Name: crispr gene editing tool for microrna cluster network analysis
Uploaded: 2022-04-25T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about CRISPR Gene Editing Tool for MicroRNA Cluster Network Analysis at JoVE.com

PC3-ML cellelinjer ble vennlig levert av Stearn (Drexel University College of Medicine). Justin Toxey hjalp til med PCR-genotyping. Dette arbeidet ble støttet av et Breedan Adams Foundation Grant, et Ryan Translational Research Fund og et Commonwealth Health Research Board Grant (CHRB-274-11-20) til AE-K.

1. Forberedelse for CRISPR-genredigering og veilede RNA-design for å generere miRNA-klynge knockoutcellelinjer
<ol><li>Lag en DNA-fil som inneholder den komplette genomiske sekvensen av miRNA-klyngeområdet av interesse (intergen, intronic) og minst 1 kB av omkringliggende genomiske regioner ved hjelp av et DNA-sekvensmerknadsprogram19.<ol><li>Bruk et funksjonsredigeringsverktøy i den opprettede DNA-filen for å merke det målrettede miRNA-klyngelokuset (inter...

<ol>
	<li>Hasegawa, T., Lewis, H., Esquela-Kerscher, A., Laurence, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Translating MicroRNAs to the Clinic. , 329-369 (2017).</li><li>Lewis, H., Esquela-Kerscher, A., Thiagalingam, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Systems Biology of Cancer. , 134-153 (2015).</li><li>Esquela-Kerscher, A., Slack, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oncomirs+-+microRNAs+with+a+role+in+cancer.">Oncomirs - microRNAs with a role in cancer.</a> Nature Reviews Cancer. 6 (4), 259-269 (2006).</li><li>Breving, K., Esquela-Kerscher, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+complexities+of+microRNA+regulation:+mirandering+around+the+rules.">The complexities of microRNA regulation: mirandering around the rules.</a> The International Journal of Biochemistry &amp; Cell Biology. 42 (8), 1316-1329 (2010).</li><li>Griffiths-Jones, S., Saini, H. K., van Dongen, S., Enright, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=miRBase:+tools+for+microRNA+genomics.">miRBase: tools for microRNA genomics.</a> Nucleic Acids Research. 36, 154-158 (2008).</li><li>Kabekkodu, S. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clustered+miRNAs+and+their+role+in+biological+functions+and+diseases.">Clustered miRNAs and their role in biological functions and diseases.</a> Biological Reviews. 93 (4), 1955-1986 (2018).</li><li>Xiang, J., Wu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Feud+or+friend?+The+role+of+the+miR-17-92+cluster+in+tumorigenesis.">Feud or friend? The role of the miR-17-92 cluster in tumorigenesis.</a> Current Genomics. 11 (2), 129-135 (2010).</li><li>Aqeilan, R. I., Calin, G. A., Croce, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=miR-15a+and+miR-16-1+in+cancer:+discovery,+function+and+future+perspectives.">miR-15a and miR-16-1 in cancer: discovery, function and future perspectives.</a> Cell Death &amp; Differentiation. 17 (2), 215-220 (2010).</li><li>Hasegawa, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+and+evidence+of+the+miR-888+cluster+as+a+novel+cancer+network+in+prostate.">Characterization and evidence of the miR-888 cluster as a novel cancer network in prostate.</a> Molecular Cancer Research. , (2018).</li><li>Lewis, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=miR-888+is+an+expressed+prostatic+secretions-derived+microRNA+that+promotes+prostate+cell+growth+and+migration.">miR-888 is an expressed prostatic secretions-derived microRNA that promotes prostate cell growth and migration.</a> Cell Cycle. 13 (2), 227-239 (2014).</li><li>Xu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+a+prostate+cancer+susceptibility+locus+on+the+X+chromosome.">Evidence for a prostate cancer susceptibility locus on the X chromosome.</a> Nature Genetics. 20 (2), 175-179 (1998).</li><li>Schleutker, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genetic+epidemiological+study+of+hereditary+prostate+cancer+(HPC)+in+Finland:+frequent+HPCX+linkage+in+families+with+late-onset+disease.">A genetic epidemiological study of hereditary prostate cancer (HPC) in Finland: frequent HPCX linkage in families with late-onset disease.</a> Clinical Cancer Research. 6 (12), 4810-4815 (2000).</li><li>Farnham, J. M., Camp, N. J., Swensen, J., Tavtigian, S. V., Albright, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Confirmation+of+the+HPCX+prostate+cancer+predisposition+locus+in+large+Utah+prostate+cancer+pedigrees.">Confirmation of the HPCX prostate cancer predisposition locus in large Utah prostate cancer pedigrees.</a> Human Genetics. 116 (3), 179-185 (2005).</li><li>Brown, W. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hereditary+prostate+cancer+in+African+American+families:+linkage+analysis+using+markers+that+map+to+five+candidate+susceptibility+loci.">Hereditary prostate cancer in African American families: linkage analysis using markers that map to five candidate susceptibility loci.