このプロトコルは、堅牢性や信頼性などオルガノイド生成に存在するいくつかの重要な問題に対処し、これらの改良されたオルガノイドをニューロンの老化に関する革新的な研究に適用することができました。不均一性と再現性は、皮質脳オルガノイドを生成する際の重要な問題です。これらを克服するために、我々はまずhPSCを神経外胚葉性コロニーに分化し、次に神経上皮スフェロイドを分化させ、再現性のある組織構造を生成する。
これらの皮質脳オルガノイドは、長期間のインビトロ培養後に老化の典型的な徴候を示し始め、老化に関連するニューロンプロセスを研究するための有用なプラットフォームとなる。まず、hESC修飾基底膜マトリックス上のhPSCコロニーを60%コンフルエンシーの6ウェルプレートの1ウェルから3ウェルにプレートして20~30%密度を達成し、次に2D神経外胚葉性コロニーの誘導を続行します。デュアルSMAD阻害剤を毎日補充した新鮮なN2培地を各ウェルに次の3日間加えます。
誘導された2D神経外胚葉性コロニーから3D神経外胚葉性スフェロイドを生成するには、6ウェルプレートから2ミリリットルのN2培地を取り出し、HBSSで1回洗浄して、すべてのN2培地が除去されるようにします。ウェルを含む各コロニーに1ミリリットルのディスパーゼを加える。プレートを摂氏37度で20〜25分間インキュベートし、コロニーの剥離を定期的に確認します。
インキュベーションの終わりに、ディスパーゼ酵素の活性を停止させるために、1ミリリットルのN2培地をウェルに加える。広口径のP1000ピペットチップまたは滅菌はさみで切断した修正P1000ピペットチップを使用して、コロニーを15ミリリットルのチューブに移し、コロニーの塊が重力でチューブの底に沈むようにします。次に、標準的なP1000ピペットチップを用いて、上清を慎重に除去する。
1ミリリットルの新鮮なN2培地と交換し、洗浄を3回繰り返して、ディスパーゼを完全に除去します。細胞凝集塊およびN2培地を再懸濁した後、細胞懸濁液を6ウェルプレートの1ウェルに移し、1ミリリットル当たり40ナノグラムのbFGFを加える。オルガノイドを凍結切片した後、スライドを蓋付きのスライド染色容器に移して余分な装着液を取り出し、切片化したオルガノイド組織をPBSで室温で10分間3回洗浄した。
その後、スライドを摂氏37度で一晩インキュベートし、作りたてのβ-ガラクトシダーゼ染色溶液でインキュベートします。染色した組織をPBSで3回、室温でそれぞれ10分間洗浄し、β-ガラクトシダーゼ溶液を除去した。次に、洗浄した組織をガラスの退色防止マウント剤でマウントし、マウント溶液を室温で30分間固化させてから顕微鏡で見ることができます。
神経外胚葉分化の前に、hPSCコロニーは、分化した細胞がコロニーを汚染することなくタイトな平坦な単層形態を示した。NANOGの発現はまた、hPSCコロニーの多能性を確認した。hPSCコロニーを神経外胚葉性コロニーに分化させた後、より長い柱状形態の形態が観察され、それらはNANOGに対して陰性であった。
ディスパーゼ処理およびN2中のFGF2への曝露の後、これらのスフェロイドの神経幹細胞は増殖し、スフェロイドの中心および外縁の細胞におけるZ01の発現によってスフェロイドの頂端 - 基底極性を実証するかなりの数の神経ロゼットを形成した。一旦埋め込まれると、スフェロイドは急速に増殖し、出芽を開始し、コンパクトな組織節の存在およびそれらが1〜3週間の間に本体から外側に拡大することによって示され、これは定量分析によってさらに確認され、スフェロイド直径は3週間にわたって有意に増加した。免疫蛍光染色では、オルガノイド中の神経前駆細胞および皮質層マーカーの存在が明確な層状で確認され、異なる時点にわたって観察可能であった。
神経細胞老化関連プロセスが脳に及ぼす影響も研究された。時間が経つにつれて、老化に関連するβ-ガラクトシダーゼの存在の有意な増加が観察され、13週目に、老化を示すp21の存在が検出された。余分なディスパーゼをすべて除去し、無傷の神経外胚葉性コロニーを穏やかに剥離して再播種して健康なスフェロイドを形成することが重要です。
人間の脳の老化の生物学を研究する私たちのユニークな機会のこのプラットフォームは、それはまた、このオルガノイドがバイオリアクターを使用して培養されている限り、重要な脳の発達に関する研究を可能にします。
