National Center for Biotechnology Information</td>
			<td>NA</td>
			<td>Freeware; website: blast.ncbi.nlm.nih.gov</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blasticidin S, Hydrochloride, Streptomyces griseochromogenes</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td>CAS 589205</td>
			<td>CRISPR reagent; Chemical, Working stock = 1 mg/mL in water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Countess 3 Automated Cell Counter</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A50298</td>
			<td>Equipment; Cell counter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryogenic tubes</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>50001012</td>
			<td>Plasticware</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dharmacon CRISPR Design Tool</td>
			<td>Horizon Discovery Ltd.</td>
			<td>NA</td>
			<td>Freeware; website: horizondiscovery.com/en/ordering-and-calculation-tools/crispr-dna-region-designer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DharmaFECT siRNA Transfection Reagent #2</td>
			<td>Dharmacon, Inc.</td>
			<td>T-2002-02</td>
			<td>Transfection reagent; LNCaP and PC3-ML cell lines</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>&#160;BP231100</td>
			<td>Tisuue culture reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM Medium with L-Glutamine, 4.5g/L Glucose and Sodium Pyruvate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>MT10013CV</td>
			<td>Tisuue culture reagent; Media for PC3-ML cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Doxycycline Hydrochloride, Ready Made Solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D3072-1ML</td>
			<td>CRISPR reagent; Chemical, Working stock = 1 mg/mL stock in water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS, no calcium, no magnesium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190144</td>
			<td>Tisuue culture reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Edit-R CRISPR-Cas9 Synthetic tracrRNA, 20 nmol, designed</td>
			<td>Dharmacon, Inc.</td>
			<td>U-002005-20</td>
			<td>CRISPR reagent; Universal tracrRNA oligonucleotides</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Edit-R Modified Synthetic crRNA, 
			desalted/deprotected, 2 nmol</td>
			<td>Dharmacon, Inc.</td>
			<td>crRNA-460XXX</td>
			<td>CRISPR reagent; Designed crRNA oligonucleotides</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EditR Inducible Lentiviral hEF1aBlastCas9 Nuclease Particles, 50 &#956;L, 107 TU/mL</td>
			<td>Dharmacon, Inc.</td>
			<td>VCAS11227</td>
			<td>CRISPR reagent; Lenti-iCas9; Doxycycline-inducible lentiviral Streptococcus pyogenes Cas9 vector system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ensembl genomic viewer</td>
			<td>Ensembl</td>
			<td>NA</td>
			<td>Freeware; website: [ensembl.org] Use: Genome browser to identify a nucleotide seuqnces containing the miRNA cluster and surrounding gene/regulatory sequences.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GAPDH Antibody (FL-335), rabbit polyclonal</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc25778</td>
			<td>Western blot reagent; 37 kDa; dilution 1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel/PCR DNA Fragment Extraction Kit</td>
			<td>IBI Scientific</td>
			<td>IB47010</td>
			<td>Nucleic acid gel electrophoresis reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco Fetal Bovine Serum, certified</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>16000044</td>
			<td>Tisuue culture reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hexadimethrine bromide</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>H9268</td>
			<td>CRISPR reagent; Chemical, Working stock = 0.8 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immobilon-FL PVDF Membrane</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>IPFL10100</td>
			<td>Western blot reagent; nitrocellulose</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Intercept (TBS) Blocking Buffer</td>
			<td>LI-COR</td>
			<td>927-60001</td>
			<td>Western blot reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IRDye 680RD Goat anti-Mouse IgG Secondary Antibody</td>
			<td>LI-COR</td>
			<td>926-68070</td>
			<td>Western blot reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IRDye 800CW Goat anti-Rabbit IgG Secondary Antibody</td>
			<td>LI-COR</td>
			<td>926-32211</td>
			<td>Western blot reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>&#160;5425 R</td>
			<td>Plasticware</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>miRBase microRNA viewer</td>
			<td>miRBase</td>
			<td>NA</td>
			<td>Freeware; website: [mirbase.org] Use: Borowser lists all annotated miRNA hairpins, mature miRNA sequences and associated clustered miRNAs mapping within 10 kb.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NuPAGE 4 to 12%, Bis-Tris, 1.0 mm, Mini Protein Gel, 10-well</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>NP0321BOX</td>
			<td>Western blot reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Odyssey CLx Imaging System</td>
			<td>LI-COR</td>
			<td>CLx</td>
			<td>Equipment; Western blot imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM Reduced Serum Medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>31985062</td>
			<td>Transfection reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Owl D2 Wide-Gel Electrophoresis System</td>
			<td>Owl</td>
			<td>D2-BP</td>
			<td>Equipment; Nucleic acid gel electrophoresis system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR Primers, designed (single-stranded DNA oligonucleotides)</td>
			<td>Integrated DNA Technology</td>
			<td>NA</td>
			<td>PCR reagent, genotyping</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phusion High-Fidelity DNA Polymerase (2 U/&#181;L)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>F530S</td>
			<td>PCR reagent, genotyping</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RIPA Lysis Buffer 10x</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>20-188</td>
			<td>Western blot reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K Solution (20 mg/mL), RNA grade</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>25530049</td>
			<td>PCR reagent, genotyping</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase A, DNase and protease-free (10 mg/mL)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>EN0531</td>
			<td>PCR reagent, genotyping</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640 Medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>MT10041CV</td>
			<td>Tisuue culture reagent; Media for LNCaP cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SnapGene Viewer</td>
			<td>Snap Gene</td>
			<td>NA</td>
			<td>Freeware; website: [snapgene.com]&#160;Use: DNA sequence annotation software program to create a DNA file for gRNA design and which&#160; highlights the miRNA cluster locus (intergenic, intronic), each individual miRNA hairpin sequence belonging to the miRNA cluster, and other nearby coding and non-coding genes and/or regulatory features</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE Select Enzyme (1x), no phenol red</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12563029</td>
			<td>Tisuue culture reagent; Recombinant trypsin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure Agarose</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>16500100</td>
			<td>Nucleic acid gel electrophoresis reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Veriti 96-Well Fast Thermal Cycler</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>4375305</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XCell SureLock Mini-Cell Electrophoresis System</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>EI0001</td>
			<td>Equipment; Protein gel electrophoresis system</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

