Detta protokoll behandlar några viktiga frågor som finns i organoidgenerering som robusthet och tillförlitlighet, och vi kunde tillämpa dessa förbättrade organoider på innovativ forskning om neuronal åldrande. Heterogenitet och reproducerbarhet är viktiga problem när man genererar kortikala hjärnorganoider. För att övervinna dessa differentierar vi först hPSCs i neuroektodermala kolonier och sedan neuroepitelsfäroider, som genererar reproducerbar vävnadsarkitektur.
Dessa kortikala hjärnorganoider börjar uppvisa typiska tecken på åldrande efter en långvarig in vitro-kultur, vilket gör dem till en användbar plattform för att studera åldrande relaterade neuronala processer. Till att börja med, platta hPSC-kolonierna på en hESC-kvalificerad källarmembranmatris från en brunn av en sexbrunnsplatta vid 60% sammanflöde i tre brunnar för att uppnå 20 till 30% densitet och fortsätt sedan med induktion av 2D-neuroektodermala kolonier. Tillsätt färskt N2-medium kompletterat med dubbla SMAD-hämmare dagligen till varje brunn under de kommande tre dagarna.
För att generera 3D-neuroektodermala sfäroider från inducerade 2D-neuroektodermala kolonier, ta bort två milliliter N2-medium från sexbrunnsplattan och tvätta en gång med HBSS för att säkerställa att hela N2-mediet tas bort. Tillsätt en milliliter dispas till varje koloni som innehåller väl. Inkubera plattan i 20 till 25 minuter vid 37 grader Celsius och kontrollera om det finns koloniavlossning regelbundet.
Vid slutet av inkubationen, för att stoppa aktiviteten hos dispasenzymet, tillsätt en milliliter N2-medium till brunnen. Använd en bredborrad P1000-pipettspets eller en modifierad P1000-pipettspets skuren med steril sax, överför kolonierna till ett 15 ml rör och låt koloniklumparna sjunka till botten av röret med tyngdkraften. Ta sedan bort supernatanten med en vanlig P1000-pipettspets.
Byt ut den med en milliliter färskt N2-medium och upprepa tvättningen tre gånger för att säkerställa fullständigt avlägsnande av dispas. Efter att ha återsusperat cellklumparna och N2-mediet, överför cellsuspensionen till en brunn av en sexbrunnsplatta och tillsätt 40 nanogram per milliliter bFGF. Efter kryosektion av organoiderna, ta bort överskottsmonteringslösningen genom att överföra bilderna till en glidfärgningsbehållare med lock och tvätta den sektionerade organoidvävnaden tre gånger med PBS i 10 minuter vid rumstemperatur.
Inkubera sedan bilderna över natten vid 37 grader Celsius med nygjord beta-galaktosidasfärgningslösning. Tvätta de färgade vävnaderna tre gånger med PBS i 10 minuter vardera vid rumstemperatur för att avlägsna beta-galaktosidaslösningen. Montera nu de tvättade vävnaderna med ett glas antifade-monteringsmedel och låt monteringslösningen stelna i 30 minuter vid rumstemperatur innan du tittar på den under mikroskopet.
Innan neuroektodermal differentiering visade hPSC-kolonierna en tät platt monolagermorfologi utan differentierade celler som förorenade kolonierna. Uttrycket av NANOG bekräftade också pluripotensen hos hPSC-kolonierna. Efter differentiering av hPSC-kolonier i neuroektodermala kolonier observerades en längre kolumnformad morfologi, och de var negativa för NANOG.
Efter dispasbehandling och exponering för FGF2 i N2 spred sig de neurala stamcellerna i dessa sfäroider och bildade ett betydande antal neurala rosetter som visade sfäroidens apikal-basala polaritet genom uttryck av Z01 i cellerna i mitten och sfäroidens ytterkant. När den väl är inbäddad sprider sig sfäroiden snabbt och börjar spira, vilket indikeras av närvaron av de kompakta vävnadsnoderna och deras expansion utåt från huvudkroppen mellan en till tre veckor, vilket ytterligare bekräftades genom kvantitativ analys och sfäroiddiametern ökade signifikant under tre veckor. Immunofluorescensfärgningen bekräftade närvaron av neuroprogenitorceller och kortikala skiktmarkörer i organoiderna med tydlig skiktning, vilket var observerbart över olika tidpunkter.
Effekten av neuronala åldrande relaterade processer på hjärnan studerades också. Med tiden observerades en signifikant ökning av närvaron av åldrande associerad beta-galaktosidas och vid vecka 13 detekterades närvaron av p21, vilket indikerar åldrande. Det är viktigt att se till att allt överskott av dispas tas bort och att du försiktigt lossnar och återförsörjer de intakta neuroektodermala kolonierna för att bilda friska sfäroider.
Denna plattform för vår unika möjlighet att studera biologin hos en mänsklig hjärnas åldrande, det möjliggör också en forskning om kritisk hjärnutveckling, förutsatt att dessa organoider odlas med hjälp av en bioreaktor.
