Name: crispr gene editing tool for microrna cluster network analysis
Uploaded: 2022-04-25T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about CRISPR Gene Editing Tool for MicroRNA Cluster Network Analysis at JoVE.com

PC3-ML hücre hatları Mark Stearn (Drexel Üniversitesi Tıp Fakültesi) tarafından sağlanmıştır. Justin Toxey PCR genotiplemesine yardımcı oldu. Bu çalışma, AE-K'ya bir Breedan Adams Vakfı Hibesi, bir Ryan Translasyonel Araştırma Fonu ve bir Commonwealth Sağlık Araştırma Kurulu Hibesi (CHRB-274-11-20) tarafından desteklenmiştir.

1. CRISPR gen düzenlemesi için hazırlık ve miRNA kümesi nakavt hücre hatları oluşturmak için kılavuz RNA tasarımı
<ol><li>Bir DNA dizisi ek açıklama yazılımı programı19 kullanarak, ilgilenilen miRNA küme bölgesinin (intergenik, intronik) ve çevredeki genomik bölgelerin en az 1 kB'sinin tam genomik dizisini içeren bir DNA dosyası oluşturun.<ol><li>Hedeflenen miRNA kümesi lokusunu (intergenik, intronik) ve miRNA kümesine ait her bir miRNA saç tokası di...

<ol>
	<li>Hasegawa, T., Lewis, H., Esquela-Kerscher, A., Laurence, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Translating MicroRNAs to the Clinic. , 329-369 (2017).</li><li>Lewis, H., Esquela-Kerscher, A., Thiagalingam, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Systems Biology of Cancer. , 134-153 (2015).</li><li>Esquela-Kerscher, A., Slack, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oncomirs+-+microRNAs+with+a+role+in+cancer.">Oncomirs - microRNAs with a role in cancer.</a> Nature Reviews Cancer. 6 (4), 259-269 (2006).</li><li>Breving, K., Esquela-Kerscher, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+complexities+of+microRNA+regulation:+mirandering+around+the+rules.">The complexities of microRNA regulation: mirandering around the rules.</a> The International Journal of Biochemistry &amp; Cell Biology. 42 (8), 1316-1329 (2010).</li><li>Griffiths-Jones, S., Saini, H. K., van Dongen, S., Enright, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=miRBase:+tools+for+microRNA+genomics.">miRBase: tools for microRNA genomics.</a> Nucleic Acids Research. 36, 154-158 (2008).</li><li>Kabekkodu, S. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clustered+miRNAs+and+their+role+in+biological+functions+and+diseases.">Clustered miRNAs and their role in biological functions and diseases.</a> Biological Reviews. 93 (4), 1955-1986 (2018).</li><li>Xiang, J., Wu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Feud+or+friend?+The+role+of+the+miR-17-92+cluster+in+tumorigenesis.">Feud or friend? The role of the miR-17-92 cluster in tumorigenesis.</a> Current Genomics. 11 (2), 129-135 (2010).</li><li>Aqeilan, R. I., Calin, G. A., Croce, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=miR-15a+and+miR-16-1+in+cancer:+discovery,+function+and+future+perspectives.">miR-15a and miR-16-1 in cancer: discovery, function and future perspectives.</a> Cell Death &amp; Differentiation. 17 (2), 215-220 (2010).</li><li>Hasegawa, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+and+evidence+of+the+miR-888+cluster+as+a+novel+cancer+network+in+prostate.">Characterization and evidence of the miR-888 cluster as a novel cancer network in prostate.</a> Molecular Cancer Research. , (2018).</li><li>Lewis, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=miR-888+is+an+expressed+prostatic+secretions-derived+microRNA+that+promotes+prostate+cell+growth+and+migration.">miR-888 is an expressed prostatic secretions-derived microRNA that promotes prostate cell growth and migration.</a> Cell Cycle. 13 (2), 227-239 (2014).</li><li>Xu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+a+prostate+cancer+susceptibility+locus+on+the+X+chromosome.">Evidence for a prostate cancer susceptibility locus on the X chromosome.</a> Nature Genetics. 20 (2), 175-179 (1998).</li><li>Schleutker, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genetic+epidemiological+study+of+hereditary+prostate+cancer+(HPC)+in+Finland:+frequent+HPCX+linkage+in+families+with+late-onset+disease.">A genetic epidemiological study of hereditary prostate cancer (HPC) in Finland: frequent HPCX linkage in families with late-onset disease.</a> Clinical Cancer Research. 6 (12), 4810-4815 (2000).</li><li>Farnham, J. M., Camp, N. J., Swensen, J., Tavtigian, S. V., Albright, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Confirmation+of+the+HPCX+prostate+cancer+predisposition+locus+in+large+Utah+prostate+cancer+pedigrees.">Confirmation of the HPCX prostate cancer predisposition locus in large Utah prostate cancer pedigrees.</a> Human Genetics. 116 (3), 179-185 (2005).</li><li>Brown, W. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hereditary+prostate+cancer+in+African+American+families:+linkage+analysis+using+markers+that+map+to+five+candidate+susceptibility+loci.">Hereditary prostate cancer in African American families: linkage analysis using markers that map to five candidate susceptibility loci.</a> British Journal Of Cancer. 90 (2), 510-514 (2004).</li><li>Bochum, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Confirmation+of+the+prostate+cancer+susceptibility+locus+HPCX+in+a+set+of+104+German+prostate+cancer+families.">Confirmation of the prostate cancer susceptibility locus HPCX in a set of 104 German prostate cancer families.</a> Prostate. 52 (1), 12-19 (2002).</li><li>Doudna, J. A., Charpentier, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+editing.+The+new+frontier+of+genome+engineering+with+CRISPR-Cas9.">Genome editing. The new frontier of genome engineering with CRISPR-Cas9.</a> Science. 346 (6213), 1258096 (2014).</li><li>Adli, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+CRISPR+tool+kit+for+genome+editing+and+beyond.">The CRISPR tool kit for genome editing and beyond.</a> Nature Communications. 9 (1), (2018).</li><li>Jinek, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+programmable+dual-RNA+guided+DNA+endonuclease+in+adaptive+bacterial+immunity.">A programmable dual-RNA guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity.</a> Science. 337 (6096), 816-821 (2012).</li><li>. SnapGene&#174; software (from Insightful Science; available at snapgene.com) Available from: <a target="_blank" href="https://www.snapgene.com">https://www.snapgene.com</a> (2022)</li><li>. Ensembl Release 104 genome browser (from EMBL-EBI) Available from: <a target="_blank" href="https://www.ensembl.org">https://www.ensembl.org</a> (2022)</li><li>Howe, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ensembl+2021.">Ensembl 2021.</a> Nucleic Acids Research. 49, 884-891 (2021).</li><li>. miRBase: the microRNA database, Release 22.1 (from Griffiths-Jones laboratory) Available from: <a target="_blank" href="https://www.mirbase.org">https://www.mirbase.org</a> (2022)</li><li>. Dharmacon CRISPR Design Tool (from Dharmacon) Available from: <a target="_blank" href="https://www.horizondiscovery.com/en/ordering-and-calculation-tools/crispr-dna-region-designer">https://www.horizondiscovery.com/en/ordering-and-calculation-tools/crispr-dna-region-designer</a> (2022)</li><li>. Off-Spotter (Venetia Pliatsika &amp; Isidore Rigoutsos of the Jefferson Computational Medicine Center) Available from: <a target="_blank" href="https://cm.jefferson.edu/Off-Spotter/">https://cm.jefferson.edu/Off-Spotter/</a> (2022)</li><li>Bao, X. R., Pan, Y., Lee, C. M., Davis, T. H., Bao, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tools+for+experimental+and+computational+analyses+of+off-target+editing+by+programmable+nucleases.">Tools for experimental and computational analyses of off-target editing by programmable nucleases.</a> Nature Protocols. 16 (1), 10-26 (2021).</li><li>. Dharmacon DharmaFECT Transfection Reagent Cell Type Guide. Choose Dharmacon DharmaFECT 1, 2, 3, or 4 for optimal transfection of siRNA or miRNA reagents Available from: <a target="_blank" href="https://horizondiscovery.com/-/media-Files/Horizon/resources/Selection-guides/dharmafect-cell-type-guidelines.pdf">https://horizondiscovery.com/-/media-Files/Horizon/resources/Selection-guides/dharmafect-cell-type-guidelines.pdf</a> (2022)</li><li>Baffoe-Bonnie, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+major+locus+for+hereditary+prostate+cancer+in+Finland:+localization+by+linkage+disequilibrium+of+a+haplotype+in+the+HPCX+region.">A major locus for hereditary prostate cancer in Finland: localization by linkage disequilibrium of a haplotype in the HPCX region.</a> Human Genetics. 117 (4), 307-316 (2005).</li><li>Zhang, R., Peng, Y., Wang, W., Su, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+evolution+of+an+X-linked+microRNA+cluster+in+primates.">Rapid evolution of an X-linked microRNA cluster in primates.</a> Genome Research. 17 (5), 612-617 (2007).</li><li>Ohnuki, Y., Marnell, M. M., Babcock, M. S., Lechner, J. F., Kaighn, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromosomal+analysis+of+human+prostatic+adenocarcinoma+cell+lines.">Chromosomal analysis of human prostatic adenocarcinoma cell lines.</a> Cancer Research. 40 (3), 524-534 (1980).</li><li>Beheshti, B., Karaskova, J., Park, P. C., Squire, J. A., Beatty, B. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+high+frequency+of+chromosomal+rearrangements+in+the+centromeric+regions+of+prostate+cancer+cell+lines+by+sequential+giemsa+banding+and+spectral+karyotyping.">Identification of a high frequency of chromosomal rearrangements in the centromeric regions of prostate cancer cell lines by sequential giemsa banding and spectral karyotyping.</a> Molecular Diagnosis. 5 (1), 23-32 (2000).</li></ol>