crispr gene editing tool for microrna cluster network analysis

マイクロRNA(miRNA)は、がんおよび転移の重要な細胞調節因子(腫瘍抑制因子、発癌促進因子)として浮上してきた。ほとんどの発表された研究は、がんにおける小さなRNAの役割を特徴付ける際に、単一のmiRNAに焦点を当てています。しかし、ヒトmiRNA遺伝子の〜30%は、しばしば共発現されるクラスター化された単位で組織化されており、非コードRNA調節の複雑で協調的なシステムを示している。非コードの小型RNAをクリニックに翻訳する前に、クラスター化されたmiRNAネットワークが腫瘍の増殖、がんの攻撃性、および薬剤耐性を調節するためにどのように協調的に機能するかをより明確に過小評価する必要があります。
前立腺癌の文脈において、長さ約35,000 bpの遺伝子座内に位置する7つのmiRNA遺伝子のゲノムクラスターの発癌性役割を研究するために、規則的に間隔をあけた短い回文反復(CRISPR)媒介遺伝子編集手順の使用が採用されている。このアプローチのために、ヒト癌細胞株を、DOX含有培地中で48時間増殖させたドキシサイクリン(DOX)誘導性Cas9ヌクレアーゼ用のレンチウイルスベクターに感染させた。その後、細胞を合成トランス活性化CRISPR RNA(tracrRNA)とゲノム部位特異的CRISPR RNA(crRNA)オリゴヌクレオチドとコンプレクテーションして同時トランスフェクトし、miRNAクラスター全体の欠失および個々のまたは組み合わせmiRNA遺伝子クラスター欠失を1回の実験で有するがん細胞株の迅速な生成を可能にした。
このハイスループット遺伝子編集システムの利点は、時間のかかるDNAベクターのサブクローニングを回避できること、24ウェルフォーマットで独自のガイドRNAの組み合わせで細胞をトランスフェクトする柔軟性、および粗細胞溶解物を使用した低コストのPCRジェノタイピングです。この合理化されたアプローチを用いた研究は、miRNAクラスターメンバー間の機能的冗長性および相乗的/拮抗的相互作用を明らかにすることを約束し、ヒト疾患に関与する複雑な小さなノンコーディングRNAネットワークを特徴付けるのに役立ち、将来の治療設計により良い情報を提供する。

