Denne protokol adresserer nogle nøgleproblemer, der findes i organoidgenerering som robusthed og pålidelighed, og vi var i stand til at anvende disse forbedrede organoider til innovativ forskning i neuronal aldring. Heterogenitet og reproducerbarhed er væsentlige problemer ved generering af kortikale hjerneorganoider. For at overvinde disse differentierer vi først hPSC'er til neuroektodermale kolonier og derefter neuroepitel-sfæroider, som genererer reproducerbar vævsarkitektur.
Disse kortikale hjerneorganoider begynder at udvise typiske tegn på ældning efter en langvarig in vitro-kultur, hvilket gør dem til en nyttig platform til at studere aldringsrelaterede neuronale processer. Til at begynde med skal du plade hPSC-kolonierne på en hESC-kvalificeret kældermembranmatrix fra en brønd af en seks brøndplade ved 60% sammenløb i tre brønde for at opnå 20 til 30% densitet og derefter fortsætte med induktion af 2D neuroektodermale kolonier. Tilsæt frisk N2-medium suppleret med dobbelte SMAD-hæmmere dagligt til hver brønd i de næste tre dage.
For at generere 3D neuroektodermale sfæroider fra inducerede 2D neuroektodermale kolonier skal du fjerne to milliliter N2-medium fra seks brøndpladen og vaske en gang med HBSS for at sikre, at hele N2-mediet fjernes. Tilsæt en milliliter dispase til hver koloni, der indeholder godt. Inkuber pladen i 20 til 25 minutter ved 37 grader Celsius og kontroller regelmæssigt for koloniafmontering.
Ved afslutningen af inkubationen tilsættes en milliliter N2-medium til brønden for at stoppe aktiviteten af dispaseenzymet. Brug en bredboret P1000 pipettespids eller en modificeret P1000 pipettespids skåret med steril saks, overfør kolonierne til et 15 ml rør og lad koloniklumperne synke til bunden af røret med tyngdekraften. Fjern derefter supernatanten forsigtigt med en standard P1000 pipettespids.
Udskift det med en milliliter frisk N2-medium og gentag vask tre gange for at sikre fuldstændig fjernelse af dispase. Efter genoplivning af celleklumperne og N2-mediet overføres cellesuspensionen til en brønd af en seks brøndplade og tilsættes 40 nanogram pr. Milliliter bFGF. Efter kryosektion af organoiderne fjernes overskydende monteringsopløsning ved at overføre diasene til en glidefarvningsbeholder med låg og vaske det sektionsdelte organoidvæv tre gange med PBS i 10 minutter ved stuetemperatur.
Inkuber derefter diasene natten over ved 37 grader Celsius med frisklavet beta-galactosidase-farvningsopløsning. Det farvede væv vaskes tre gange med PBS i 10 minutter hver ved stuetemperatur for at fjerne beta-galactosidaseopløsningen. Monter nu det vaskede væv med et glasantifademonteringsmiddel, og lad monteringsopløsningen størkne i 30 minutter ved stuetemperatur, før du ser den under mikroskopet.
Før neuroektodermal differentiering viste hPSC-kolonierne en stram flad monolagsmorfologi uden differentierede celler, der forurenede kolonierne. Udtrykket af NANOG bekræftede også pluripotensen af hPSC-kolonierne. Efter differentiering af hPSC-kolonier i neuroektodermale kolonier blev der observeret en længere søjleformet morfologi, og de var negative for NANOG.
Efter dispasebehandling og eksponering for FGF2 i N2 prolifererede de neurale stamceller i disse sfæroider og dannede et betydeligt antal neurale rosetter, der demonstrerede sfæroidens apikale-basale polaritet ved ekspression af Z01 i cellerne i midten og den ydre kant af sfæroiden. Når den er indlejret, spredes sfæroidet hurtigt og begynder at spire, indikeret ved tilstedeværelsen af de kompakte vævsknuder og deres ekspansion udad fra hovedlegemet mellem en til tre uger, hvilket yderligere blev bekræftet ved kvantitativ analyse, og sfæroiddiameteren steg signifikant over tre uger. Immunofluorescensfarvningen bekræftede tilstedeværelsen af neuroprogenitorceller og kortikale lagmarkører i organoiderne med klar lagdeling, som kunne observeres på tværs af forskellige tidspunkter.
Effekten af neuronale aldringsrelaterede processer på hjernen blev også undersøgt. Med tiden blev der observeret en signifikant stigning i tilstedeværelsen af ældningsassocieret beta-galactosidase, og i uge 13 blev tilstedeværelsen af p21 påvist, hvilket indikerer ældning. Det er vigtigt at sikre, at al overskydende dispase fjernes, og at du forsigtigt løsner og gensåede de intakte neuroektodermale kolonier for at danne sunde sfæroider.
Denne platform for vores unikke mulighed for at studere biologien i en menneskelig hjerne aldring, det tillader også en forskning i kritisk hjerneudvikling, forudsat at denne organoider dyrkes ved hjælp af en bioreaktor.
