Name: crispr gene editing tool for microrna cluster network analysis
Uploaded: 2022-04-25T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about CRISPR Gene Editing Tool for MicroRNA Cluster Network Analysis at JoVE.com

Клеточные линии PC3-ML были любезно предоставлены Марком Стерном (Медицинский колледж Университета Дрекселя). Джастин Токси помогал в генотипировании ПЦР. Эта работа была поддержана грантом Фонда Бридана Адамса, Фондом трансляционных исследований Райана и грантом Совета по исследованиям в области здравоохранения Содружества (CHRB-274-11-20) для AE-K.

1. Подготовка к редактированию генов CRISPR и руководство проектированием РНК для генерации нокаутирующих клеточных линий кластера миРНК
<ol><li>Создайте файл ДНК, содержащий полную геномную последовательность интересующей кластерной области миРНК (интергенной, интронной) и, по м...

<ol>
	<li>Hasegawa, T., Lewis, H., Esquela-Kerscher, A., Laurence, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Translating MicroRNAs to the Clinic. , 329-369 (2017).</li><li>Lewis, H., Esquela-Kerscher, A., Thiagalingam, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Systems Biology of Cancer. , 134-153 (2015).</li><li>Esquela-Kerscher, A., Slack, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oncomirs+-+microRNAs+with+a+role+in+cancer.">Oncomirs - microRNAs with a role in cancer.</a> Nature Reviews Cancer. 6 (4), 259-269 (2006).</li><li>Breving, K., Esquela-Kerscher, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+complexities+of+microRNA+regulation:+mirandering+around+the+rules.">The complexities of microRNA regulation: mirandering around the rules.</a> The International Journal of Biochemistry &amp; Cell Biology. 42 (8), 1316-1329 (2010).</li><li>Griffiths-Jones, S., Saini, H. K., van Dongen, S., Enright, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=miRBase:+tools+for+microRNA+genomics.">miRBase: tools for microRNA genomics.</a> Nucleic Acids Research. 36, 154-158 (2008).</li><li>Kabekkodu, S. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clustered+miRNAs+and+their+role+in+biological+functions+and+diseases.">Clustered miRNAs and their role in biological functions and diseases.</a> Biological Reviews. 93 (4), 1955-1986 (2018).</li><li>Xiang, J., Wu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Feud+or+friend?+The+role+of+the+miR-17-92+cluster+in+tumorigenesis.">Feud or friend? The role of the miR-17-92 cluster in tumorigenesis.</a> Current Genomics. 11 (2), 129-135 (2010).</li><li>Aqeilan, R. I., Calin, G. A., Croce, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=miR-15a+and+miR-16-1+in+cancer:+discovery,+function+and+future+perspectives.">miR-15a and miR-16-1 in cancer: discovery, function and future perspectives.</a> Cell Death &amp; Differentiation. 17 (2), 215-220 (2010).</li><li>Hasegawa, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+and+evidence+of+the+miR-888+cluster+as+a+novel+cancer+network+in+prostate.">Characterization and evidence of the miR-888 cluster as a novel cancer network in prostate.</a> Molecular Cancer Research. , (2018).</li><li>Lewis, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=miR-888+is+an+expressed+prostatic+secretions-derived+microRNA+that+promotes+prostate+cell+growth+and+migration.">miR-888 is an expressed prostatic secretions-derived microRNA that promotes prostate cell growth and migration.</a> Cell Cycle. 13 (2), 227-239 (2014).</li><li>Xu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+a+prostate+cancer+susceptibility+locus+on+the+X+chromosome.">Evidence for a prostate cancer susceptibility locus on the X chromosome.</a> Nature Genetics. 20 (2), 175-179 (1998).</li><li>Schleutker, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genetic+epidemiological+study+of+hereditary+prostate+cancer+(HPC)+in+Finland:+frequent+HPCX+linkage+in+families+with+late-onset+disease.">A genetic epidemiological study of hereditary prostate cancer (HPC) in Finland: frequent HPCX linkage in families with late-onset disease.</a> Clinical Cancer Research. 6 (12), 4810-4815 (2000).</li><li>Farnham, J. M., Camp, N. J., Swensen, J., Tavtigian, S. V., Albright, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Confirmation+of+the+HPCX+prostate+cancer+predisposition+locus+in+large+Utah+prostate+cancer+pedigrees.">Confirmation of the HPCX prostate cancer predisposition locus in large Utah prostate cancer pedigrees.</a> Human Genetics. 116 (3), 179-185 (2005).</li><li>Brown, W. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hereditary+prostate+cancer+in+African+American+families:+linkage+analysis+using+markers+that+map+to+five+candidate+susceptibility+loci.">Hereditary prostate cancer in African American families: linkage analysis using markers that map to five candidate susceptibility loci.