このハイスループットCRISPR欠失プロトコルは、前立腺癌の関連で研究されたmiR-888クラスターを標的とする合成オリゴヌクレオチドガイドRNAを用いたCas9誘導性LNCaPおよびPC3-MLヒト癌細胞株のトランスフェクションを用いて首尾よく採用された。miR-888クラスターは、発現プロファイリングスクリーニングにおいて、低悪性度および非癌患者と比較して、高悪性度疾患を有する前立腺癌患者にお?...

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CRISPR Gene Editing Tool for MicroRNA Cluster Network Analysis

このプロトコルは、マイクロRNAクラスターネットワーク解析のための、規則的に間隔をあけた短い回文反復(CRISPR)遺伝子編集ワークフローをクラスター化したハイスループットのクラスター化を記述しており、1回の実験で35 kbのユニークなmiRNAクラスターメンバー欠失の組み合わせを持つ遺伝子組み換え細胞株のパネルを迅速に生成できます。

マイクロRNAクラスターネットワーク解析のためのCRISPR遺伝子編集ツール

MicroRNAs (miRNAs) have emerged as important cellular regulators (tumor suppressors, pro-oncogenic factors) of cancer and metastasis. Most published ...

このプロトコルは、ハイスループットCRISPR遺伝子編集ワークフローを使用して、組織化およびクラスター化されたユニットのマイクロRNA遺伝子を分子的に解剖します。そして、これらのノンコーディングRNAネットワークが癌の進行経路をどのように調整するかを決定すること。このCRISPR遺伝子編集手順により、研究者は、時間のかかるDNAベクターサブクローニングを回避しながら、独自のマイクロRNAクラスター欠失の組み合わせを持つ細胞株のパネル全体を迅速に生成できます。この方法は、マイクロRNAを治療および診断ツールとして臨床に翻訳する前に、クラスター化されたマイクロRNAがどのように協調して腫瘍の成長、攻撃性、および薬剤耐性を調節するかをより明確に理解します。手順を実演するのは、私の研究室の研究助手であるグレース・イーです。まず、DNA配列アノテーションソフトウェアプログラムを使用して、少なくとも1キロバイトの周囲のゲノム領域における目的のマイクロRNAクラスター領域の完全なゲノム配列を含むDNAファイルを作成します。次に、標的マイクロRNA遺伝子座ごとに4つの固有のCRISPR RNAを設計します。マイクロRNAヘアピンクラスターの5つのプライムの相補的なDNA配列を標的とする2つの設計されたCRISPR RNAと、マイクロRNAヘアピンクラスターの3つのプライムの相補的なDNA配列を標的とする2つの設計されたCRISPR RNAです。作成したDNAファイルで特徴編集ツールを使用して、合成する設計した各CRISPR RNAのDNAターゲット配列をマークします。CRISPR細胞株をジェノタイピングするための標的マイクロRNAクラスター領域に隣接するPCRプライマーを設計および合成しました。新たに生成されたレンチ誘導性Cas9細胞株に対してドキシサイクリン濃度曲線を実行し、Cas9タンパク質誘導の最適条件を決定します。プレートは、各6ウェルプレートの1ウェルあたり10個の第4細胞を5回、摂氏37度、5%二酸化炭素で、好ましい培地中で24時間増殖させる。