Bu CRISPR gen düzenleme prosedürü, araştırmacının benzersiz miRNA kümesi delesyon kombinasyonlarını taşıyan tüm hücre hatları panelini hızlı bir şekilde oluşturmasını sağlar. Bu protokolde sentetik tracrRNA (1: 1 molar oran) ile tavlanmış 5' ve 3' genomik bölgeye özgü crRNA'lardan oluşan sentetik kılavuz RNA'ların transfeksiyonu, zaman alıcı plazmid vektör alt klonlamasını önler ve 24 kuyucuklu bir format kullanarak daha esnek ve yüksek verimli bir deneysel tasarıma izin verir. DOX i...

Kodlamayan RNA'ların insan hastalığına katkısını araştırmak için daha iyi araştırma araçlarına ihtiyaç vardır. MiRNA disregülasyonu, kanser gibi insan bozukluklarında, kanser hastalarının dokularındaki ve vücut sıvılarındaki (örneğin, kan, idrar) bu küçük kodlamayan RNA'ların ekspresyon profillerini kanser olmayanlara, sağlıklı bireylere, mikrodizilerin kullanılmasına, kantitatif gerçek zamanlı PCR'ye (qRT-PCR) ve yeni nesil derin dizileme teknolojilerine karşı karşılaştırırken sıklıkla gözlenir 1,2 . Son zamanlarda yapılan çalışmalar, bu miRNA'ların büyük bir alt kümesini, tümör oluşumunu, hastalık progresyonunu ve ilaç direncini kontrol eden tümör baskılayıcı, onkojenik ve metastaz faktörleri olarak karakterize etmiştir. MiRNA'ların deneysel aşırı ekspresyonu ve / veya downregülasyon / kaybı, hücrede fonksiyonel ve pleiotropik sonuçlara neden olur ve bu kodlamayan RNA'ların koordine ettiği kanserle ilişkili çok çeşitli aktiviteleri yansıtır - büyüme, apoptoz, farklılaşma, kromatin yeniden şekillenmesi, anjiyogenez, mezenkimal epitel (EMT) ve MET geçişleri, metabolizma ve immün yanıt3.
MiRNA'lar tek genler olarak kodlanır veya çekirdekte transkribe edilen ve sitoplazmada lokalize olan biyolojik olarak olgunlaşmış, tek sarmallı ~ 22 nükleotid (nt) miRNA türlerini üretmeden önce kapsamlı bir şekilde işlenen genomik kümelerde bulunur4. Bu küçük RNA'lar etkilerini transkripsiyon sonrası uygularlar ve katalitik RNA kaynaklı susturma kompleksini (RISC) mRNA bölgesine getirmek için mesajcı RNA (mRNA) hedeflerine bağlanan negatif gen düzenleyicileri olarak hareket ederler, bu da mRNA bozulmasına ve / veya protein translasyonunda bir bloğa neden olur. MiRNA'lar, hayvan sistemlerinde kodlamayan RNA'ların son derece bol bir sınıfıdır ve insan genomunda 2.654 olgun miRNA bulunur (miRBaz salınımı 22.1)5. MiRNA'lar tipik olarak mRNA hedeflerine eksik tamamlayıcılık ile ilişkilidir4. Bu nedenle, tek bir miRNA onlarca ila yüzlerce farklı mRNA hedefini düzenleyebilir ve işlevsel olarak çok çeşitli biyolojik yolları etkileyebilir. MiRNA tabanlı mekanizmaların karmaşıklığına katkıda bulunmak için, tek bir mRNA çoklu, farklı miRNA'lar tarafından düzenlenebilir. Bu nedenle, miRNA disregülasyonunun vücudun homeostatik dengesini nasıl bozduğunu ve insan malignitesine nasıl yol açtığını araştırmak zordur.
Yayınlanan çalışmaların çoğu, hastalık olaylarındaki rollerini karakterize ederken tek bir miRNA'ya odaklanmıştır. Bununla birlikte, insan miRNA genlerinin ~% 30'u, genellikle aynı yönde transkripte edilen ve birlikte eksprese edilen, kodlanmamış RNA regülasyonunun koordineli ve karmaşık bir sistemini gösteren kümelenmiş birimler (tipik olarak ~ 10 kilobaz [kb]) halinde organize edilmiştir6. En büyük polisistronik insan miRNA kümesi, 54 miRNA öncülünden oluşan 14q32 kümesidir. İnsan kanserleri ile ilişkili en iyi çalışılmış kümelenmiş miRNA birimlerinden biri, kodlamayan RNA, c13orf25'in intron 3'ünde bulunan miR-17, miR-18a, miR-19a, miR-19a, miR-20a, miR-19b-1 ve miR-92-1'den oluşan miR-17-92 polisistronik kümesidir. MiR-17-92 kümesi hematopoetik malignitelerde sıklıkla çoğalır ve solid tümörlerde aşırı eksprese edilir ve hücre döngüsü progresyonunu, apoptozu ve anjiyogenezi teşvik etmede onkojenik roller oluşturmuştur7. Ek olarak, kodlamayan gen Leu2'nin intronunda bulunan tümör baskılayıcı miR-15a ve miR-16-1 kümesi genellikle lösemilerde silinir ve antiapoptotik gen BCL2'yi ve ek hücre döngüsü ilerleme genleri8'i hedefleyerek tümör büyümesini bloke etmek için işlev gören çok çeşitli kanserlerde aşağı regüle edilir. Yüksek dereceli prostat kanseri olan hastalarda miR-888 kümesi yükselir ve insan kromozomu Xq27.3 9,10 üzerinde bulunan yedi miRNA geninden (miR-892c, -890, -888, -892a, -892b, -891b ve -891a) oluşur.
MiR-888 kümesi, HPCX1 lokusu (Kalıtsal Prostat Kanseri, X'e bağlı 1) içinde, kalıtsal prostat kanseri ailesi soyağacı 11,12,13,14,15,29'un bağlantı analizi ile tanımlanan Xq27-2'yi kapsayan haritalardır. Geleneksel miRNA yanlış ekspresyon araçları (miRNA taklitleri ve antisens inhibitörleri) kullanılarak bireysel miR-888 kümelenmiş üyelerinin fonksiyonel karakterizasyonu, bu miRNA'ların prostat tümörü büyümesini ve invazyonunu düzenlemede örtüşen roller oynadığını göstermiştir 9,10. Bununla birlikte, bu deneysel yöntemler, çoklu miR-888 kümelenmiş üyelerinin, doku homeostazını ve kanser ilerlemesini kontrol etmek için kodlamayan bir RNA ağında sinerjik veya antagonistik olarak nasıl hareket ettiğini incelemek için kendilerini kolayca ödünç vermez. Yüksek verimli CRISPR gen düzenleme teknolojisini kullanan bu tarif edilen kolaylaştırılmış protokol, bu bilgi boşluğunu kapatmak için insan kanserleriyle ilişkili miRNA kümelerini (örneğin, miR-888 kümesi) moleküler olarak diseke etmek için modifiye edilmiştir.
Bakteriyel CRISPR ve CRISPR ile ilişkili (cas) genler, bakteriyofajlara karşı adaptif bağışıklığa aracılık eder16. Bu eski prokaryotik gözetim sisteminin keşfi, istenen herhangi bir genomik lokusu kolayca hedeflemek ve hem in vitro hem de in vivo16,17 çok çeşitli hayvan sistemleri ve hücre tipleri içinde DNA dizisi değişiklikleri yapmak için etkili bir bilimsel araç olarak hızla uyarlandı. Bu teknik, insan hastalığı bağlamında miRNA ağlarını sorgulamak için etkili bir yöntem olarak büyük umut vaat ediyor. Bu amaçla, ölümsüzleştirilmiş insan prostat kanseri hücre hatlarında (LNCaP, PC3-ML) insan kromozomu X üzerinde ~ 35 kb'yi kapsayan miR-888 kümesini incelemek için bu yüksek verimli CRISPR gen düzenleme protokolü, küme üyelerinin kanser ilerleme yollarını nasıl koordine ettiğini sorgulamak için inşa edilmiştir. Bu yaklaşım, herhangi bir miRNA kümesini karakterize etmek için uygulanabilir ve araştırmacıların tüm miRNA kümesi delesyonunu ve bireysel ve kombinasyon miRNA gen kümesi delesyonlarını tek bir deneyde taşıyan insan hücre hatlarını hızla üretmelerini sağlar.