</a> British Journal Of Cancer. 90 (2), 510-514 (2004).</li><li>Bochum, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Confirmation+of+the+prostate+cancer+susceptibility+locus+HPCX+in+a+set+of+104+German+prostate+cancer+families.">Confirmation of the prostate cancer susceptibility locus HPCX in a set of 104 German prostate cancer families.</a> Prostate. 52 (1), 12-19 (2002).</li><li>Doudna, J. A., Charpentier, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+editing.+The+new+frontier+of+genome+engineering+with+CRISPR-Cas9.">Genome editing. The new frontier of genome engineering with CRISPR-Cas9.</a> Science. 346 (6213), 1258096 (2014).</li><li>Adli, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+CRISPR+tool+kit+for+genome+editing+and+beyond.">The CRISPR tool kit for genome editing and beyond.</a> Nature Communications. 9 (1), (2018).</li><li>Jinek, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+programmable+dual-RNA+guided+DNA+endonuclease+in+adaptive+bacterial+immunity.">A programmable dual-RNA guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity.</a> Science. 337 (6096), 816-821 (2012).</li><li>. SnapGene&#174; software (from Insightful Science; available at snapgene.com) Available from: <a target="_blank" href="https://www.snapgene.com">https://www.snapgene.com</a> (2022)</li><li>. Ensembl Release 104 genome browser (from EMBL-EBI) Available from: <a target="_blank" href="https://www.ensembl.org">https://www.ensembl.org</a> (2022)</li><li>Howe, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ensembl+2021.">Ensembl 2021.</a> Nucleic Acids Research. 49, 884-891 (2021).</li><li>. miRBase: the microRNA database, Release 22.1 (from Griffiths-Jones laboratory) Available from: <a target="_blank" href="https://www.mirbase.org">https://www.mirbase.org</a> (2022)</li><li>. Dharmacon CRISPR Design Tool (from Dharmacon) Available from: <a target="_blank" href="https://www.horizondiscovery.com/en/ordering-and-calculation-tools/crispr-dna-region-designer">https://www.horizondiscovery.com/en/ordering-and-calculation-tools/crispr-dna-region-designer</a> (2022)</li><li>. Off-Spotter (Venetia Pliatsika &amp; Isidore Rigoutsos of the Jefferson Computational Medicine Center) Available from: <a target="_blank" href="https://cm.jefferson.edu/Off-Spotter/">https://cm.jefferson.edu/Off-Spotter/</a> (2022)</li><li>Bao, X. R., Pan, Y., Lee, C. M., Davis, T. H., Bao, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tools+for+experimental+and+computational+analyses+of+off-target+editing+by+programmable+nucleases.">Tools for experimental and computational analyses of off-target editing by programmable nucleases.</a> Nature Protocols. 16 (1), 10-26 (2021).</li><li>. Dharmacon DharmaFECT Transfection Reagent Cell Type Guide. Choose Dharmacon DharmaFECT 1, 2, 3, or 4 for optimal transfection of siRNA or miRNA reagents Available from: <a target="_blank" href="https://horizondiscovery.com/-/media-Files/Horizon/resources/Selection-guides/dharmafect-cell-type-guidelines.pdf">https://horizondiscovery.com/-/media-Files/Horizon/resources/Selection-guides/dharmafect-cell-type-guidelines.pdf</a> (2022)</li><li>Baffoe-Bonnie, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+major+locus+for+hereditary+prostate+cancer+in+Finland:+localization+by+linkage+disequilibrium+of+a+haplotype+in+the+HPCX+region.">A major locus for hereditary prostate cancer in Finland: localization by linkage disequilibrium of a haplotype in the HPCX region.</a> Human Genetics. 117 (4), 307-316 (2005).</li><li>Zhang, R., Peng, Y., Wang, W., Su, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+evolution+of+an+X-linked+microRNA+cluster+in+primates.">Rapid evolution of an X-linked microRNA cluster in primates.</a> Genome Research. 17 (5), 612-617 (2007).</li><li>Ohnuki, Y., Marnell, M. M., Babcock, M. S., Lechner, J. F., Kaighn, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromosomal+analysis+of+human+prostatic+adenocarcinoma+cell+lines.">Chromosomal analysis of human prostatic adenocarcinoma cell lines.</a> Cancer Research. 40 (3), 524-534 (1980).</li><li>Beheshti, B., Karaskova, J., Park, P. C., Squire, J. A., Beatty, B. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+high+frequency+of+chromosomal+rearrangements+in+the+centromeric+regions+of+prostate+cancer+cell+lines+by+sequential+giemsa+banding+and+spectral+karyotyping.">Identification of a high frequency of chromosomal rearrangements in the centromeric regions of prostate cancer cell lines by sequential giemsa banding and spectral karyotyping.</a> Molecular Diagnosis. 5 (1), 23-32 (2000).</li></ol>