0 5100、150、250〜500ナノグラム/ミリリットルの範囲の最終dox濃度曲線を有する好ましい培地でdoxを希釈する。座っている各6ウェルプレートのウェルに1から6までのラベルを付けます。培地を取り出し、適切なdox濃度と交換します。プレートを1〜4時間、24時間、48時間、72時間のドックス誘導と120時間のドックス離脱後まで成長させます。各時点でプレートのウェルを収穫します。細胞ペレットとリパバッファーを処理して、ライセートを単離します。40マイクログラムのタンパク質を用いてウェスタンブロット解析を行い、Cas9タンパク質誘導を測定し、最適なCas9濃度を決定します。紙の上に、マイクロRNAクラスター全体、さまざまなクラスター化されたマイクロRNA遺伝子の組み合わせ、および個々のマイクロRNAクラスターメンバーを標的とする24ウェルプレートの各ウェルにトランスセクトされる5つのプライムおよび3つのプライムCRISPR RNAペアの組み合わせをマッピングします。24穴プレートの1ウェルあたり10〜4細胞を5回で9細胞株をキャストしたレンティ誘導性プレートを、最適化されたdox濃度を含む好ましい培地でプレートする。細胞を摂氏37度、5%二酸化炭素で24〜48時間増殖させて、Cas9タンパク質発現を誘導します。レンチ誘導性Cas9細胞に、調製した5つのプライムガイドRNAと3つのプライムガイドRNAをトランスフェクトします。標的マイクロRNA遺伝子座ごとに4本の1.5ミリリットルマイクロ遠心チューブにラベルを付けます。各チューブで、トレーサーRNAと固有のCRISPR RNAのモル比を1対1で混合して、2つのマイクロモルガイドRNA複合体を形成します。2.5マイクロリットルのトレーサーRNA、1.25マイクロリットルの5つのプライムポジショニングCRISPR RNA、1.25マイクロリットルの3つのプライムポジショニングCRISPR RNA、および5マイクロリットルの10ミリモルトリスHCL pH 7.5バッファーを1.5ミリリットルの遠沈管に加えます。マイクロ遠心分離機で 16, 000 倍の G で 30 秒間混合します。室温で5分間インキュベートします。40マイクロリットルの還元血清培地で各チューブに10マイクロリットルのガイドRNA複合体反応させた。上下にピペッティングして穏やかに混ぜます。清潔な1.5ミリリットルの遠沈管で、2マイクロリットルのトランスフェクション試薬と48マイクロリットルの還元血清培地を上下にピペッティングして穏やかに混合します。室温で5分間インキュベートします。50マイクロリットルのガイドRNAミックスを含む各チューブに、50マイクロリットルの希釈トランスフェクション試薬を加えます。混合物をゆっくりと上下に一度ピペットで混ぜます。室温で20分間インキュベートします。100マイクロリットルのガイドRNAトランスフェクションミックスを含む各チューブに、ドキシサイクリンを添加した400マイクロリットルの抗生物質フリー培地を追加します。ピペットでやさしく混ぜます。ドキシサイクリン誘導レンチ誘導性Cas9細胞から培地を除去します。24ウェルプレート実験マップに基づいて、500マイクロリットルの培地ドキシサイクリンガイドRNA変換ミックスを追加します。トランスフェクトした細胞を摂氏37度の5%二酸化炭素中で48時間インキュベートします。培地をドキシサイクリンを含まない新しく調製した培地と交換する。細胞が摂氏24度と48%の二酸化炭素でさらに37〜5時間回復するのを待ちます。トランスフェクトされた細胞を回収し、ジェノタイピングと単一細胞の妄想に備えます。150マイクロリットルの再懸濁セルを3つの部分に分けます。