Bu prosedürde, araştırmacının Streptococcus pyogenes CRISPR ile ilişkili endonükleaz Cas9 (csn1) gen ekspresyonunu kurucu DOX ile indüklenebilir promotör TRE3G aracılığıyla kontrol etmesini sağlayan bir doksisiklin (DOX) ile indüklenebilir lentiviral ekspresyon sistemi taşıyan stabil hücre hatları kurulur. Tet-On 3G iki parçalı sistemi, hem Tet-On 3G geninin hem de blastistronic direnç geninin (BlastR) transkripsiyonunu sağlamak için kurucu bir insan uzama faktörü 1 alfa (hEF1alfa) promotörünü içerir. Tet-On 3G transaktivatör proteini sadece DOX varlığında TRE3G promotörüne bağlanır ve sağlam Cas9 transkripsiyonu ile sonuçlanır. DOX'un yokluğunda, bazal Cas9 ifadesi yoktur veya çok azdır. Bu nedenle, araştırmacı, CRISPR gen düzenleme adımları sırasında DOX ile desteklenmiş ortamda yetiştirilen hücrelerde yüksek Cas9 protein üretimini indükleyebilir ve DOX çekilmesi üzerine hızlı CAS9 protein klirensini kontrol edebilir.
Bu protokol aynı zamanda tüm miRNA kümesini çevreleyen bölgeleri, bireysel miRNA saç tokası (premiRNA) bölgelerini ve / veya küme içindeki miRNA genlerinin alt kümelerini hedefleyen sentetik CRISPR RNA (crRNA) oligonükleotidlerinin tasarımını da tanımlar. Tasarlanan her crRNA, benzersiz bir 5'-terminal 20 nt kılavuz dizisi (hedeflenecek genomik ilgi dizisinin tamamlayıcısı), ardından evrensel trans-aktive edici CRISPR RNA (tracrRNA) oligonükleotidleri18 ile baz eşleşmesini sağlayan değişmez bir 22 nt S. pyogenes tekrar dizisi (5'-XXXXXXXXXXXXXXXXXXXX-GUUUUAGAGCUAUGCUGUUUUG-3') içerir. Birlikte, tavlanmış crRNA ve tracrRNA (karışık 1: 1 oranı) bu protokol için kılavuz RNA olarak işlev görür (Şekil 1A). Her deneyde, iki sentetik kılavuz RNA, bakteriyel Cas9 proteinini, çıkarılması hedeflenen miRNA küme bölgesini çevreleyen genomik DNA bölgelerine (5' ve 3') ilişkilendirmek ve eşlik etmek için DOX ile indüklenen hücrelere dönüştürülür (Şekil 1B).
Hücre genomunda bir protospacer bitişik motif (PAM) dizisi (vahşi tip S. pyogenes Cas9 için 5'-NGG-3') bulunmalı ve kılavuz RNA17 tarafından hedeflenen 20 nt DNA dizisinin hemen bitişiğinde bulunmalıdır. PAM dizisi bağlayıcı bir sinyal görevi görür ve endonükleaz Cas9 enziminin katalitik bölgesini hedeflenen genomik DNA bölgesine konumlandırır, daha sonra PAM'ın ~ 3 nt yukarı yönünde bulunan yönlendirilmiş, çift sarmallı (ds) DNA bölünmesine yol açar. Hücrenin DNA onarım makinesi, parçalanmış DNA uçlarını onarır, bu da mükemmel ligasyonla sonuçlanabilir, ancak genellikle homolog olmayan uç birleştirme (NHEJ) meydana gelir ve onarım bölgesinde küçük eklemelere veya silmelere (indels) neden olur. MiRNA'lar genellikle intergenik ve intronik bölgelerde bulunan kodlamayan genler olduğundan, bu indeller istenmeyen saçmalık / yanlış mutasyonlar yaratma riski düşüktür.
Bu deneylerde kılavuz RNA kompleksi için sentetik RNA oligonükleotidleri (tavlanmış crRNA ve tracrRNA, 1: 1 molar oran) kodlayarak, bu gen nakavt stratejisi, zaman alıcı DNA vektör alt klonlamasını önler ve benzersiz kılavuz RNA kombinasyonlarını hücrelere 24 kuyucuklu bir formatta transfekte etmede büyük esneklik sağlar. PCR genotip taraması için ham hücre lizatlarının hazırlanması, pahalı ve zaman alıcı DNA saflaştırma yöntemlerinden de kaçınırken, kolaylaştırılmış tek koloni hücre hattı üretimi ve fenotipik analize izin verir. Gerçekten de, bu yüksek verimli CRISPR gen düzenleme protokolü, kültürlenmiş prostat kanseri hücre hatlarını (LNCaP, PC3-ML) tek bir deneyde 32 benzersiz kılavuz RNA kombinasyonu ile transfekte etmek ve tüm ~ 35 kb miR-888 küme bölgesi için delesyon taşıyan nakavt hatları üretmek için başarıyla kullanılmıştır; miR-743 ve miR-891a ailelerine ait miR-888 küme üyeleri için daha küçük delesyon kombinasyonları; miR-888 kümesi içindeki bireysel miRNA üyeleri için delesyonların yanı sıra. Bunun gibi çalışmalar, kümelenmiş miRNA'ların, miRNA'ları kliniğe terapötik ve tanısal araçlar olarak çevirmeden önce tümör büyümesini, saldırganlığını ve ilaç direncini düzenlemek için işbirliği içinde nasıl işlev gördüğünün daha net bir şekilde belirtilmesini sağlayacaktır.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.2 mL PCR tubes, flat cap</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>14-230-225</td>
			<td>Plasticware</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL Microcentrifuge Tubes</td>
			<td>Seal-Rite</td>
			<td>1615-5500</td>
			<td>Plasticware</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well tissue culture plate</td>
			<td>Corning Costar</td>
			<td>&#160;09761146</td>
			<td>Plasticware</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5x Phusion HF Buffer</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>F-518L</td>
			<td>PCR reagent, genotyping</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well tissue culture plate</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>FB012927</td>
			<td>Plasticware</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well tissue culture plate</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>08-772-2C</td>
			<td>Plasticware</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-CRISPR-Cas9 antibody [7A9-3A3], Mouse monoclonal</td>
			<td>AbCam</td>
			<td>ab191468</td>
			<td>Western blot reagent; 160 kDa; dilution 1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic-Antimycotic (100x)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15240062</td>
			<td>Tisuue culture reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BLAST nucleotide search engine</td>
			<td>National Center for Biotechnology Information</td>
			<td>NA</td>
			<td>Freeware; website: blast.ncbi.nlm.nih.gov</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blasticidin S, Hydrochloride, Streptomyces griseochromogenes</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td>CAS 589205</td>
			<td>CRISPR reagent; Chemical, Working stock = 1 mg/mL in water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Countess 3 Automated Cell Counter</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A50298</td>
			<td>Equipment; Cell counter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryogenic tubes</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>50001012</td>
			<td>Plasticware</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dharmacon CRISPR Design Tool</td>
			<td>Horizon Discovery Ltd.</td>
			<td>NA</td>
			<td>Freeware; website: horizondiscovery.com/en/ordering-and-calculation-tools/crispr-dna-region-designer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DharmaFECT siRNA Transfection Reagent #2</td>
			<td>Dharmacon, Inc.</td>
			<td>T-2002-02</td>
			<td>Transfection reagent; LNCaP and PC3-ML cell lines</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>&#160;BP231100</td>
