Этот протокол решает некоторые ключевые проблемы, существующие в генерации органоидов, такие как прочность и надежность, и мы смогли применить эти улучшенные органоиды к инновационным исследованиям старения нейронов. Гетерогенность и воспроизводимость являются существенными проблемами при генерации органоидов кортикального мозга. Чтобы преодолеть их, мы сначала дифференцируем hPSC в нейроэктодермальные колонии, а затем в нейроэпителиальные сфероиды, которые генерируют воспроизводимую тканевую архитектуру.
Эти кортикальные органоиды головного мозга начинают проявлять типичные признаки старения после длительной культуры in vitro, что делает их полезной платформой для изучения нейронных процессов, связанных со старением. Для начала разложите колонии hPSC на матрице базальной мембраны, сертифицированной hESC, из одной лунки из шестилуночной пластины при 60% слиянии в три скважины для достижения плотности от 20 до 30%, а затем приступайте к индукции 2D нейроэктодермальных колоний. Добавляйте свежую среду N2, дополненную двумя ингибиторами SMAD, ежедневно в каждую лунку в течение следующих трех дней.
Для получения 3D-нейроэктодермальных сфероидов из индуцированных 2D нейроэктодермальных колоний удалите два миллилитра среды N2 из пластины шести лунок и промыть один раз HBSS, чтобы убедиться, что вся среда N2 удалена. Добавьте один миллилитр диспазы к каждой колонии, содержащей хорошо. Инкубируйте пластину в течение 20-25 минут при температуре 37 градусов по Цельсию и регулярно проверяйте наличие колонии.
В конце инкубации, чтобы остановить активность фермента диспазы, добавляют в лунку один миллилитр среды N2. Используя широкоствольный наконечник пипетки P1000 или модифицированный наконечник пипетки P1000, разрезанный стерильными ножницами, переместите колонии в 15-миллилитровую трубку и позвольте колониальным комкам опуститься на дно трубки с гравитацией. Затем стандартным наконечником пипетки P1000 аккуратно удалите супернатант.
Замените его одним миллилитром свежей среды N2 и повторите промывку трижды, чтобы обеспечить полное удаление диспазы. После повторного использования клеточных сгустков и среды N2 перенесите клеточную суспензию в одну лунку из шестилуночной пластины и добавьте 40 нанограммов на миллилитр bFGF. После криосекции органоидов удалите лишний монтажный раствор, перенеся слайды в контейнер для окрашивания слайдов с крышкой и трижды промыть разрезанную органоидную ткань PBS в течение 10 минут при комнатной температуре.
Затем инкубируйте слайды в течение ночи при температуре 37 градусов Цельсия со свежеприготовленным раствором для окрашивания бета-галактозидазой. Промыть окрашенные салфетки три раза PBS в течение 10 минут каждый при комнатной температуре, чтобы удалить раствор бета-галактозидазы. Теперь установите промытые салфетки со стеклянным антизатухающим креплением и дайте монтажному раствору затвердеть в течение 30 минут при комнатной температуре, прежде чем рассматривать его под микроскопом.
До нейроэктодермальной дифференцировки колонии hPSC демонстрировали плотную плоскую монослойную морфологию без дифференцированных клеток, загрязняющих колонии. Экспрессия NANOG также подтвердила плюрипотентность колоний hPSC. После дифференцировки колоний hPSC в нейроэктодермальные колонии наблюдалась более длинная колоновидная морфология, и они были отрицательными для NANOG.
После диспазного лечения и воздействия FGF2 в N2 нервные стволовые клетки в этих сфероидах размножались и образовывали значительное количество нейронных розеток, которые демонстрировали апикально-базальную полярность сфероида путем экспрессии Z01 в клетках в центре и на внешнем краю сфероида. После внедрения сфероид быстро размножается и начинает почковаться, о чем свидетельствует наличие компактных тканевых узлов и их расширение наружу от основного тела между одной-тремя неделями, что было дополнительно подтверждено количественным анализом, и диаметр сфероида значительно увеличился за три недели. Иммунофлуоресцентное окрашивание подтвердило наличие нейропрогодно-клеточных клеток и маркеров кортикального слоя в органоидах с четким наслоением, которое наблюдалось в разных временных точках.
Также изучалось влияние процессов, связанных со старением нейронов, на мозг. Со временем наблюдалось значительное увеличение наличия связанной со старением бета-галактозидазы и на 13 неделе было обнаружено наличие р21, что свидетельствует о старении. Важно убедиться, что все избыточные диспазы удалены и что вы аккуратно отделяете и пересеиваете неповрежденные нейроэктодермальные колонии, чтобы сформировать здоровые сфероиды.
Эта платформа нашей уникальной возможности изучать биологию старения человеческого мозга, она также позволяет проводить исследования по критическому развитию мозга при условии, что эти органоиды культивируются с помощью биореактора.