トランスフェクトした細胞の3分の1を培地と10%DMSOで凍結し、クライオバイアルに入れて長期保存します。トランスフェクトした細胞の3分の1を、ジェノタイピングのためにきれいな0.2ミリリットルのPCRチューブに移します。トランスフェクトした細胞の最後の3分の1を計数および96ウェルプレートフォーマットで希釈して調製し、単一細胞コロニーを生成します。12チャンネルのマルチピペッターと滅菌試薬リザーバーを使用して、希釈ごとにウェルあたり100マイクロリットルの希釈細胞を2列のプレートに追加します。細胞が単一細胞コロニーの増殖のために共流に成長するまで4〜6週間待ちます。ジェノタイピングのために約10〜15個の単一細胞コロニーを収集します。標的マイクロRNA遺伝子座ごとに少なくとも3つの独立したノックアウトシングルセルコロニー株を同定します。野生型単一細胞株をコントロールとして保持します。細胞ペレットを4マイクロリットルの5つのX DNAポリメラーゼバッファー、1マイクロリットルのプロテイナーゼK、1マイクロリットルのRNase A、およびヌクレアーゼフリーウォーターに合計20マイクロリットルまで再懸濁します。サーモサイクラーの細胞を摂氏56度で30分間、摂氏96度で5分間シラミを刺します。細胞ライセートは、PCRジェノタイピングの準備ができるまで摂氏マイナス20度で保存します。ガイドRNAの5つのプライムおよび3つのプライムガイドRNA標的部位に隣接するように設計されたPCRプライマーを使用して、PCRジェノタイピング反応を実行します。テキスト原稿に記載されているプログラムを使用して、サーモサイクラーでPCR反応を実行します。PCR産物を電気泳動分析用の1%アガロースゲルにロードします。ノックアウト遺伝子型の予測分子サイズの単離されたPCRフラグメントからDNAを抽出します。DNAシーケンシング用のサンプルを準備します。CRISPR反応が成功したことを検証し、単離されたPCR断片のDNAシーケンシングを実行して、Cas9切断部位を特定し、マイクロRNA遺伝子座の欠失を確認します。独自のCRISPR RNAは、miR-888クラスター領域の35キロ塩基全体を標的として設計されました。miR-743ファミリーまたはmiR-891ファミリー内のより小さなクラスターの組み合わせ、およびマイクロRNA欠失。PCR反応のゲル電気泳動分析は、ノックアウト遺伝子型を表す予測DNA断片サイズが各CRISPRトランスフェクションで増幅されることを示しました。単一細胞コロニーは、配列検証中のPCRによって遺伝子型決定された。これらの単離されたノックアウトPCRフラグメントのDNAシーケンシングにより、トランスフェクトされた5つのプライムおよび3つのプライムガイドRNAが、PAMサイトの約3ヌクレオチド上流にCas9切断ライゲーションを指示し、標的マイクロRNA遺伝子座のゲノム喪失を検証したことを確認しました。miR-891aノックアウト細胞と野生型細胞を比較するWST-1増殖アッセイは、マイクロRNA模倣レンチウイルスベクターの過剰発現が前立腺細胞増殖を誘導することを確認し、したがってmiR-891の損失が相互効果を示すと予測された。慎重なガイドRNA設計に加えて、各マイクロRNAノックアウトラインを介して単一細胞コロニーを迅速に生成することが重要です。マイクロRNAノックアウト細胞が生存率の増殖を低下させ、野生型細胞との混合集団で容易に競合する場合に特に重要です。定量的リアルタイムPCR、ノーザンブロット、RNAシーケンシングなどの追加の方法を実行して、CRISPRノックアウト細胞株が欠失遺伝子座の成熟マイクロRNAを発現しないことを確認する必要があります。