</a> British Journal Of Cancer. 90 (2), 510-514 (2004).</li><li>Bochum, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Confirmation+of+the+prostate+cancer+susceptibility+locus+HPCX+in+a+set+of+104+German+prostate+cancer+families.">Confirmation of the prostate cancer susceptibility locus HPCX in a set of 104 German prostate cancer families.</a> Prostate. 52 (1), 12-19 (2002).</li><li>Doudna, J. A., Charpentier, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+editing.+The+new+frontier+of+genome+engineering+with+CRISPR-Cas9.">Genome editing. The new frontier of genome engineering with CRISPR-Cas9.</a> Science. 346 (6213), 1258096 (2014).</li><li>Adli, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+CRISPR+tool+kit+for+genome+editing+and+beyond.">The CRISPR tool kit for genome editing and beyond.</a> Nature Communications. 9 (1), (2018).</li><li>Jinek, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+programmable+dual-RNA+guided+DNA+endonuclease+in+adaptive+bacterial+immunity.">A programmable dual-RNA guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity.</a> Science. 337 (6096), 816-821 (2012).</li><li>. SnapGene&#174; software (from Insightful Science; available at snapgene.com) Available from: <a target="_blank" href="https://www.snapgene.com">https://www.snapgene.com</a> (2022)</li><li>. Ensembl Release 104 genome browser (from EMBL-EBI) Available from: <a target="_blank" href="https://www.ensembl.org">https://www.ensembl.org</a> (2022)</li><li>Howe, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ensembl+2021.">Ensembl 2021.</a> Nucleic Acids Research. 49, 884-891 (2021).</li><li>. miRBase: the microRNA database, Release 22.1 (from Griffiths-Jones laboratory) Available from: <a target="_blank" href="https://www.mirbase.org">https://www.mirbase.org</a> (2022)</li><li>. Dharmacon CRISPR Design Tool (from Dharmacon) Available from: <a target="_blank" href="https://www.horizondiscovery.com/en/ordering-and-calculation-tools/crispr-dna-region-designer">https://www.horizondiscovery.com/en/ordering-and-calculation-tools/crispr-dna-region-designer</a> (2022)</li><li>. Off-Spotter (Venetia Pliatsika &amp; Isidore Rigoutsos of the Jefferson Computational Medicine Center) Available from: <a target="_blank" href="https://cm.jefferson.edu/Off-Spotter/">https://cm.jefferson.edu/Off-Spotter/</a> (2022)</li><li>Bao, X. R., Pan, Y., Lee, C. M., Davis, T. H., Bao, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tools+for+experimental+and+computational+analyses+of+off-target+editing+by+programmable+nucleases.">Tools for experimental and computational analyses of off-target editing by programmable nucleases.</a> Nature Protocols. 16 (1), 10-26 (2021).</li><li>. Dharmacon DharmaFECT Transfection Reagent Cell Type Guide. Choose Dharmacon DharmaFECT 1, 2, 3, or 4 for optimal transfection of siRNA or miRNA reagents Available from: <a target="_blank" href="https://horizondiscovery.com/-/media-Files/Horizon/resources/Selection-guides/dharmafect-cell-type-guidelines.pdf">https://horizondiscovery.com/-/media-Files/Horizon/resources/Selection-guides/dharmafect-cell-type-guidelines.pdf</a> (2022)</li><li>Baffoe-Bonnie, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+major+locus+for+hereditary+prostate+cancer+in+Finland:+localization+by+linkage+disequilibrium+of+a+haplotype+in+the+HPCX+region.">A major locus for hereditary prostate cancer in Finland: localization by linkage disequilibrium of a haplotype in the HPCX region.</a> Human Genetics. 117 (4), 307-316 (2005).</li><li>Zhang, R., Peng, Y., Wang, W., Su, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+evolution+of+an+X-linked+microRNA+cluster+in+primates.">Rapid evolution of an X-linked microRNA cluster in primates.</a> Genome Research. 17 (5), 612-617 (2007).</li><li>Ohnuki, Y., Marnell, M. M., Babcock, M. S., Lechner, J. F., Kaighn, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromosomal+analysis+of+human+prostatic+adenocarcinoma+cell+lines.">Chromosomal analysis of human prostatic adenocarcinoma cell lines.</a> Cancer Research. 40 (3), 524-534 (1980).</li><li>Beheshti, B., Karaskova, J., Park, P. C., Squire, J. A., Beatty, B. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+high+frequency+of+chromosomal+rearrangements+in+the+centromeric+regions+of+prostate+cancer+cell+lines+by+sequential+giemsa+banding+and+spectral+karyotyping.">Identification of a high frequency of chromosomal rearrangements in the centromeric regions of prostate cancer cell lines by sequential giemsa banding and spectral karyotyping.</a> Molecular Diagnosis. 5 (1), 23-32 (2000).</li></ol>