Эта процедура редактирования генов CRISPR позволяет исследователю быстро генерировать целую панель клеточных линий, несущих уникальные комбинации делеции кластеров миРНК. Трансфекция синтетических направляющих РНК, состоящих из 5' и 3' геномных сайт-специфических цРНК, отожженных синте?...

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.2 mL PCR tubes, flat cap</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>14-230-225</td>
			<td>Plasticware</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL Microcentrifuge Tubes</td>
			<td>Seal-Rite</td>
			<td>1615-5500</td>
			<td>Plasticware</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well tissue culture plate</td>
			<td>Corning Costar</td>
			<td>&#160;09761146</td>
			<td>Plasticware</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5x Phusion HF Buffer</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>F-518L</td>
			<td>PCR reagent, genotyping</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well tissue culture plate</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>FB012927</td>
			<td>Plasticware</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well tissue culture plate</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>08-772-2C</td>
			<td>Plasticware</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-CRISPR-Cas9 antibody [7A9-3A3], Mouse monoclonal</td>
			<td>AbCam</td>
			<td>ab191468</td>
			<td>Western blot reagent; 160 kDa; dilution 1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic-Antimycotic (100x)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15240062</td>
			<td>Tisuue culture reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BLAST nucleotide search engine</td>
			<td>National Center for Biotechnology Information</td>
			<td>NA</td>
			<td>Freeware; website: blast.ncbi.nlm.nih.gov</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blasticidin S, Hydrochloride, Streptomyces griseochromogenes</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td>CAS 589205</td>
			<td>CRISPR reagent; Chemical, Working stock = 1 mg/mL in water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Countess 3 Automated Cell Counter</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A50298</td>
			<td>Equipment; Cell counter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryogenic tubes</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>50001012</td>
			<td>Plasticware</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dharmacon CRISPR Design Tool</td>
			<td>Horizon Discovery Ltd.</td>
			<td>NA</td>
			<td>Freeware; website: horizondiscovery.com/en/ordering-and-calculation-tools/crispr-dna-region-designer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DharmaFECT siRNA Transfection Reagent #2</td>
			<td>Dharmacon, Inc.</td>
			<td>T-2002-02</td>
			<td>Transfection reagent; LNCaP and PC3-ML cell lines</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>&#160;BP231100</td>
			<td>Tisuue culture reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM Medium with L-Glutamine, 4.5g/L Glucose and Sodium Pyruvate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>MT10013CV</td>
			<td>Tisuue culture reagent; Media for PC3-ML cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Doxycycline Hydrochloride, Ready Made Solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D3072-1ML</td>
			<td>CRISPR reagent; Chemical, Working stock = 1 mg/mL stock in water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS, no calcium, no magnesium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190144</td>
			<td>Tisuue culture reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Edit-R CRISPR-Cas9 Synthetic tracrRNA, 20 nmol, designed</td>
			<td>Dharmacon, Inc.</td>
			<td>U-002005-20</td>
			<td>CRISPR reagent; Universal tracrRNA oligonucleotides</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Edit-R Modified Synthetic crRNA, 
			desalted/deprotected, 2 nmol</td>
			<td>Dharmacon, Inc.</td>
			<td>crRNA-460XXX</td>
			<td>CRISPR reagent; Designed crRNA oligonucleotides</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EditR Inducible Lentiviral hEF1aBlastCas9 Nuclease Particles, 50 &#956;L, 107 TU/mL</td>
			<td>Dharmacon, Inc.</td>
			<td>VCAS11227</td>
			<td>CRISPR reagent; Lenti-iCas9; Doxycycline-inducible lentiviral Streptococcus pyogenes Cas9 vector system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ensembl genomic viewer</td>
			<td>Ensembl</td>
			<td>NA</td>
			<td>Freeware; website: [ensembl.org] Use: Genome browser to identify a nucleotide seuqnces containing the miRNA cluster and surrounding gene/regulatory sequences.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GAPDH Antibody (FL-335), rabbit polyclonal</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc25778</td>