			<td>Tisuue culture reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM Medium with L-Glutamine, 4.5g/L Glucose and Sodium Pyruvate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>MT10013CV</td>
			<td>Tisuue culture reagent; Media for PC3-ML cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Doxycycline Hydrochloride, Ready Made Solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D3072-1ML</td>
			<td>CRISPR reagent; Chemical, Working stock = 1 mg/mL stock in water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS, no calcium, no magnesium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190144</td>
			<td>Tisuue culture reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Edit-R CRISPR-Cas9 Synthetic tracrRNA, 20 nmol, designed</td>
			<td>Dharmacon, Inc.</td>
			<td>U-002005-20</td>
			<td>CRISPR reagent; Universal tracrRNA oligonucleotides</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Edit-R Modified Synthetic crRNA, 
			desalted/deprotected, 2 nmol</td>
			<td>Dharmacon, Inc.</td>
			<td>crRNA-460XXX</td>
			<td>CRISPR reagent; Designed crRNA oligonucleotides</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EditR Inducible Lentiviral hEF1aBlastCas9 Nuclease Particles, 50 &#956;L, 107 TU/mL</td>
			<td>Dharmacon, Inc.</td>
			<td>VCAS11227</td>
			<td>CRISPR reagent; Lenti-iCas9; Doxycycline-inducible lentiviral Streptococcus pyogenes Cas9 vector system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ensembl genomic viewer</td>
			<td>Ensembl</td>
			<td>NA</td>
			<td>Freeware; website: [ensembl.org] Use: Genome browser to identify a nucleotide seuqnces containing the miRNA cluster and surrounding gene/regulatory sequences.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GAPDH Antibody (FL-335), rabbit polyclonal</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc25778</td>
			<td>Western blot reagent; 37 kDa; dilution 1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel/PCR DNA Fragment Extraction Kit</td>
			<td>IBI Scientific</td>
			<td>IB47010</td>
			<td>Nucleic acid gel electrophoresis reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco Fetal Bovine Serum, certified</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>16000044</td>
			<td>Tisuue culture reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hexadimethrine bromide</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>H9268</td>
			<td>CRISPR reagent; Chemical, Working stock = 0.8 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immobilon-FL PVDF Membrane</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>IPFL10100</td>
			<td>Western blot reagent; nitrocellulose</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Intercept (TBS) Blocking Buffer</td>
			<td>LI-COR</td>
			<td>927-60001</td>
			<td>Western blot reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IRDye 680RD Goat anti-Mouse IgG Secondary Antibody</td>
			<td>LI-COR</td>
			<td>926-68070</td>
			<td>Western blot reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IRDye 800CW Goat anti-Rabbit IgG Secondary Antibody</td>
			<td>LI-COR</td>
			<td>926-32211</td>
			<td>Western blot reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>&#160;5425 R</td>
			<td>Plasticware</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>miRBase microRNA viewer</td>
			<td>miRBase</td>
			<td>NA</td>
			<td>Freeware; website: [mirbase.org] Use: Borowser lists all annotated miRNA hairpins, mature miRNA sequences and associated clustered miRNAs mapping within 10 kb.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NuPAGE 4 to 12%, Bis-Tris, 1.0 mm, Mini Protein Gel, 10-well</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>NP0321BOX</td>
			<td>Western blot reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Odyssey CLx Imaging System</td>
			<td>LI-COR</td>
			<td>CLx</td>
			<td>Equipment; Western blot imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM Reduced Serum Medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>31985062</td>
			<td>Transfection reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Owl D2 Wide-Gel Electrophoresis System</td>
			<td>Owl</td>
			<td>D2-BP</td>
			<td>Equipment; Nucleic acid gel electrophoresis system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR Primers, designed (single-stranded DNA oligonucleotides)</td>
			<td>Integrated DNA Technology</td>
			<td>NA</td>
			<td>PCR reagent, genotyping</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phusion High-Fidelity DNA Polymerase (2 U/&#181;L)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>F530S</td>
			<td>PCR reagent, genotyping</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RIPA Lysis Buffer 10x</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>20-188</td>
			<td>Western blot reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K Solution (20 mg/mL), RNA grade</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>25530049</td>
			<td>PCR reagent, genotyping</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase A, DNase and protease-free (10 mg/mL)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>EN0531</td>
			<td>PCR reagent, genotyping</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640 Medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>MT10041CV</td>
			<td>Tisuue culture reagent; Media for LNCaP cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SnapGene Viewer</td>
			<td>Snap Gene</td>
			<td>NA</td>
			<td>Freeware; website: [snapgene.com]&#160;Use: DNA sequence annotation software program to create a DNA file for gRNA design and which&#160; highlights the miRNA cluster locus (intergenic, intronic), each individual miRNA hairpin sequence belonging to the miRNA cluster, and other nearby coding and non-coding genes and/or regulatory features</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE Select Enzyme (1x), no phenol red</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12563029</td>
			<td>Tisuue culture reagent; Recombinant trypsin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure Agarose</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>16500100</td>
			<td>Nucleic acid gel electrophoresis reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Veriti 96-Well Fast Thermal Cycler</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>4375305</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XCell SureLock Mini-Cell Electrophoresis System</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>EI0001</td>
			<td>Equipment; Protein gel electrophoresis system</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