Denne CRISPR-genredigeringsprosedyren lar etterforskeren raskt generere et helt panel av cellelinjer som bærer unike miRNA-klyngeslettingskombinasjoner. Transfeksjonen av syntetiske guide-RNA-er sammensatt av 5'- og 3'-genomiske stedsspesifikke crRNA-er annealed med syntetisk tracrRNA (1: 1 molarforhold) i denne protokollen unngår tidkrevende plasmidvektorunderkloning og muliggjør en mer fleksibel og høy gjennomstrømnings eksperimentell design ved bruk av et 24-brønns format. Genereringen av cellelinjer som bærer ...

Bedre forskningsverktøy er nødvendig for å undersøke bidraget fra ikke-kodende RNA i menneskelig sykdom. MiRNA-dysregulering observeres ofte ved menneskelige lidelser som kreft når man sammenligner uttrykksprofilene til disse små ikke-kodende RNA-ene i vev og kroppsvæsker (f.eks. blod, urin) hos kreftpasienter versus ikke-kreft, friske individer, bruk av mikromatriser, kvantitativ sanntids PCR (qRT-PCR) og neste generasjons dype sekvenseringsteknologier 1,2 . Nylig arbeid har karakterisert en stor delmengde av disse miRNA som tumorundertrykkende, onkogene og metastasefaktorer som styrer tumordannelse, sykdomsprogresjon og stoffresistens. Eksperimentell overekspresjon og/eller nedregulering/tap av miRNA resulterer i funksjonelle og pleiotropiske konsekvenser i cellen, noe som gjenspeiler det brede spekteret av kreftassosierte aktiviteter disse ikke-kodende RNA-ene koordinerer - vekst, apoptose, differensiering, kromatinremodellering, angiogenese, epitelial til mesenkymal (EMT) og MET-overganger, metabolisme og immunrespons3.
MiRNA er kodet som enkeltgener eller bor i genomiske klynger, som transkriberes i kjernen og behandles grundig før de genererer de biologisk modne, enkeltstrengede ~ 22 nukleotid (nt) miRNA-artene lokalisert i cytoplasma4. Disse små RNA-ene utøver sine effekter posttranskripsjonelt og fungerer som negative genregulatorer som binder seg til messenger-RNA (mRNA) -mål på en sekvensspesifikk måte for å bringe det katalytiske RNA-induserte silencingkomplekset (RISC) til mRNA-stedet, noe som resulterer i mRNA-nedbrytning og / eller en blokk i proteinoversettelse. MiRNA er en ekstremt rikelig klasse av ikke-kodende RNA i dyresystemer, og 2,654 modne miRNA eksisterer i det menneskelige genomet (miRBase release 22.1)5. MiRNA assosieres vanligvis med ufullstendig komplementaritet til deres mRNA-mål4. Derfor kan et enkelt miRNA regulere titalls til hundrevis av forskjellige mRNA-mål og funksjonelt påvirke et stort utvalg av biologiske veier. For å øke kompleksiteten til miRNA-baserte mekanismer, kan et enkelt mRNA reguleres av flere, distinkte miRNA-er. Det er derfor utfordrende å undersøke hvordan miRNA dysregulering forstyrrer kroppens homeostatiske balanse og fører til menneskelig malignitet.
Flertallet av publiserte studier har fokusert på et enkelt miRNA når de karakteriserer sin rolle i sykdomshendelser. Imidlertid er ~ 30% av humane miRNA-gener organisert i grupperte enheter (typisk ~ 10 kilobaser [kb]) som ofte transkriberes i samme retning og uttrykkes samtidig, noe som indikerer et koordinert og komplekst system med ikke-kodende RNA-regulering6. Den største polycistroniske humane miRNA-klyngen er 14q32-klyngen som består av 54 miRNA-forløpere. En av de mest studerte grupperte miRNA-enhetene assosiert med humane kreftformer er miR-17-92 polycistronisk klynge bestående av miR-17, miR-18a, miR-19a, miR-20a, miR-19b-1 og miR-92-1 som bor innenfor intron 3 av det ikke-kodende RNA, c13orf25. MiR-17-92-klyngen forsterkes ofte i hematopoietiske maligniteter og overuttrykkes i solide svulster og har etablert onkogene roller for å fremme cellesyklusprogresjon, apoptose og angiogenese7. I tillegg blir den tumorundertrykkende miR-15a- og miR-16-1-klyngen som ligger innenfor intronet til det ikke-kodende genet Leu2 ofte slettet i leukemier og nedregulert i et stort spekter av kreftformer, og fungerer for å blokkere tumorvekst ved å målrette det antiapoptotiske genet BCL2 og ytterligere cellesyklusprogresjonsgener8. MiR-888-klyngen er forhøyet hos pasienter med høygradig prostatakreft og består av syv miRNA-gener (miR-892c, -890, -888, -892a, -892b, -891b og -891a) lokalisert på humant kromosom Xq27.3 9,10.
MiR-888-klyngekartene i HPCX1-lokuset (arvelig prostatakreft, X-bundet 1) som spenner over Xq27-2, som ble identifisert ved koblingsanalyse av arvelige stamtavler for prostatakreftfamilien 11,12,13,14,15,29. Funksjonell karakterisering av individuelle miR-888 grupperte medlemmer ved hjelp av konvensjonelle miRNA-feiluttrykksverktøy - miRNA-etterligninger og antisense-hemmere - indikerte at disse miRNA-ene spiller overlappende roller i regulering av prostatasvulstvekst og invasjon 9,10. Imidlertid egner disse eksperimentelle metodene seg ikke lett til å studere hvordan flere miR-888 grupperte medlemmer opptrer synergistisk eller antagonistisk i et ikke-kodende RNA-nettverk for å kontrollere vevshomeostase og kreftprogresjon. Denne beskrevne strømlinjeformede protokollen ved hjelp av CRISPR-genredigeringsteknologi med høy gjennomstrømning er modifisert for å molekylært dissekere miRNA-klynger assosiert med humane kreftformer (f.eks. MiR-888-klyngen) for å bygge bro over dette kunnskapsgapet.
Bakterielle CRISPR- og CRISPR-assosierte (cas) gener formidler adaptiv immunitet mot bakteriofager16. Oppdagelsen av dette gamle prokaryote overvåkingssystemet ble raskt tilpasset som et effektivt vitenskapelig verktøy for enkelt å målrette mot ethvert ønsket genomisk lokus og gjøre DNA-sekvensendringer innenfor et stort utvalg av dyresystemer og celletyper både in vitro og in vivo16,17. Denne teknikken har stort løfte som en effektiv metode for å forhøre miRNA-nettverk i sammenheng med menneskelig sykdom. For dette formål er denne CRISPR-genredigeringsprotokollen med høy gjennomstrømning for å studere miR-888-klyngen som spenner over ~ 35 kb på menneskelig kromosom X i udødelige humane prostatakreftcellelinjer (LNCaP, PC3-ML) konstruert for å forhøre hvordan klyngemedlemmer koordinerer kreftprogresjonsveier. Denne tilnærmingen kan brukes til å karakterisere en hvilken som helst miRNA-klynge og lar etterforskere raskt generere humane cellelinjer som bærer hele miRNA-klyngeslettingen og individuelle og kombinasjon miRNA-genklyngeslettinger i et enkelt eksperiment.