			<td>Western blot reagent; 37 kDa; dilution 1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel/PCR DNA Fragment Extraction Kit</td>
			<td>IBI Scientific</td>
			<td>IB47010</td>
			<td>Nucleic acid gel electrophoresis reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco Fetal Bovine Serum, certified</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>16000044</td>
			<td>Tisuue culture reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hexadimethrine bromide</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>H9268</td>
			<td>CRISPR reagent; Chemical, Working stock = 0.8 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immobilon-FL PVDF Membrane</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>IPFL10100</td>
			<td>Western blot reagent; nitrocellulose</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Intercept (TBS) Blocking Buffer</td>
			<td>LI-COR</td>
			<td>927-60001</td>
			<td>Western blot reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IRDye 680RD Goat anti-Mouse IgG Secondary Antibody</td>
			<td>LI-COR</td>
			<td>926-68070</td>
			<td>Western blot reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IRDye 800CW Goat anti-Rabbit IgG Secondary Antibody</td>
			<td>LI-COR</td>
			<td>926-32211</td>
			<td>Western blot reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>&#160;5425 R</td>
			<td>Plasticware</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>miRBase microRNA viewer</td>
			<td>miRBase</td>
			<td>NA</td>
			<td>Freeware; website: [mirbase.org] Use: Borowser lists all annotated miRNA hairpins, mature miRNA sequences and associated clustered miRNAs mapping within 10 kb.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NuPAGE 4 to 12%, Bis-Tris, 1.0 mm, Mini Protein Gel, 10-well</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>NP0321BOX</td>
			<td>Western blot reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Odyssey CLx Imaging System</td>
			<td>LI-COR</td>
			<td>CLx</td>
			<td>Equipment; Western blot imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM Reduced Serum Medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>31985062</td>
			<td>Transfection reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Owl D2 Wide-Gel Electrophoresis System</td>
			<td>Owl</td>
			<td>D2-BP</td>
			<td>Equipment; Nucleic acid gel electrophoresis system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR Primers, designed (single-stranded DNA oligonucleotides)</td>
			<td>Integrated DNA Technology</td>
			<td>NA</td>
			<td>PCR reagent, genotyping</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phusion High-Fidelity DNA Polymerase (2 U/&#181;L)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>F530S</td>
			<td>PCR reagent, genotyping</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RIPA Lysis Buffer 10x</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>20-188</td>
			<td>Western blot reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K Solution (20 mg/mL), RNA grade</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>25530049</td>
			<td>PCR reagent, genotyping</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase A, DNase and protease-free (10 mg/mL)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>EN0531</td>
			<td>PCR reagent, genotyping</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640 Medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>MT10041CV</td>
			<td>Tisuue culture reagent; Media for LNCaP cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SnapGene Viewer</td>
			<td>Snap Gene</td>
			<td>NA</td>
			<td>Freeware; website: [snapgene.com]&#160;Use: DNA sequence annotation software program to create a DNA file for gRNA design and which&#160; highlights the miRNA cluster locus (intergenic, intronic), each individual miRNA hairpin sequence belonging to the miRNA cluster, and other nearby coding and non-coding genes and/or regulatory features</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE Select Enzyme (1x), no phenol red</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12563029</td>
			<td>Tisuue culture reagent; Recombinant trypsin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure Agarose</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>16500100</td>
			<td>Nucleic acid gel electrophoresis reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Veriti 96-Well Fast Thermal Cycler</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>4375305</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XCell SureLock Mini-Cell Electrophoresis System</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>EI0001</td>
			<td>Equipment; Protein gel electrophoresis system</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