crispr gene editing tool for microrna cluster network analysis

MikroRNA'lar (miRNA'lar) kanser ve metastazın önemli hücresel düzenleyicileri (tümör baskılayıcılar, pro-onkojenik faktörler) olarak ortaya çıkmıştır. Yayınlanan çalışmaların çoğu, küçük RNA'ların kanserdeki rolünü karakterize ederken tek bir miRNA'ya odaklanmaktadır. Bununla birlikte, insan miRNA genlerinin ~% 30'u, genellikle birlikte eksprese edilen kümelenmiş birimlerde düzenlenmiştir, bu da karmaşık ve koordineli bir kodlamayan RNA düzenleme sistemini gösterir. Kodlanmamış küçük RNA'ları kliniğe çevirmeden önce kümelenmiş miRNA ağlarının tümör büyümesini, kanser saldırganlığını ve ilaç direncini düzenlemek için işbirliği içinde nasıl çalıştığının daha net bir şekilde belirtilmesi gerekir.
Prostat kanseri bağlamında ~ 35.000 bp uzunluğunda bir lokus içinde bulunan yedi miRNA geninden oluşan genomik bir kümenin onkojenik rolünü incelemek için düzenli olarak aralıklı kısa palindromik tekrarlar (CRISPR) aracılı gen düzenleme prosedürünün kullanılması, yüksek verimli bir kümelenmiş olarak kullanılmıştır. Bu yaklaşım için, insan kanseri hücre hatları, DOX içeren ortamda 48 saat boyunca yetiştirilen doksisiklin (DOX) ile indüklenebilir Cas9 nükleaz için bir lentivirüs vektörü ile enfekte edildi. Hücreler daha sonra, tüm miRNA kümesi delesyonunu ve bireysel veya kombinasyon miRNA gen kümesi delesyonlarını tek bir deneyde taşıyan kanser hücresi hatlarının hızlı bir şekilde üretilmesine izin vermek için genomik bölgeye özgü CRISPR RNA (crRNA) oligonükleotidleri ile komplekslenmiş sentetik trans-aktive edici CRISPR RNA (tracrRNA) ile birlikte transfekte edildi.
Bu yüksek verimli gen düzenleme sisteminin avantajları, zaman alıcı DNA vektör alt klonlamasından kaçınma yeteneği, 24 kuyucuklu bir formatta benzersiz kılavuz RNA kombinasyonları ile hücreleri transfekte etme esnekliği ve ham hücre lizatları kullanarak daha düşük maliyetli PCR genotiplemesidir. Bu kolaylaştırılmış yaklaşımı kullanan çalışmalar, insan hastalığında yer alan karmaşık küçük kodlamayan RNA ağlarının karakterize edilmesine yardımcı olacak ve gelecekteki terapötik tasarımı daha iyi bilgilendirecek olan miRNA kümesi üyeleri arasındaki fonksiyonel fazlalıkları ve sinerjik / antagonistik etkileşimleri ortaya çıkarmayı vaat etmektedir.

Bu yüksek verimli CRISPR delesyon protokolü, Cas9 ile indüklenebilir LNCaP ve PC3-ML insan kanseri hücre hatlarının, prostat kanseri bağlamında incelenen miR-888 kümesini hedef alan sentetik oligonükleotid kılavuz RNA'ları ile transfeksiyonu kullanılarak başarıyla kullanılmıştır. MiR-888 kümesi başlangıçta bir ekspresyon profilleme ekranında, düşük dereceli ve kanser dışı hastalara kıyasla yüksek dereceli hastalığı olan prostat kanseri hastalarında yüksek olarak tanımlanmıştır<sup...

Watch this Scientific Journal Video about CRISPR Gene Editing Tool for MicroRNA Cluster Network Analysis at JoVE.com

CRISPR Gene Editing Tool for MicroRNA Cluster Network Analysis

Bu protokol, mikroRNA küme ağ analizi için düzenli aralıklarla aralıklı kısa palindromik tekrarlar (CRISPR) gen düzenleme iş akışını tanımlayan yüksek verimli bir kümelenmiş ve tek bir deneyde 35 kb kadar büyük benzersiz miRNA kümesi üyesi delesyon kombinasyonları taşıyan genetiği değiştirilmiş hücre hatlarından oluşan bir panelin hızlı bir şekilde üretilmesini sağlar.

MicroRNA Küme Ağ Analizi için CRISPR Gen Düzenleme Aracı

MicroRNAs (miRNAs) have emerged as important cellular regulators (tumor suppressors, pro-oncogenic factors) of cancer and metastasis. Most published ...

