Name: identification of rna fragments resulting from enzymatic degradation using maldi-tof mass spectrometry
Uploaded: 2022-04-11T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Identification of RNA Fragments Resulting from Enzymatic Degradation using MALDI-TOF Mass Spectrometry at JoVE.com

ومن المهم ملاحظة أن هذا العمل كان جهدا تعاونيا بين ثلاث مؤسسات، ومجموعتين بحثيتين، ومرفق أساسي واحد. تم تنفيذ التوزيع وعبء العمل على النحو التالي: تم تنفيذ تعبير البروتين (Xrn-1) في جامعة دنفر (دنفر ، كولورادو). تم إجراء توليف أوليغونوكليوتيدات ، وتحديد كمي ، وتجريب (التحلل الأنزيمي بشكل رئيسي) في جامعة كولورادو دنفر (دنفر ، كولورادو). كما تم تنفيذ التحسين هناك. تم إجراء اكتشاف MALDI-TOF واقتنائه وتحليله في المرفق الأساسي للموارد التحليلية في جامعة ولاية كولورادو. (فورت كولينز ، كولورادو). تود SS أن تعترف بجائزة UROP (CU Denver) ومنح Eureca (CU Denver) للدعم. يقر E. G.C. بالدعم المقدم من NIGMS ، عبر R00GM115757. تقر MJER بالدعم المقدم من NIGMS ، عبر 1R15GM132816. K.B. يقر بمعرف المورد: SCR_021758. تم دعم العمل أيضا من قبل جائزة المعلم والباحث (MJER) ، TH-21-028 ، من مؤسسة هنري دريفوس.

تم استخدام المياه فائقة النقاء الخالية من RNase (الجدول 1) لهذه الدراسة.
1. تحديد تركيز محلول الحمض النووي الريبي
<ol><li>قم بإعداد عينة الحمض النووي الريبي باتباع الخطوات أدناه.<ol>
<li>استخدم أنبوب الطرد المركزي الدقيق (0.6 مل) لإعداد محلول من الحمض النووي الريبي عن...