I denne prosedyren etableres stabile cellelinjer som bærer et doxycyklin (DOX) induserbart lentiviralt ekspresjonssystem som gjør det mulig for etterforskeren å kontrollere Streptococcus pyogenes CRISPR-assosiert endonuklease Cas9 (csn1) genuttrykk gjennom den konstitutive DOX-induserbare promotoren TRE3G. Tet-On 3G-topartssystemet innebærer en konstitutiv menneskelig forlengelsesfaktor 1 alfa (hEF1alpha) promotor for å drive transkripsjonen av både Tet-On 3G-genet og blasticidinresistensgenet (BlastR) som en bicistronisk transkripsjon. Tet-On 3G-transaktivatorproteinet binder seg bare til TRE3G-promotoren i nærvær av DOX, noe som resulterer i robust Cas9-transkripsjon. I fravær av DOX er det ingen eller svært minimal basal Cas9-uttrykk. Derfor kan etterforskeren indusere høy Cas9-proteinproduksjon i celler dyrket i medier supplert med DOX under CRISPR-genredigeringstrinnene og kontroll for rask CAS9-proteinclearance ved DOX-seponering.
Denne protokollen beskriver også utformingen av syntetiske CRISPR RNA (crRNA) oligonukleotider rettet mot regioner som flankerer hele miRNA-klyngen, individuelle miRNA-hårnålsområder (premiRNA) og/eller undergrupper av miRNA-gener i klyngen. Hvert designet crRNA inneholder en unik 5'-terminal 20 nt guidesekvens (komplementær til den genomiske sekvensen av interesse som skal målrettes), etterfulgt av en invariant 22 nt S. pyogenes repetisjonssekvens (5'-XXXXXXXXXXXXXXXXXXXX-GUUUUAGAGCUAUGCUGUUUUG-3') som muliggjør baseparing med den universelle transaktiverende CRISPR RNA (tracrRNA) oligonukleotider18. Sammen fungerer det glødede crRNA og tracrRNA (blandet 1: 1-forhold) som veiledende RNA for denne protokollen (figur 1A). I hvert eksperiment blir to syntetiske guide-RNA transfisert til DOX-induserte celler for å knytte og eskortere det bakterielle Cas9-proteinet til de genomiske DNA-stedene (5 'og 3') som flankerer miRNA-klyngeområdet som er målrettet for fjerning (figur 1B).
En protospacer tilstøtende motiv (PAM) sekvens (5'-NGG-3' for vill type S. pyogenes Cas9) må være tilstede i cellegenomet og plassert umiddelbart ved siden av 20 nt DNA-sekvensen målrettet av guiden RNA17. PAM-sekvensen fungerer som et bindende signal og posisjonerer den katalytiske regionen av endonuklease Cas9-enzymet på det målrettede genomiske DNA-stedet, og fører deretter til rettet, dobbeltstrenget (ds) DNA-spaltning lokalisert ~ 3 nt oppstrøms pam. Cellens DNA-reparasjonsmaskiner reparerer de spaltede DNA-endene, noe som kan resultere i perfekt ligering, men ofte oppstår ikke-homogen endeforbindelse (NHEJ), noe som forårsaker små innsettinger eller slettinger (indels) på reparasjonsstedet. Siden miRNA er ikke-kodende gener som ofte befinner seg i intergene og introniske regioner, har disse indels en lav risiko for å skape uønskede tull / missense mutasjoner.
Ved å bruke syntetiske RNA oligonukleotider (annealed crRNA og tracrRNA, 1: 1 molar ratio) koding for guide RNA-komplekset i disse forsøkene, unngår denne gen knockout-strategien tidkrevende DNA-vektorunderkloning og gir stor fleksibilitet i transfektering av unike guide RNA-kombinasjoner til celler i et 24-brønns format. Fremstilling av råcellelysater for PCR genotype screening unngår også dyre og tidkrevende DNA-rensemetoder, samtidig som det muliggjør strømlinjeformet enkeltkolonicellelinjegenerering og fenotypisk analyse. Faktisk har denne CRISPR-genredigeringsprotokollen med høy gjennomstrømning blitt brukt med hell til å transfektere dyrkede prostatakreftcellelinjer (LNCaP, PC3-ML) med 32 unike guide RNA-kombinasjoner i et enkelt eksperiment og generere knockout-linjer som bærer slettinger for hele ~ 35 kb miR-888-klyngeområdet; mindre slettingskombinasjoner for miR-888-klyngemedlemmer som tilhører familiene miR-743 og miR-891a; samt slettinger for individuelle miRNA-medlemmer i miR-888-klyngen. Studier som disse vil gi en klarere undervurdering av hvordan grupperte miRNA fungerer sammen for å regulere tumorvekst, aggressivitet og stoffresistens før de oversetter miRNA til klinikken som terapeutiske og diagnostiske verktøy.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.2 mL PCR tubes, flat cap</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>14-230-225</td>
			<td>Plasticware</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL Microcentrifuge Tubes</td>
			<td>Seal-Rite</td>
			<td>1615-5500</td>
			<td>Plasticware</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well tissue culture plate</td>
			<td>Corning Costar</td>
			<td>&#160;09761146</td>
			<td>Plasticware</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5x Phusion HF Buffer</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>F-518L</td>
			<td>PCR reagent, genotyping</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well tissue culture plate</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>FB012927</td>
			<td>Plasticware</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well tissue culture plate</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>08-772-2C</td>
			<td>Plasticware</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-CRISPR-Cas9 antibody [7A9-3A3], Mouse monoclonal</td>
			<td>AbCam</td>
			<td>ab191468</td>
			<td>Western blot reagent; 160 kDa; dilution 1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic-Antimycotic (100x)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15240062</td>
			<td>Tisuue culture reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BLAST nucleotide search engine</td>
			<td>National Center for Biotechnology Information</td>
			<td>NA</td>
			<td>Freeware; website: blast.ncbi.nlm.nih.gov</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blasticidin S, Hydrochloride, Streptomyces griseochromogenes</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td>CAS 589205</td>
			<td>CRISPR reagent; Chemical, Working stock = 1 mg/mL in water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Countess 3 Automated Cell Counter</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A50298</td>
			<td>Equipment; Cell counter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryogenic tubes</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>50001012</td>
			<td>Plasticware</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dharmacon CRISPR Design Tool</td>
			<td>Horizon Discovery Ltd.</td>
			<td>NA</td>
			<td>Freeware; website: horizondiscovery.com/en/ordering-and-calculation-tools/crispr-dna-region-designer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DharmaFECT siRNA Transfection Reagent #2</td>
			<td>Dharmacon, Inc.</td>
			<td>T-2002-02</td>
			<td>Transfection reagent; LNCaP and PC3-ML cell lines</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>&#160;BP231100</td>
