Dit protocol behandelt een aantal belangrijke kwesties die bestaan in organoïdegeneratie, zoals robuustheid en betrouwbaarheid, en we waren in staat om deze verbeterde organoïden toe te passen op innovatief onderzoek naar neuronale veroudering. Heterogeniteit en reproduceerbaarheid zijn belangrijke problemen bij het genereren van corticale hersenorganoïden. Om deze te ondervangen, differentiëren we eerst hPSC's in neuro-ectodermale kolonies en vervolgens neuro-epitheliale sferoïden, die reproduceerbare weefselarchitectuur genereren.
Deze corticale hersenorganoïden beginnen typische tekenen van senescentie te vertonen na een langdurige in vitro cultuur, waardoor ze een nuttig platform zijn voor het bestuderen van verouderingsgerelateerde neuronale processen. Om te beginnen, plaats de hPSC-kolonies op een hESC-gekwalificeerde keldermembraanmatrix van één put van een zes putplaat bij 60% samenvloeiing in drie putten om 20 tot 30% dichtheid te bereiken en ga vervolgens verder met inductie van 2D neuro-ectodermale kolonies. Voeg de komende drie dagen dagelijks vers N2-medium aangevuld met dubbele SMAD-remmers toe aan elke put.
Voor het genereren van 3D neuro-neuro-ectodermale sferoïden uit geïnduceerde 2D neuro-ectodermale kolonies, verwijdert u twee milliliter N2-medium uit de zes putplaat en wast u één keer met HBSS om ervoor te zorgen dat alle N2-medium wordt verwijderd. Voeg een milliliter dispase toe aan elke kolonie die goed bevat. Incubeer de plaat gedurende 20 tot 25 minuten bij 37 graden Celsius en controleer regelmatig op kolonieloslating.
Voeg aan het einde van de incubatie, om de activiteit van het dispase-enzym te stoppen, een milliliter N2-medium toe aan de put. Gebruik een P1000-pipetpunt met brede boring of een gemodificeerde P1000-pipetpunt die met een steriele schaar is gesneden, breng de kolonies over in een buis van 15 milliliter en laat de kolonieklonten met de zwaartekracht naar de bodem van de buis zinken. Verwijder vervolgens met een standaard P1000 pipetpunt voorzichtig het supernatant.
Vervang het door een milliliter vers N2-medium en herhaal het wassen driemaal om volledige verwijdering van dispase te garanderen. Breng na het resuspenderen van de celklonten en het N2-medium de celsuspensie over naar een put van een zes putplaat en voeg 40 nanogram per milliliter bFGF toe. Verwijder na cryosectie van de organoïden de overtollige montageoplossing door de dia's over te brengen in een schuifkleuringscontainer met een deksel en was het doorgesneden organoïde weefsel drie keer met PBS gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur.
Incubeer vervolgens de dia's 's nachts bij 37 graden Celsius met vers gemaakte bèta-galactosidase-kleuringsoplossing. Was de gekleurde weefsels drie keer met PBS gedurende 10 minuten elk bij kamertemperatuur om de bèta-galactosidase-oplossing te verwijderen. Monteer nu de gewassen weefsels met een glazen antifade mountant en laat de montageoplossing 30 minuten stollen bij kamertemperatuur voordat u het onder de microscoop bekijkt.
Vóór neuro-ectodermale differentiatie vertoonden de hPSC-kolonies een strakke platte monolaagmorfologie zonder gedifferentieerde cellen die de kolonies besmetten. De expressie van NANOG bevestigde ook de pluripotentie van de hPSC-kolonies. Na differentiatie van hPSC-kolonies in neuro-ectodermale kolonies werd een langere kolomvormige morfologie waargenomen en deze waren negatief voor NANOG.
Na dispase behandeling en blootstelling aan FGF2 in de N2, prolifereerden de neurale stamcellen in deze sferoïden en vormden een aanzienlijk aantal neurale rozetten die de apicale-basale polariteit van de sferoïde aantoonden door expressie van Z01 in de cellen in het midden en de buitenrand van de sferoïde. Eenmaal ingebed, woekert de sferoïde snel en begint te ontluiken, aangegeven door de aanwezigheid van de compacte weefselknopen en hun expansie naar buiten vanuit het hoofdlichaam tussen één tot drie weken, wat verder werd bevestigd door kwantitatieve analyse en de sferoïde diameter aanzienlijk toegenomen gedurende drie weken. De immunofluorescentiekleuring bevestigde de aanwezigheid van neurovoorlopercellen en corticale laagmarkers in de organoïden met duidelijke gelaagdheid, die op verschillende tijdstippen waarneembaar was.
Het effect van neuronale verouderingsgerelateerde processen op de hersenen werd ook bestudeerd. Na verloop van tijd werd een significante toename van de aanwezigheid van senescentie geassocieerd beta-galactosidase waargenomen en in week 13 werd de aanwezigheid van p21 gedetecteerd, wat wijst op senescentie. Het is belangrijk om ervoor te zorgen dat alle overtollige dispase wordt verwijderd en dat u de intacte neuro-ctodermale kolonies voorzichtig losmaakt en opnieuw inzaait om gezonde sferoïden te vormen.
Dit platform van onze unieke kans om de biologie van een menselijke hersenveroudering te bestuderen, maakt ook een onderzoek naar kritische hersenontwikkeling mogelijk, op voorwaarde dat deze organoïden worden gekweekt met behulp van een bioreactor.