crispr gene editing tool for microrna cluster network analysis

МикроРНК (миРНК) стали важными клеточными регуляторами (супрессоры опухолей, проонкогенные факторы) рака и метастазирования. Большинство опубликованных исследований сосредоточены на одной миРНК при характеристике роли малых РНК в раке. Тем не менее, ~ 30% генов миРНК человека организованы в кластеризованные единицы, которые часто совместно экспрессируются, что указывает на сложную и скоординированную систему некодирующей регуляции РНК. Необходимо более четкое представление о том, как кластерные сети миРНК функционируют совместно для регулирования роста опухоли, агрессивности рака и лекарственной устойчивости, прежде чем переводить некодирующие малые РНК в клинику.
Использование высокопроизводительной кластеризованной регулярно интерраспространяемой процедуры редактирования генов, опосредованной короткими палиндромными повторами (CRISPR), было использовано для изучения онкогенной роли геномного кластера из семи генов миРНК, расположенного в локусе длиной ~ 35 000 bp в контексте рака предстательной железы. Для этого подхода линии раковых клеток человека были инфицированы лентивирусным вектором для доксициклина (DOX)-индуцируемого нуклеазы Cas9, выращенной в DOX-содержащей среде в течение 48 ч. Впоследствии клетки были совместно трансфектированы синтетической трансактивирующей CRISPR РНК (tracrRNA), комплексованной с геномными сайт-специфическими олигонуклеотидами CRISPR РНК (crRNA), чтобы обеспечить быструю генерацию линий раковых клеток, несущих всю кластерную делецию miRNA и индивидуальные или комбинированные кластерные делеции генов miRNA в рамках одного эксперимента.
Преимуществами этой высокопроизводительной системы редактирования генов являются способность избежать трудоемкого субклонирования векторов ДНК, гибкость в трансфекции клеток с уникальными комбинациями направляющих РНК в формате 24 лунки и более дешевое генотипирование ПЦР с использованием сырых лизатов клеток. Исследования, использующие этот оптимизированный подход, обещают выявить функциональные избыточности и синергетические / антагонистические взаимодействия между членами кластера миРНК, что поможет охарактеризовать сложные небольшие некодирующие сети РНК, участвующие в заболеваниях человека, и лучше информировать будущий терапевтический дизайн.

Этот высокопроизводительный протокол делеции CRISPR был успешно использован с использованием трансфекции Cas9-индуцируемых LNCaP и PC3-ML линий раковых клеток человека с синтетическими олигонуклеотидными направляющими РНК, нацеленными на кластер miR-888, которые были изучены в контексте рака пр?...

Watch this Scientific Journal Video about CRISPR Gene Editing Tool for MicroRNA Cluster Network Analysis at JoVE.com

CRISPR Gene Editing Tool for MicroRNA Cluster Network Analysis

Этот протокол описывает высокопроизводительный процесс редактирования генов кластеризованных регулярно чередующихся коротких палиндромных повторов (CRISPR) для анализа сети кластеров микроРНК, который позволяет быстро генерировать панель генетически модифицированных клеточных линий, несущих уникальные комбинации делеции членов кластера miRNA размером до 35 кб в рамках одного эксперимента.

Инструмент редактирования генов CRISPR для анализа сети кластеров микроРНК

MicroRNAs (miRNAs) have emerged as important cellular regulators (tumor suppressors, pro-oncogenic factors) of cancer and metastasis. Most published ...