			<td>Tisuue culture reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM Medium with L-Glutamine, 4.5g/L Glucose and Sodium Pyruvate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>MT10013CV</td>
			<td>Tisuue culture reagent; Media for PC3-ML cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Doxycycline Hydrochloride, Ready Made Solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D3072-1ML</td>
			<td>CRISPR reagent; Chemical, Working stock = 1 mg/mL stock in water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS, no calcium, no magnesium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190144</td>
			<td>Tisuue culture reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Edit-R CRISPR-Cas9 Synthetic tracrRNA, 20 nmol, designed</td>
			<td>Dharmacon, Inc.</td>
			<td>U-002005-20</td>
			<td>CRISPR reagent; Universal tracrRNA oligonucleotides</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Edit-R Modified Synthetic crRNA, 
			desalted/deprotected, 2 nmol</td>
			<td>Dharmacon, Inc.</td>
			<td>crRNA-460XXX</td>
			<td>CRISPR reagent; Designed crRNA oligonucleotides</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EditR Inducible Lentiviral hEF1aBlastCas9 Nuclease Particles, 50 &#956;L, 107 TU/mL</td>
			<td>Dharmacon, Inc.</td>
			<td>VCAS11227</td>
			<td>CRISPR reagent; Lenti-iCas9; Doxycycline-inducible lentiviral Streptococcus pyogenes Cas9 vector system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ensembl genomic viewer</td>
			<td>Ensembl</td>
			<td>NA</td>
			<td>Freeware; website: [ensembl.org] Use: Genome browser to identify a nucleotide seuqnces containing the miRNA cluster and surrounding gene/regulatory sequences.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GAPDH Antibody (FL-335), rabbit polyclonal</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc25778</td>
			<td>Western blot reagent; 37 kDa; dilution 1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel/PCR DNA Fragment Extraction Kit</td>
			<td>IBI Scientific</td>
			<td>IB47010</td>
			<td>Nucleic acid gel electrophoresis reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco Fetal Bovine Serum, certified</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>16000044</td>
			<td>Tisuue culture reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hexadimethrine bromide</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>H9268</td>
			<td>CRISPR reagent; Chemical, Working stock = 0.8 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immobilon-FL PVDF Membrane</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>IPFL10100</td>
			<td>Western blot reagent; nitrocellulose</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Intercept (TBS) Blocking Buffer</td>
			<td>LI-COR</td>
			<td>927-60001</td>
			<td>Western blot reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IRDye 680RD Goat anti-Mouse IgG Secondary Antibody</td>
			<td>LI-COR</td>
			<td>926-68070</td>
			<td>Western blot reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IRDye 800CW Goat anti-Rabbit IgG Secondary Antibody</td>
			<td>LI-COR</td>
			<td>926-32211</td>
			<td>Western blot reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>&#160;5425 R</td>
			<td>Plasticware</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>miRBase microRNA viewer</td>
			<td>miRBase</td>
			<td>NA</td>
			<td>Freeware; website: [mirbase.org] Use: Borowser lists all annotated miRNA hairpins, mature miRNA sequences and associated clustered miRNAs mapping within 10 kb.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NuPAGE 4 to 12%, Bis-Tris, 1.0 mm, Mini Protein Gel, 10-well</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>NP0321BOX</td>
			<td>Western blot reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Odyssey CLx Imaging System</td>
			<td>LI-COR</td>
			<td>CLx</td>
			<td>Equipment; Western blot imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM Reduced Serum Medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>31985062</td>
			<td>Transfection reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Owl D2 Wide-Gel Electrophoresis System</td>
			<td>Owl</td>
			<td>D2-BP</td>
			<td>Equipment; Nucleic acid gel electrophoresis system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR Primers, designed (single-stranded DNA oligonucleotides)</td>
			<td>Integrated DNA Technology</td>
			<td>NA</td>
			<td>PCR reagent, genotyping</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phusion High-Fidelity DNA Polymerase (2 U/&#181;L)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>F530S</td>
			<td>PCR reagent, genotyping</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RIPA Lysis Buffer 10x</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>20-188</td>
			<td>Western blot reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K Solution (20 mg/mL), RNA grade</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>25530049</td>
			<td>PCR reagent, genotyping</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase A, DNase and protease-free (10 mg/mL)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>EN0531</td>
			<td>PCR reagent, genotyping</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640 Medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>MT10041CV</td>
			<td>Tisuue culture reagent; Media for LNCaP cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SnapGene Viewer</td>
			<td>Snap Gene</td>
			<td>NA</td>
			<td>Freeware; website: [snapgene.com]&#160;Use: DNA sequence annotation software program to create a DNA file for gRNA design and which&#160; highlights the miRNA cluster locus (intergenic, intronic), each individual miRNA hairpin sequence belonging to the miRNA cluster, and other nearby coding and non-coding genes and/or regulatory features</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE Select Enzyme (1x), no phenol red</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12563029</td>
			<td>Tisuue culture reagent; Recombinant trypsin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure Agarose</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>16500100</td>
			<td>Nucleic acid gel electrophoresis reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Veriti 96-Well Fast Thermal Cycler</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>4375305</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XCell SureLock Mini-Cell Electrophoresis System</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>EI0001</td>
			<td>Equipment; Protein gel electrophoresis system</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