Bu protokol, organize edilmiş ve kümelenmiş mikro RNA genlerini moleküler olarak incelemek için yüksek verimli bir CRISPR gen düzenleme iş akışı kullanır. Ve bu kodlamayan RNA ağlarının kanser ilerleme yollarını nasıl koordine ettiğini belirlemek. Bu CRISPR gen düzenleme prosedürü, araştırmacının zaman alıcı DNA vektörü alt klonlamasından kaçınırken, benzersiz mikro RNA kümesi delesyon kombinasyonlarını taşıyan tüm hücre hatları panelini hızlı bir şekilde oluşturmasını sağlar.Bu yöntem, kümelenmiş mikro RNA'ların, mikro RNA'ları terapötik ve tanısal araçlar olarak kliniğe çevirmeden önce tümör büyümesini, saldırganlığını ve ilaç direncini düzenlemek için işbirliği içinde nasıl işlev gördüğünün daha net bir şekilde anlaşılmasını sağlayacaktır. Prosedürü gösteren, laboratuvarımda araştırma görevlisi olan Grace Yi olacak. Başlamak için, bir DNA dizisi ek açıklama yazılımı programı kullanarak, çevredeki genomik bölgelerin en az bir kilobaytında ilgilenilen mikro RNA kümesi bölgesinin tam genomik dizisini içeren bir DNA dosyası oluşturun.Daha sonra, hedeflenen her mikro RNA lokusu için dört benzersiz CRISPR RNA'sı tasarlayın. Mikro RNA saç tokası kümesinin hemen beş primini ücretsiz DNA dizilerini hedeflemek için tasarlanmış iki CRISPR RNA ve mikro RNA saç tokası kümesinin hemen üç primini ücretsiz DNA dizilerini hedeflemek için tasarlanmış iki CRISPR RNA'sı. Sentezlenecek her tasarlanmış CRISPR RNA'sı için DNA hedef dizisini işaretlemek üzere oluşturulan DNA dosyasında bir özellik düzenleme aracı kullanın.CRISPR hücre hatlarının genotiplendirilmesi için hedeflenen mikro RNA küme bölgelerini çevreleyen tasarlanmış ve sentezlenmiş PCR primerleri. Cas9 protein indüksiyonu için en uygun koşulları belirlemek için yeni üretilen mercimeği ile indüklenebilir Cas9 hücre hatları üzerinde bir doksisiklin konsantrasyon eğrisi gerçekleştirin. Her altı kuyu plakasının kuyusu başına dördüncü hücrelerin beş çarpı 10'unu plakalayın ve 24 saat boyunca tercih edilen ortamda% 5 karbondioksit olan 37 santigrat derecede büyür.Dox'u, mili litre başına 0 5100, 150, 250 ila 500 nanogram arasında değişen son bir dox konsantrasyon eğrisi ile tercih edilen ortamda seyreltin. Her oturmuş altı kuyu plakasının kuyularını bir ila altı arasında etiketleyin. Ortamı çıkarın ve uygun doks konsantrasyonlarıyla değiştirin.Plakaları 24 saat, 48 saat ve 72 saat doks indüksiyonu ve dox çekilmesinden 120 saat sonrasına kadar bir ila dört arasında büyütün. Her zaman noktasında plakanın kuyularını hasat edin. Lisat izolasyonu için hücre peletlerini ve ripa tamponunu işleyin.Cas9 protein indüksiyonunu ölçmek ve optimal Cas9 konsantrasyonunu belirlemek için 40 mikrogram protein ile batı lekesi analizi yapın. Kağıt üzerinde, tüm mikro RNA kümesini, çeşitli kümelenmiş mikro RNA gen kombinasyonlarını ve bireysel mikro RNA küme üyelerini hedefleyen 24 kuyucuklu bir plakanın her bir kuyucuğuna dönüştürülecek beş asal ve üç asal CRISPR RNA çifti kombinasyonunu haritalandırın. Lenti'yi indüklenebilir plaka, optimize edilmiş dox konsantrasyonunu içeren tercih edilen ortamda, 24 kuyucuklu bir plakanın kuyusu başına dördüncü hücrelere beş kez 10 kat dokuz hücre çizgisi döker.Cas9 protein ekspresyonunu indüklemek için hücreleri 37 santigrat derecede,% 5 karbondioksitte 24 ila 48 saat büyütün. Lenti ile indüklenebilir Cas9 hücrelerini hazırlanmış beş asal ve üç asal kılavuz RNA ile transfekte edin. Hedeflenen mikro RNA lokusu başına dört adet 1,5 mililitrelik mikro santrifüj tüpünü etiketleyin.Her tüpte, iki mikromolar kılavuz RNA kompleksini oluşturmak için izleyici RNA'nın bir ila bir molar oranını ve benzersiz CRISPR RNA'larını karıştırın. 1,5 mililitrelik santrifüj tüpüne 2,5 mikrolitre izleyici RNA, beş asal konumlandırılmış CRISPR RNA'nın 1,25 mikrolitresi, üç asal konumlandırılmış CRISPR RNA'nın 1,25 mikrolitresi ve beş mikrolitre 10 milimolar tris hcl pH 7,5 tamponu ekleyin. Mikro santrifüjü 30 saniye boyunca 16.000 kez G'de karıştırın.Oda sıcaklığında beş dakika inkübe edin. Her tüpe 40 mikrolitre indirgenmiş serum ortamı, 10 mikrolitre kılavuz RNA kompleks reaksiyonuna. Yukarı ve aşağı pipetle çekerek hafifçe karıştırın.Temiz bir 1,5 mililitrelik santrifüj tüpünde, iki mikrolitre transfeksiyon reaktifi ve 48 mikrolitre azaltılmış serum ortamı, yukarı ve aşağı pipetleme ile nazikçe karıştırılır. Oda sıcaklığında beş dakika inkübe edin. 50 mikrolitre kılavuz RNA karışımını içeren her tüpe, seyreltilmiş transfeksiyon reaktifinin 50 mikrolitresini ekleyin.Pipetle karışımı karıştırmak için yavaşça yukarı ve aşağı bir kez yukarı ve aşağı doğru karıştırın. Oda sıcaklığında 20 dakika inkübe edin. Kılavuz RNA transfeksiyon karışımının 100 mikrolitresini içeren her tüpe doksisiklin takviyeli 400 mikrolitre antibiyotiksiz ortam ekleyin.Pipetleri nazikçe karıştırın. Ortamı doksisiklin ile indüklenen lenti indüklenebilir Cas9 hücrelerinden çıkarın. 