Этот протокол использует высокопроизводительный рабочий процесс редактирования генов CRISPR для молекулярного препарирования микрогенов РНК, организованных и кластеризованных единиц. И определить, как эти некодирующие сети РНК координируют пути прогрессирования рака. Эта процедура редактирования генов CRISPR позволяет исследователю быстро генерировать целую панель клеточных линий, несущих уникальные комбинации делеции кластеров микро-РНК, избегая при этом трудоемкого субклонирования вектора ДНК.Этот метод обеспечит более четкое понимание того, как кластерные микроРНК функционируют совместно для регулирования роста опухоли, агрессивности и лекарственной устойчивости, прежде чем переводить микроРНК в клинику в качестве терапевтических и диагностических инструментов. Продемонстрировать процедуру будет Грейс Йи, научный сотрудник моей лаборатории. Для начала создайте файл ДНК, содержащий полную геномную последовательность интересующей области кластера микроРНК по меньшей мере в одном килобайте окружающих геномных областей, используя программное обеспечение для аннотирования последовательностей ДНК.Затем разработайте четыре уникальные РНК CRISPR для каждого целевого микро-РНК-локуса. Две разработанные РНК CRISPR для нацеливания на дополнительные последовательности ДНК сразу же пять основных из кластера микро-РНК шпильки и два разработанных CRISPR РНК для нацеливания на дополнительные последовательности ДНК непосредственно на три основных из кластера микро-РНК шпильки. Используйте инструмент редактирования функций в созданном файле ДНК, чтобы отметить последовательность мишеней ДНК для каждой разработанной CRISPR РНК, подлежащей синтезу.Разработаны и синтезированы праймеры ПЦР, фланкирующие целевые области кластера микроРНК для генотипирования клеточных линий CRISPR. Выполните кривую концентрации доксициклина на вновь генерируемых лентии индуцируемых клеточных линиях Cas9, чтобы определить оптимальные условия для индукции белка Cas9. Пластина пять раз по 10 четвертых ячеек на лунку каждой из шести лунок плиты и растет при 37 градусах Цельсия, 5% углекислого газа, в предпочтительной среде в течение 24 часов.Разбавляют докс в предпочтительной среде с конечной кривой концентрации докса в диапазоне от 0 5100, 150, 250 до 500 нанограмм на миллилитр. Обозначьте колодцы каждой сидящей шестилуночной плиты от одной до шести. Удалите среду и замените соответствующими концентрациями докса.Выращивайте тарелки от одного до четырех до 24 часов, 48 часов и 72 часов индукции докса и 120 часов после отмены докса. Заготавливайте колодцы плиты в каждый момент времени. Обработайте гранулы клеток и буфер рипа для выделения лизата.Выполните анализ вестерн-блоттинга с 40 микрограммами белка, чтобы измерить индукцию белка Cas9 и определить оптимальную концентрацию Cas9. На бумаге наметьте пять комбинаций первичных и трех основных пар РНК CRISPR, которые будут трансецированы в каждую лунку пластины из 24 лунок, нацеленных на весь кластер микро-РНК, различные кластерные комбинации генов микро-РНК, а также отдельные члены кластера микро-РНК. Пластинчатая ленти индуцируемая литая девятиячеечная линия в пять раз по 10 до четвертой ячейки на лунку из 24 лунок пластины в предпочтительной среде, содержащей оптимизированную концентрацию докса.Выращивайте клетки в течение 24-48 часов при 37 градусах Цельсия, 5% углекислого газа, чтобы индуцировать экспрессию белка Cas9. Трансфектируйте ленти-индуцируемые клетки Cas9 подготовленными пятью первичными и тремя первичными направляющими РНК. Пометьте четыре 1,5-миллилитровые микроцентрифужные трубки на целевой локус микроРНК.В каждой трубке смешайте один к одному молярное соотношение индикаторной РНК и уникальных РНК CRISPR вместе, чтобы сформировать два микромолярных комплекса направляющих РНК. Добавьте 2,5 микролитра трассирующей РНК, 1,25 микролитра пяти первично позиционированных РНК CRISPR, 1,25 микролитра трех первично позиционированных РНК CRISPR и пять микролитров 10 миллимолярных трис hcl pH 7,5 буфера к 1,5-миллилитровой центрифужной трубке. Микроцентрифуга в течение 30 секунд при 16 000 G для смешивания.Инкубировать при комнатной температуре в течение пяти минут. К каждой трубке при 40 микролитрах восстановленной сывороточной среды до 10 микролитров головной РНК комплексной реакции. Аккуратно перемешайте, пипеткой вверх и вниз.В чистой 1,5-миллилитровой центрифужной трубке мягко смешивают два микролитра трансфекционного реагента и 48 микролитров восстановленной сывороточной среды путем пипетки вверх и вниз. Инкубировать при комнатной температуре в течение пяти минут. К каждой трубке, содержащей 50 микролитров направляющей смеси РНК, добавляют 50 микролитров разбавленного трансфекционного реагента.