crispr gene editing tool for microrna cluster network analysis

MikroRNA (miRNA) har dukket opp som viktige cellulære regulatorer (tumor suppressorer, pro-onkogene faktorer) av kreft og metastase. De fleste publiserte studier fokuserer på et enkelt miRNA når man karakteriserer rollen som små RNA i kreft. Imidlertid er ~ 30% av humane miRNA-gener organisert i grupperte enheter som ofte uttrykkes samtidig, noe som indikerer et komplekst og koordinert system for ikke-kodende RNA-regulering. En klarere understating av hvordan grupperte miRNA-nettverk fungerer sammen for å regulere tumorvekst, kreft aggressivitet og stoffresistens er nødvendig før man oversetter ikke-kodende små RNA-er til klinikken.
Bruken av en høy gjennomstrømningsklynget regelmessig interspaced korte palindromiske repetisjoner (CRISPR) -mediert genredigeringsprosedyre har blitt ansatt for å studere den onkogene rollen til en genomisk klynge av syv miRNA-gener som ligger i et lokus som spenner over ~ 35.000 bp i lengde i sammenheng med prostatakreft. For denne tilnærmingen ble humane kreftcellelinjer infisert med en lentivirusvektor for doxycyklin (DOX) -induserbar Cas9-nuklease dyrket i DOX-inneholdende medium i 48 timer. Cellene ble deretter samtransfisert med syntetiske transaktiverende CRISPR RNA (tracrRNA) kompleks med genomisk stedsspesifikk CRISPR RNA (crRNA) oligonukleotider for å tillate rask generering av kreftcellelinjer som bærer hele miRNA-klyngeslettingen og individuelle eller kombinasjon miRNA-genklyngeslettinger i et enkelt eksperiment.
Fordelene med dette høykapasitets genredigeringssystemet er evnen til å unngå tidkrevende DNA-vektorunderkloning, fleksibiliteten i transfekterende celler med unike guide-RNA-kombinasjoner i et 24-brønns format, og den billigere PCR-genotypingen ved bruk av råcellelysater. Studier som bruker denne strømlinjeformede tilnærmingen lover å avdekke funksjonelle redundanser og synergistiske / antagonistiske interaksjoner mellom miRNA-klyngemedlemmer, noe som vil hjelpe til med å karakterisere de komplekse små ikke-kodende RNA-nettverkene som er involvert i menneskelig sykdom og bedre informere fremtidig terapeutisk design.

Denne CRISPR-delesjonsprotokollen med høy gjennomstrømning ble vellykket brukt ved bruk av transfeksjon av Cas9-induserbare LNCaP og PC3-ML humane kreftcellelinjer med syntetisk oligonukleotidguide RNAer rettet mot miR-888-klyngen, som ble studert i sammenheng med prostatakreft. MiR-888-klyngen ble opprinnelig identifisert i en ekspresjonsprofileringsskjerm som forhøyet hos prostatakreftpasienter med høygradig sykdom sammenlignet med lavgradige og ikke-kreftpasienter 9,10<sup class=...

Watch this Scientific Journal Video about CRISPR Gene Editing Tool for MicroRNA Cluster Network Analysis at JoVE.com

CRISPR Gene Editing Tool for MicroRNA Cluster Network Analysis

Denne protokollen beskriver en høy gjennomstrømningsklynget regelmessig interspaced korte palindromiske repetisjoner (CRISPR) genredigeringsarbeidsflyt for mikroRNA-klyngenettverksanalyse som tillater rask generering av et panel av genetisk modifiserte cellelinjer som bærer unike miRNA-klyngemedlemsslettingskombinasjoner så store som 35 kb i et enkelt eksperiment.

CRISPR-genredigeringsverktøy for analyse av mikroRNA-klyngenettverk

MicroRNAs (miRNAs) have emerged as important cellular regulators (tumor suppressors, pro-oncogenic factors) of cancer and metastasis. Most published ...