24 kuyu plakası deney haritasına dayanarak 500 mikrolitre medya doksisiklin kılavuz RNA dönüşüm karışımı ekleyin.Transfekte edilen hücreleri% 5 karbondioksit içinde 37 santigrat derecede 48 saat boyunca inkübe edin. Ortamı doksisiklin içermeyen taze hazırlanmış ortamla değiştirin. Hücrelerin 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksitte 24 ila 48 saat daha iyileşmesine izin verin.Transfekte hücreleri toplayın ve genotipleme ve tek hücre sanrıları için hazırlanın. 150 mikrolitre yeniden askıya alınmış hücreyi üç parçaya ayırın. Transfekte hücrelerin üçte birini orta artı %10 DMSO'yu uzun süreli depolama için kriyo şişelerde dondurun.Transfekte hücrelerin üçte birini, genotipleme için temiz bir 0.2 mililitrelik PCR tüpüne aktarın. Transfekte hücrelerin son üçte birini, tek hücreli koloniler oluşturmak için 96 kuyucuklu bir plaka formatında sayma ve seyreltme için hazırlayın. 12 kanallı çok borulayıcı ve steril bir reaktif haznesi kullanarak, her seyreltme için plakanın iki sırasına kuyu başına 100 mikrolitre seyreltilmiş hücre ekleyin.Hücrelerin tek hücreli koloni genişlemesi için akıcılığa büyümesi için dört ila altı hafta bekleyin. Genotipleme için yaklaşık 10 ila 15 tek hücreli koloni toplayın. Hedeflenen her mikro RNA lokusu için en az üç bağımsız nakavt tek hücreli koloni hattı tanımlayın.Wild tip tek hücreli satırları denetim olarak saklayın. Resuspend, hücre peletini dört mikrolitre beş X DNA polimeraz tamponu, bir mikrolitre proteinaz K, bir mikrolitre RNaz A ve toplam 20 mikrolitre hacme kadar nükleaz içermeyen suda askıya aldı. Termo siklikçideki hücreleri 30 dakika boyunca 56 santigrat derecede ve beş dakika boyunca 96 santigrat derecede bitirin.PCR genotiplemesine hazır olana kadar hücre lizatlarını eksi 20 santigrat derecede saklayın. Kılavuz RNA beş asal ve üç asal kılavuz RNA hedeflenen bölgeleri çevreleyen tasarlanmış PCR primerlerini kullanarak bir PCR genotipleme reaksiyonu gerçekleştirin. Metin makalesinde belirtilen programı kullanarak PCR reaksiyonunu bir termosikler içinde çalıştırın.PCR ürünlerini elektroforez analizi için% 1 agaroz jeli üzerine yükleyin. Nakavt genotipleri için öngörülen moleküler boyutun izole PCR fragmanlarından DNA çıkarın. DNA dizilimi için örnekleri hazırlayın.CRISPR reaksiyonunun başarılı olduğunu doğrulayın ve Cas9 bölünme bölgesini tanımlamak ve mikro RNA lokus delesyonunu doğrulamak için izole PCR fragmanlarının DNA dizilimini gerçekleştirin. 35 kiloluk bazlar miR-888 küme bölgesinin tamamını hedef alan benzersiz CRISPR RNA'ları tasarlandı. MiR-743 ailesi veya miR-891 ailesi içindeki daha küçük küme kombinasyonları ve mikro RNA delesyonları.PCR reaksiyonlarının jel elektroforez analizi, nakavt genotipini temsil eden öngörülen DNA fragman boyutunun her CRISPR transfeksiyonu için güçlendirildiğini göstermiştir. Tek hücreli koloniler PCR tarafından sırayla genotiplendirildi. Bu izole nakavt PCR fragmanlarının DNA dizilimi, transfekte edilmiş beş asal ve üç asal kılavuz RNA'nın, Cas9 bölünme ligasyonunu PAM bölgelerinin yukarı yönünde yaklaşık üç nükleotid yönettiğini ve hedeflenen mikro RNA lokusunun genomik kaybını doğruladığını doğruladı.MiR-891a nakavt ve vahşi tip hücreleri karşılaştıran WST-1 proliferasyon testleri, mikro RNA taklit lentiviral vektörün aşırı ekspresyonunun prostat hücresi büyümesini indüklediğini doğrulamaktadır ve bu nedenle miR-891 kaybının karşılıklı etkiler göstereceği tahmin edilmektedir. Dikkatli kılavuz RNA tasarımının yanı sıra, her bir mikro RNA nakavt hattından hızlı bir şekilde tek hücre kolonileri oluşturmak önemlidir. Mikro RNA nakavt hücrelerinin canlılık büyümesini azaltması ve vahşi tip hücrelere sahip karışık popülasyonlarda kolayca rekabet edebilmesi özellikle önemlidir.Kantitatif gerçek zamanlı PCR, kuzey lekesi ve RNA dizilimi gibi ek yöntemler, CRISPR nakavt hücre hatlarının silinen lokus için olgun mikro RNA'yı ifade etmediğini doğrulamak için yapılmalıdır.