Research

JoVE Journal

Biology

Microarray Analysis for Saccharomyces cerevisiae

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マイクロアレイ解析のためのサッカロマイセスセレビシエ</em

In this protocol, gene expression in yeast (Saccharomyces cerevisiae) is changed after exposure to oxidative stress induced by the addition of hydrogen ...

Using SecM Arrest Sequence as a Tool to Isolate Ribosome Bound Polypeptides

リボソーム結合したポリペプチドを単離するためのツールと​​してSECM逮捕シーケンスを使用して、

Extensive research has provided ample evidences suggesting that protein folding in the cell is a co-translational process1-5. However, the exact pathway ...

Analysis of Autophagy in Penicillium chrysogenum by Using Starvation Pads in Combination With Fluorescence Microscopy

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オートファジーの解析で<em&gt;ペニシリウム·クリソゲヌム</em&gt;蛍光顕微鏡と組み合わせて飢餓パッドを使用した

The study of cellular quality control systems has emerged as a highly dynamic and relevant field of contemporary research. It has become clear that cells ...

Silencing the Spark: CRISPR/Cas9 Genome Editing in Weakly Electric Fish

火花のサイレンシング:弱い電気魚のCRISPR/Cas9ゲノム編集

Electroreception and electrogenesis have changed in the evolutionary history of vertebrates. There is a striking degree of convergence in these ...

Pupal and Adult Injections for RNAi and CRISPR Gene Editing in Nasonia vitripennis

Pupal and Adult Injections for RNAi and CRISPR Gene Editing in Nasonia vitripennis

ナソニアビトリペニスにおけるRNAiおよびCRISPR遺伝子編集のためのプパルおよび成人注射

The jewel wasp, Nasonia vitripennis, has become an efficient model system to study epigenetics of haplo-diploid sex determination, B-chromosome biology, ...

TGF-&#946;-mediated Endothelial to Mesenchymal Transition (EndMT) and the Functional Assessment of EndMT Effectors using CRISPR/Cas9 Gene Editing

TGF-ÃƒÅ½Ã‚Â²-mediated Endothelial to Mesenchymal Transition EndMT and the Functional Assessment of EndMT Effectors using CRISPR/Cas9 Gene Editing

TGF β媒介性間葉転移(EndMT)およびCRISPR/Cas9遺伝子編集を用いたEndMTエフェクターの機能評価

In response to specific external cues and the activation of certain transcription factors, endothelial cells can differentiate into a mesenchymal-like ...

In Vitro Analysis of E3 Ubiquitin Ligase Function

In Vitro Analysis of E3 Ubiquitin Ligase Function

イン・ヴィトロ E3ユビキチンリガーゼ関数の解析

The covalent attachment of ubiquitin (Ub) to internal lysine residue(s) of a substrate protein, a process termed ubiquitylation, represents one of the ...

CRISPR/Cas9 Gene Editing of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells for Gene Therapy Applications

遺伝子治療アプリケーションのための造血幹細胞および前駆細胞のCRISPR/Cas9遺伝子編集

CRISPR/Cas9 is a highly versatile and efficient gene-editing tool adopted widely to correct various genetic mutations. The feasibility of gene ...

Embryo Injection Technique for Gene Editing in the Black-Legged Tick, Ixodes scapularis

Embryo Injection Technique for Gene Editing in the Black-Legged Tick, Ixodes scapularis

クロマダニの遺伝子編集のための胚注入技術

Ticks can transmit various viral, bacterial, and protozoan pathogens and are therefore considered vectors of medical and veterinary importance. Despite ...

Protocols for CRISPR/Cas9 Mutagenesis of the Oriental Fruit Fly Bactrocera dorsalis

Protocols for CRISPR/Cas9 Mutagenesis of the Oriental Fruit Fly Bactrocera dorsalis

オリエンタルショウジョウバエバクトセラ背側のCRISPR/Cas9変異誘発のためのプロトコル

The Oriental fruit fly, Bactrocera dorsalis, is a highly invasive and adaptive pest species that causes damage to citrus and over 150 other fruit crops ...