Denne protokollen bruker en høy gjennomstrømning CRISPR genredigering arbeidsflyt for å molekylært dissekere mikro RNA gener organisert og gruppert enheter. Og for å bestemme hvordan disse ikke-kodende RNA-nettverkene koordinerer kreftprogresjonsveier. Denne CRISPR-genredigeringsprosedyren gjør at etterforskeren raskt kan generere et helt panel av cellelinjer som bærer unike mikro-RNA-klyngeslettingskombinasjoner, samtidig som man unngår tidkrevende DNA-vektor-subkloning.Denne metoden vil gi en klarere forståelse av hvordan grupperte mikro-RNA fungerer sammen for å regulere tumorvekst, aggressivitet og stoffresistens før mikro-RNA oversettes til klinikken som terapeutiske og diagnostiske verktøy. Demonstrere prosedyren vil være Grace Yi, en forskningsassistent i laboratoriet mitt. For å begynne med, opprett en DNA-fil som inneholder den komplette genomiske sekvensen av mikro-RNA-klyngeområdet av interesse i minst en kilobyte av omkringliggende genomiske regioner ved hjelp av et DNA-sekvensmerknadsprogram.Deretter designer du fire unike CRISPR-RNA-er for hvert målrettet mikro-RNA-lokus. To designet CRISPR RNA for å målrette gratis DNA-sekvenser umiddelbart fem prime av mikro RNA hårnålsklyngen og to designet CRISPR RNA for å målrette komplementære DNA-sekvenser umiddelbart tre prime av mikro RNA hårnålsklyngen. Bruk et funksjonsredigeringsverktøy i den opprettede DNA-filen for å markere DNA-målsekvensen for hvert designet CRISPR RNA som skal syntetiseres.Designet og syntetisert PCR-primere som flankerer de målrettede mikroRNA-klyngeregionene for genotyping av CRISPR-cellelinjer. Utfør en doksycyklinkonsentrasjonskurve på nylig genererte lenti-induserbare Cas9-cellelinjer for å bestemme de optimale forholdene for Cas9-proteininduksjon. Plate fem ganger 10 av de fjerde cellene per brønn av hver seks brønnplate og vokse ved 37 grader Celsius, 5% karbondioksid, i det foretrukne mediet i 24 timer.Fortynn dox i det foretrukne mediet med en endelig doxkonsentrasjonskurve fra 0 5100, 150, 250 til 500 nanogram per milli liter. Merk brønnene til hver sittende seks brønnplate fra en til seks. Fjern mediet og erstatt med passende doxkonsentrasjoner.Dyrk plater en til fire til 24 timer, 48 timer og 72 timer dox-induksjon og 120 timer etter dox-uttak. Høst platens brønner på hvert tidspunkt. Behandle cellepellets og ripa buffer for lysatisolasjon.Utfør western blot-analyse med 40 mikrogram protein for å måle Cas9-proteininduksjon og bestemme optimal Cas9-konsentrasjon. På papiret kartlegger du de fem primære og tre prime CRISPR RNA-parkombinasjonene som vil bli transektert til hver brønn i en 24-brønnplate rettet mot hele mikro-RNA-klyngen, forskjellige klyngede mikroRNA-genkombinasjoner, samt individuelle mikro-RNA-klyngemedlemmer. Plate lenti induserbar støpt ni cellelinje ved fem ganger 10 til fjerde celler per brønn av en 24 brønnplate i det foretrukne mediet som inneholder den optimaliserte doxkonsentrasjonen.Dyrk cellene i 24 til 48 timer ved 37 grader Celsius, 5% karbondioksid for å indusere Cas9 proteinuttrykk. Transfekter lenti-induserbare Cas9-celler med en forberedt fem prime og tre prime guide RNA. Merk fire 1,5 milliliter mikrosentrifugerør per målrettet mikro-RNA-lokus.I hvert rør blander du ett til ett molforhold mellom tracer RNA og unike CRISPR RNA sammen for å danne de to mikromolære guide RNA-kompleksene. Legg til 2,5 mikroliter tracer RNA, 1,25 mikroliter av de fem prime posisjonerte CRISPR RNA, 1,25 mikroliter av de tre prime posisjonerte CRISPR RNA, og fem mikroliter 10 millimolar tris hcl pH 7,5 buffer til en 1,5 milliliter sentrifuge tube. Mikrosentrifuge i 30 sekunder ved 16.000 ganger G for å blande.Inkuber ved romtemperatur i fem minutter. Til hvert rør ved 40 mikroliter redusert serummedium til 10 mikroliter guide RNA-kompleksreaksjon. Bland forsiktig ved pipettering opp og ned.I et rent 1,5 milliliter sentrifugerør blandes to mikroliter av transfeksjonsreagenset og 48 mikroliter redusert serummedium forsiktig ved pipettering opp og ned. Inkuber ved romtemperatur i fem minutter. Til hvert rør som inneholder 50 mikroliter guide RNA-blanding, tilsett 50 mikroliter av det fortynnede transfeksjonsreagenset.Pipette blandingen sakte opp og ned en gang for å blande. Inkuber ved romtemperatur i 20 minutter. Tilsett 400 mikroliter antibiotikafritt medium supplert med doksycyklin til hvert rør som inneholder 100 mikroliter av guide RNA-transfeksjonsblandingen.Pipette forsiktig å blande. Fjern mediet fra doksycyklininduserte lenti-induserbare Cas9-celler. Legg til 500 mikroliter media doxycyklin guide RNA transformasjonsblanding basert på 24 brønnplate eksperimentelle kart.Inkuber de transfiserte cellene i 48 timer ved 37 grader Celsius i 5% karbondioksid. Bytt mediet med det friske tilberedte mediet uten doxycyklin. La cellene komme seg i ytterligere 24 til 48 timer ved 37 grader Celsius og 5% karbondioksid.Høst de transfiserte cellene og forbered deg på genotyping og enkeltcelle vrangforestillinger. Skill de 150 mikroliterne av resuspenderte celler i tre deler. Frys ned en tredjedel av de transfiserte cellene i medium pluss 10 % DMSO i kryohetteglass for langtidslagring.Overfør en tredjedel av transfiserte celler til et rent 0,2 milliliter PCR-rør for genotyping. Forbered den siste tredjedelen av transfiserte celler for telling og fortynning i et 96-brønnsplateformat for å generere enkeltcellekolonier. Ved hjelp av en 12-kanals multipipetter og et sterilt reagensreservoar, tilsett 100 mikroliter fortynnede celler per brønn til to rader av platen for hver fortynning.Tillat fire til seks uker for cellene å vokse til kofluens for encellet koloniutvidelse. Samle omtrent 10 til 15 enkeltcellekolonier for genotyping. Identifiser minst tre uavhengige knockout enkeltcellekolonilinjer for hvert målrettet mikro-RNA-lokus.Behold jokertypen enkeltcellelinjer som kontroller. Resuspend vært cellepelleten i fire mikroliter av fem X DNA-polymerasebuffer, en mikroliter proteinase K, en mikroliter RNase A og nukleasefritt vann opp til et totalt volum på 20 mikroliter. Lus cellene i termosyklusen ved 56 grader Celsius i 30 minutter og 96 grader Celsius i fem minutter.Oppbevar cellelysatene ved minus 20 grader Celsius til de er klare for PCR-genotyping. Utfør en PCR-genotypingsreaksjon ved hjelp av de designede PCR-primerne som flankerer guide RNA fem prime og tre prime guide RNA-målrettede steder. Kjør PCR-reaksjonen i en termosykler ved hjelp av programmet nevnt i tekstmanuskriptet.Legg PCR-produktene på en 1% agarosegel for elektroforeseanalyse. Trekk ut DNA fra de isolerte PCR-fragmentene av den forutsagte molekylstørrelsen for knockout-genotypene. Forbered prøvene for DNA-sekvensering.Valider at CRISPR-reaksjonen var vellykket og utfør DNA-sekvensering av de isolerte PCR-fragmentene for å identifisere Cas9-spaltningsstedet og bekrefte mikro-RNA-lokus-delesjon. Unike CRISPR RNA ble designet som målrettet mot hele 35 kilo baser miR-888 cluster region. Mindre klyngekombinasjoner innenfor miR-743-familien eller miR-891-familien samt mikro-RNA-delesjoner.Gelelektroforeseanalyse av PCR-reaksjonene indikerte at den predikerte DNA-fragmentstørrelsen som representerte knockout-genotypen ble forsterket for hver CRISPR-transfeksjon. Enkeltcellekolonier ble genotypet ved PCR i sekvens verifisert. DNA-sekvensering av disse isolerte knockout PCR-fragmentene bekreftet at de transfiserte fem prime og tre prime guide RNAene rettet Cas9 spaltningsligering omtrent tre nukleotid oppstrøms PAM-stedene og validerte genomisk tap av det målrettede mikro-RNA-lokuset.WST-1 spredningsanalyser som sammenligner miR-891a knockout og villtypeceller bekrefter at overekspresjon av mikro-RNA-etterligning lentiviral vektor induserer prostatacellevekst, og derfor ble det spådd at miR-891 et tap ville vise gjensidige effekter. I tillegg til nøye guide RNA-design er det viktig å raskt generere enkeltcellekolonier gjennom hver mikro-RNA-knockoutlinje. Det er spesielt relevant hvis mikro-RNA-knockoutcellene har redusert vekst av levedyktighet og lett vil bli utkonkurrert i blandede populasjoner med villtypeceller.Ytterligere metoder som kvantitativ sanntids PCR, nordlig flekk og RNA-sekvensering bør utføres for å bekrefte at CRISPR-knockoutcellelinjene ikke uttrykker modent mikroRNA for det slettede lokuset.