Пипетка смеси медленно вверх и вниз один раз, чтобы перемешать. Инкубировать при комнатной температуре в течение 20 минут. Добавьте 400 микролитров свободной от антибиотиков среды, дополненной доксициклином, в каждую трубку, содержащую 100 микролитров направляющей трансфекционной смеси РНК.Пипетку аккуратно перемешать. Удалите среду из индуцированных доксициклином ленти индуцируемых клеток Cas9. Добавьте 500 микролитров смеси трансформации рудиодоксициклиновой направляющей РНК на основе экспериментальной карты 24 лунок.Инкубируйте трансфектированные клетки в течение 48 часов при 37 градусах Цельсия в 5% углекислом газе. Замените среду свежей подготовленной средой без доксициклина. Позвольте клеткам восстановиться еще от 24 до 48 часов при 37 градусах Цельсия и 5% углекислого газа.Соберите трансфектированные клетки и подготовьтесь к генотипированию и одноклеточному бреду. Разделите 150 микролитров повторно суспендированных клеток на три части. Заморозить треть трансфектированных клеток в среде плюс 10% ДМСО в крио-флаконах для длительного хранения.Переведите треть трансфектированных клеток в чистую 0,2-миллилитрную ПЦР-трубку для генотипирования. Подготовьте последнюю треть трансфектированных клеток для подсчета и разбавления в формате пластины из 96 лунок для создания колоний одиночных клеток. Используя 12-канальный многопильный пипетку и стерильный резервуар для реагентов, добавьте 100 микролитров разбавленных ячеек на лунку в два ряда пластины для каждого разбавления.Дайте четыре-шесть недель, чтобы клетки выросли до софлюентности для расширения одноклеточной колонии. Соберите примерно от 10 до 15 одноклеточных колоний для генотипирования. Определите, по крайней мере, три независимые нокаутирующие одноклеточные колониальные линии для каждого целевого микро-локуса РНК.Сохранение одноячечных линий дикого типа в качестве элементов управления. Resuspend представлял собой клеточную гранулу в четырех микролитрах из пяти X-днк-полимеразного буфера, одного микролитра протеиназы K, одного микролитра РНКазы A и воды без нуклеазы общим объемом до 20 микролитров. Вши клетки в термоциклере при 56 градусах Цельсия в течение 30 минут и 96 градусов Цельсия в течение пяти минут.Храните лизаты клеток при температуре минус 20 градусов цельсия до готовности к генотипированию ПЦР. Выполните реакцию генотипирования ПЦР с использованием разработанных праймеров ПЦР, которые обрамляют направляющую РНК пять первичных и три первичных направляющих РНК-таргетных сайта. Запустите реакцию ПЦР в термоциклере с помощью программы, упомянутой в текстовой рукописи.Загрузите продукты ПЦР на гель 1% агарозы для анализа электрофореза. Извлеките ДНК из изолированных фрагментов ПЦР прогнозируемого молекулярного размера для нокаутирующих генотипов. Подготовьте образцы для секвенирования ДНК.Подтвердить, что реакция CRISPR была успешной, и выполнить секвенирование ДНК изолированных фрагментов ПЦР для идентификации места расщепления Cas9 и подтверждения делеции локуса микро-РНК. Были разработаны уникальные РНК CRISPR, нацеленные на всю 35-килограммовую область кластера miR-888. Меньшие кластерные комбинации в семействе miR-743 или семействе miR-891, а также делеции микроРНК.Анализ гель-электрофореза реакций ПЦР показал, что прогнозируемый размер фрагмента ДНК, представляющий нокаутирующий генотип, был амплифицирован для каждой трансфекции CRISPR. Одноклеточные колонии генотипировали с помощью ПЦР в проверенной последовательности. Секвенирование ДНК этих изолированных нокаутированных фрагментов ПЦР подтвердило, что трансфектированные пять первичных и три первичных направляющих РНК направляли лигирование расщепления Cas9 примерно на три нуклеотида выше участков PAM и подтвердили геномную потерю целевого микро-РНК-локуса.Анализы пролиферации WST-1, сравнивающие нокаут miR-891a и клетки дикого типа, подтверждают, что сверхэкспрессия микро-РНК, имитирующего лентивирусный вектор, индуцирует рост клеток предстательной железы, и поэтому было предсказано, что потеря miR-891 покажет взаимные эффекты. Помимо тщательного руководства по проектированию РНК, важно быстро генерировать одноклеточные колонии через каждую линию нокаута микро-РНК. Это особенно актуально, если нокаутирующие клетки микроРНК снижают рост жизнеспособности и будут легко превзойдены в смешанных популяциях с клетками дикого типа.Дополнительные методы, такие как количественная ПЦР в реальном времени, северное пятно и секвенирование РНК, должны быть выполнены, чтобы подтвердить, что нокаутирующие клеточные линии CRISPR не экспрессируют зрелую микроРНК для удаленного локуса.