Research

JoVE Journal

Biology

Microarray Analysis for Saccharomyces cerevisiae

Microarray Analysis for Saccharomyces cerevisiae

Mikroarray Analizi için Saccharomyces cerevisiae</em

In this protocol, gene expression in yeast (Saccharomyces cerevisiae) is changed after exposure to oxidative stress induced by the addition of hydrogen ...

Using SecM Arrest Sequence as a Tool to Isolate Ribosome Bound Polypeptides

Ribozom Ciltli Polipeptitler izole bir aracı olarak SECM Tutuklanma sırası kullanılarak

Extensive research has provided ample evidences suggesting that protein folding in the cell is a co-translational process1-5. However, the exact pathway ...

Analysis of Autophagy in Penicillium chrysogenum by Using Starvation Pads in Combination With Fluorescence Microscopy

Analysis of Autophagy in Penicillium chrysogenum by Using Starvation Pads in Combination With Fluorescence Microscopy

Otofaji Analiz<em&gt; Penicillium chrysogenum</em&gt; Floresan Mikroskopi ile Kombinasyon Açlık Pedleri kullanarak

The study of cellular quality control systems has emerged as a highly dynamic and relevant field of contemporary research. It has become clear that cells ...

Silencing the Spark: CRISPR/Cas9 Genome Editing in Weakly Electric Fish

Kıvılcım Susturma: CRISPR/Cas9 Zayıf Elektrikli Balıklarda Genom Düzenleme

Electroreception and electrogenesis have changed in the evolutionary history of vertebrates. There is a striking degree of convergence in these ...

Pupal and Adult Injections for RNAi and CRISPR Gene Editing in Nasonia vitripennis

Pupal and Adult Injections for RNAi and CRISPR Gene Editing in Nasonia vitripennis

Nasonia vitripennis'te RNAi ve CRISPR Gen Düzenleme için Pupal ve Yetişkin Enjeksiyonları

The jewel wasp, Nasonia vitripennis, has become an efficient model system to study epigenetics of haplo-diploid sex determination, B-chromosome biology, ...

TGF-&#946;-mediated Endothelial to Mesenchymal Transition (EndMT) and the Functional Assessment of EndMT Effectors using CRISPR/Cas9 Gene Editing

TGF-ÃƒÅ½Ã‚Â²-mediated Endothelial to Mesenchymal Transition EndMT and the Functional Assessment of EndMT Effectors using CRISPR/Cas9 Gene Editing

TGF-β aracılı Endotelden Mezenkimal Geçişe (EndMT) ve CRISPR/Cas9 Gen Düzenleme Kullanarak EndMT Efektörlerinin Fonksiyonel Değerlendirmesi

In response to specific external cues and the activation of certain transcription factors, endothelial cells can differentiate into a mesenchymal-like ...

In Vitro Analysis of E3 Ubiquitin Ligase Function

In Vitro Analysis of E3 Ubiquitin Ligase Function

In Vitro E3 Ubiquitin Ligase fonksiyonunun analizi

The covalent attachment of ubiquitin (Ub) to internal lysine residue(s) of a substrate protein, a process termed ubiquitylation, represents one of the ...

CRISPR/Cas9 Gene Editing of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells for Gene Therapy Applications

CRISPR/Cas9 Gen Tedavisi Uygulamaları için Hematopoetik Kök ve Progenitör Hücrelerin Gen Düzenlemesi

CRISPR/Cas9 is a highly versatile and efficient gene-editing tool adopted widely to correct various genetic mutations. The feasibility of gene ...

Embryo Injection Technique for Gene Editing in the Black-Legged Tick, Ixodes scapularis

Embryo Injection Technique for Gene Editing in the Black-Legged Tick, Ixodes scapularis

Siyah Ayaklı Kene Gen Düzenleme için Embriyo Enjeksiyon Tekniği, Ixodes scapularis

Ticks can transmit various viral, bacterial, and protozoan pathogens and are therefore considered vectors of medical and veterinary importance. Despite ...

Protocols for CRISPR/Cas9 Mutagenesis of the Oriental Fruit Fly Bactrocera dorsalis

Protocols for CRISPR/Cas9 Mutagenesis of the Oriental Fruit Fly Bactrocera dorsalis

CRISPR / Cas9 Oryantal Meyve Sineği Bactrocera dorsalis'in mutagenezi için protokoller

The Oriental fruit fly, Bactrocera dorsalis, is a highly invasive and adaptive pest species that causes damage to citrus and over 150 other fruit crops ...