Research

JoVE Journal

Biology

Microarray Analysis for Saccharomyces cerevisiae

Microarray Analysis for Saccharomyces cerevisiae

In this protocol, gene expression in yeast (Saccharomyces cerevisiae) is changed after exposure to oxidative stress induced by the addition of hydrogen ...

Using SecM Arrest Sequence as a Tool to Isolate Ribosome Bound Polypeptides

Bruke SecM Arrest sekvens som et verktøy for å isolere ribosom Innbundne polypeptider

Extensive research has provided ample evidences suggesting that protein folding in the cell is a co-translational process1-5. However, the exact pathway ...

Analysis of Autophagy in Penicillium chrysogenum by Using Starvation Pads in Combination With Fluorescence Microscopy

Analysis of Autophagy in Penicillium chrysogenum by Using Starvation Pads in Combination With Fluorescence Microscopy

Analyse av Autophagy i<em&gt; Penicillium chrysogenum</em&gt; Ved hjelp av Sult Pads i kombinasjon med Fluorescensmikroskopi

The study of cellular quality control systems has emerged as a highly dynamic and relevant field of contemporary research. It has become clear that cells ...

Silencing the Spark: CRISPR/Cas9 Genome Editing in Weakly Electric Fish

Deaktivere spark: CRISPR/Cas9 Genova redigere i svakt Electric Fish

Electroreception and electrogenesis have changed in the evolutionary history of vertebrates. There is a striking degree of convergence in these ...

Pupal and Adult Injections for RNAi and CRISPR Gene Editing in Nasonia vitripennis

Pupal and Adult Injections for RNAi and CRISPR Gene Editing in Nasonia vitripennis

Pupal og voksen injeksjoner for RNAi og CRISPR Genredigering i Nasonia vitripennis

The jewel wasp, Nasonia vitripennis, has become an efficient model system to study epigenetics of haplo-diploid sex determination, B-chromosome biology, ...

TGF-&#946;-mediated Endothelial to Mesenchymal Transition (EndMT) and the Functional Assessment of EndMT Effectors using CRISPR/Cas9 Gene Editing

TGF-ÃƒÅ½Ã‚Â²-mediated Endothelial to Mesenchymal Transition EndMT and the Functional Assessment of EndMT Effectors using CRISPR/Cas9 Gene Editing

TGF-β mediert endotelial til mesenchymal overgang (EndMT) og den funksjonelle vurderingen av EndMT-effektorer ved hjelp av CRISPR/Cas9 Genredigering

In response to specific external cues and the activation of certain transcription factors, endothelial cells can differentiate into a mesenchymal-like ...

In Vitro Analysis of E3 Ubiquitin Ligase Function

In Vitro Analysis of E3 Ubiquitin Ligase Function

Introduksjon Analyse av E3 Ubiquitin Ligase-funksjonen

The covalent attachment of ubiquitin (Ub) to internal lysine residue(s) of a substrate protein, a process termed ubiquitylation, represents one of the ...

CRISPR/Cas9 Gene Editing of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells for Gene Therapy Applications

CRISPR/Cas9 Genredigering av hematopoietiske stamceller og stamceller for genterapiapplikasjoner

CRISPR/Cas9 is a highly versatile and efficient gene-editing tool adopted widely to correct various genetic mutations. The feasibility of gene ...

Embryo Injection Technique for Gene Editing in the Black-Legged Tick, Ixodes scapularis

Embryo Injection Technique for Gene Editing in the Black-Legged Tick, Ixodes scapularis

Embryoinjeksjonsteknikk for genredigering i svartbenet flått, Ixodes scapularis

Ticks can transmit various viral, bacterial, and protozoan pathogens and are therefore considered vectors of medical and veterinary importance. Despite ...

Protocols for CRISPR/Cas9 Mutagenesis of the Oriental Fruit Fly Bactrocera dorsalis

Protocols for CRISPR/Cas9 Mutagenesis of the Oriental Fruit Fly Bactrocera dorsalis

Protokoller for CRISPR/Cas9 Mutagenese av orientalsk fruktflue Bactrocera dorsalis

The Oriental fruit fly, Bactrocera dorsalis, is a highly invasive and adaptive pest species that causes damage to citrus and over 150 other fruit crops ...