Research

JoVE Journal

Biology

Microarray Analysis for Saccharomyces cerevisiae

Microarray Analysis for Saccharomyces cerevisiae

Microarray анализа для Saccharomyces CEREVISIAE</em

In this protocol, gene expression in yeast (Saccharomyces cerevisiae) is changed after exposure to oxidative stress induced by the addition of hydrogen ...

Using SecM Arrest Sequence as a Tool to Isolate Ribosome Bound Polypeptides

Использование МЭСМ последовательности арест как средство изолировать Рибосома связанных полипептидов

Extensive research has provided ample evidences suggesting that protein folding in the cell is a co-translational process1-5. However, the exact pathway ...

Analysis of Autophagy in Penicillium chrysogenum by Using Starvation Pads in Combination With Fluorescence Microscopy

Analysis of Autophagy in Penicillium chrysogenum by Using Starvation Pads in Combination With Fluorescence Microscopy

Анализ аутофагии в<em&gt; Пеницилл золотистый</em&gt; С помощью голодания колодки в сочетании с флуоресцентной микроскопии

The study of cellular quality control systems has emerged as a highly dynamic and relevant field of contemporary research. It has become clear that cells ...

Silencing the Spark: CRISPR/Cas9 Genome Editing in Weakly Electric Fish

Молчание Spark: CRISPR/Cas9 Редактирование генома в слабо электрической рыбы

Electroreception and electrogenesis have changed in the evolutionary history of vertebrates. There is a striking degree of convergence in these ...

Pupal and Adult Injections for RNAi and CRISPR Gene Editing in Nasonia vitripennis

Pupal and Adult Injections for RNAi and CRISPR Gene Editing in Nasonia vitripennis

Инъекции куколки и взрослых для редактирования генов РНКи и CRISPR в Nasonia vitripennis

The jewel wasp, Nasonia vitripennis, has become an efficient model system to study epigenetics of haplo-diploid sex determination, B-chromosome biology, ...

TGF-&#946;-mediated Endothelial to Mesenchymal Transition (EndMT) and the Functional Assessment of EndMT Effectors using CRISPR/Cas9 Gene Editing

TGF-ÃƒÅ½Ã‚Â²-mediated Endothelial to Mesenchymal Transition EndMT and the Functional Assessment of EndMT Effectors using CRISPR/Cas9 Gene Editing

TGF-β-опосредованный переход эндотелия в мезенхимальный переход (EndMT) и функциональная оценка эффекторов EndMT с использованием редактирования генов CRISPR/Cas9

In response to specific external cues and the activation of certain transcription factors, endothelial cells can differentiate into a mesenchymal-like ...

In Vitro Analysis of E3 Ubiquitin Ligase Function

In Vitro Analysis of E3 Ubiquitin Ligase Function

В пробирке Анализ функции E3 убиквитин лигазы

The covalent attachment of ubiquitin (Ub) to internal lysine residue(s) of a substrate protein, a process termed ubiquitylation, represents one of the ...

CRISPR/Cas9 Gene Editing of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells for Gene Therapy Applications

CRISPR/Cas9 Редактирование генов гемопоэтических стволовых и прогениторных клеток для применения генной терапии

CRISPR/Cas9 is a highly versatile and efficient gene-editing tool adopted widely to correct various genetic mutations. The feasibility of gene ...

Embryo Injection Technique for Gene Editing in the Black-Legged Tick, Ixodes scapularis

Embryo Injection Technique for Gene Editing in the Black-Legged Tick, Ixodes scapularis

Техника инъекции эмбриона для редактирования генов у черноногого клеща, Ixodes scapularis

Ticks can transmit various viral, bacterial, and protozoan pathogens and are therefore considered vectors of medical and veterinary importance. Despite ...

Protocols for CRISPR/Cas9 Mutagenesis of the Oriental Fruit Fly Bactrocera dorsalis

Protocols for CRISPR/Cas9 Mutagenesis of the Oriental Fruit Fly Bactrocera dorsalis

Протоколы для CRISPR/Cas9 мутагенеза восточной плодовой мухи Bactrocera dorsalis

The Oriental fruit fly, Bactrocera dorsalis, is a highly invasive and adaptive pest species that causes damage to citrus and over 150 other fruit crops ...