<ol>
	<li>Tanaka, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+and+polymer+analyses+up+to+m/z+100+000+by+laser+ionization+time-of-flight+mass+spectrometry.">Protein and polymer analyses up to m/z 100 000 by laser ionization time-of-flight mass spectrometry.</a> Rapid Communications in Mass Spectrometry. 2 (8), 151-153 (1988).</li><li>Karas, M., Hillenkamp, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+desorption+ionization+of+proteins+with+molecular+masses+exceeding+10,000+daltons.">Laser desorption ionization of proteins with molecular masses exceeding 10,000 daltons.</a> Analytical Chemistry. 60 (20), 2299-2301 (1988).</li><li>Zenobi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemistry+nobel+prize+2002+goes+to+analytical+chemistry.">Chemistry nobel prize 2002 goes to analytical chemistry.</a> Chimia. 57, 73 (2003).</li><li>Aristri, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bio-based+polyurethane+resins+derived+from+tannin:+Source,+synthesis,+characterization,+and+application.">Bio-based polyurethane resins derived from tannin: Source, synthesis, characterization, and application.</a> Forests. 12 (11), 1516 (2021).</li><li>Pedrazzani, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=5-n-Alkylresorcinol+profiles+in+different+cultivars+of+einkorn,+emmer+spelt,+common+wheat,+and+tritordeum.">5-n-Alkylresorcinol profiles in different cultivars of einkorn, emmer spelt, common wheat, and tritordeum.</a> Journal of Agricultural and Food Chemistry. 69 (47), 14092-14102 (2021).</li><li>Unger, M. S., Blank, M., Enzlein, T., Hopf, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Label-free+cell+assays+to+determine+compound+uptake+or+drug+action+using+MALDI-TOF+mass+spectrometry.">Label-free cell assays to determine compound uptake or drug action using MALDI-TOF mass spectrometry.</a> Nature Protocols. 16 (12), 5533-5558 (2021).</li><li>Croxatto, A., Prod'hom, G., Greub, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Applications+of+MALDI-TOF+mass+spectrometry+in+clinical+diagnostic+microbiology.">Applications of MALDI-TOF mass spectrometry in clinical diagnostic microbiology.</a> FEMS Microbiology Reviews. 36 (2), 380-407 (2012).</li><li>Kaufmann, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Marrix-assisted+laser+desorption+ionization+(MALDI)+mass+spectrometry:+a+novel+analytical+tool+in+molecular+biology+and+biotechnology.">Marrix-assisted laser desorption ionization (MALDI) mass spectrometry: a novel analytical tool in molecular biology and biotechnology.</a> Journal of Biotechnology. 41 (2-3), 155-175 (1995).</li><li>Kiggins, C., Skinner, A., Resendiz, M. J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=8-Oxo-7,8-dihydroguanosine+inhibits+or+changes+the+selectivity+of+the+theophylline+aptamer.">8-Oxo-7,8-dihydroguanosine inhibits or changes the selectivity of the theophylline aptamer.</a> ChemBioChem. 21 (9), 1347-1355 (2020).</li><li>Chapman, E. G., DeRose, V. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzymatic+processing+of+platinated+RNAs.">Enzymatic processing of platinated RNAs.</a> Journal of the American Chemical Society. 132 (6), 1946-1952 (2010).</li><li>Resendiz, M. J. E., Pottiboyina, V., Sevilla, M. D., Greengerg, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+strand+scission+in+double+stranded+RNA+via+a+C5-pyrimidine+radical.">Direct strand scission in double stranded RNA via a C5-pyrimidine radical.</a> Journal of the American Chemical Society. 134 (8), 3917-3924 (2012).</li><li>Joyner, J. C., Keuper, K. D., Cowan, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+RNA+cleavage+by+MALDI-TOF+mass+spectrometry.">Analysis of RNA cleavage by MALDI-TOF mass spectrometry.</a> Nucleic Acids Research. 41 (1), 2 (2013).</li><li>Ghodke, P. P., Guengerich, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+polymerases+&#951;+and+&#954;+bypass+N2-guanine-O6-alkylguanine+DNA+alkyltransferase+cross-linked+DNA+peptides.">DNA polymerases &#951; and &#954; bypass N2-guanine-O6-alkylguanine DNA alkyltransferase cross-linked DNA peptides.</a> Journal of Biological Chemistry. 297 (4), 101124 (2021).</li><li>JoVE. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=JoVE+Science+Education+Database.+Biochemistry.+MALDI-TOF+Mass+Spectrometry.">JoVE Science Education Database. Biochemistry. MALDI-TOF Mass Spectrometry.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2021).</li><li>Schr&#246;tner, P., Gunzer, F., Sch&#252;ppel, J., Rudolph, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+rare+bacterial+pathogens+by+16S+rRNA+gene+sequencing+and+MALDI-TOF+MS.">Identification of rare bacterial pathogens by 16S rRNA gene sequencing and MALDI-TOF MS.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (113), e53176 (2016).</li><li>Su, K. -. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proofreading+and+DNA+repair+assay+using+single+nucleotide+extension+and+MALDI-TOF+mass+spectrometry+analysis.">Proofreading and DNA repair assay using single nucleotide extension and MALDI-TOF mass spectrometry analysis.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (136), e57862 (2018).</li><li>Fagerquist, C. K., Rojas, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+antibacterial+immunity+proteins+in+Escherichia+coli+using+MALDI-TOF-TOF-MS/MS+and+Top-Down+proteomic+analysis.">Identification of antibacterial immunity proteins in Escherichia coli using MALDI-TOF-TOF-MS/MS and Top-Down proteomic analysis.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (171), e62577 (2021).</li><li>Phillips, C. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Processing+of+RNA+containing+8-Oxo-7,8-dihydroguanosine+(8-oxoG)+by+the+exoribonuclease+Xrn-1.">Processing of RNA containing 8-Oxo-7,8-dihydroguanosine (8-oxoG) by the exoribonuclease Xrn-1.</a> Frontiers in Molecular Biosciences. 8, 780315 (2021).</li><li>Francis, A. J., Resendiz, M. J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protocol+for+the+solid-phase+synthesis+of+oligomers+of+RNA+containing+a+2'-O-thiophenylmethyl+modification+and+characterization+via+circular+dichroism.">Protocol for the solid-phase synthesis of oligomers of RNA containing a 2'-O-thiophenylmethyl modification and characterization via circular dichroism.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (125), e56189 (2017).</li><li>Langeberg, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biochemical+characterization+of+yeast+Xrn1.">Biochemical characterization of yeast Xrn1.</a> Biochemistry. 59 (15), 1493-1507 (2020).</li><li>Stevens, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+and+characterization+of+a+Saccharomyces+cerevisiae+exoribonuclease+which+yields+5'-mononucleotides+by+a+5'+leads+to+3'+mode+of+hydrolysis.">Purification and characterization of a Saccharomyces cerevisiae exoribonuclease which yields 5'-mononucleotides by a 5' leads to 3' mode of hydrolysis.</a> Journal of Biological Chemistry. 255 (7), 3080-3085 (1980).</li><li>Yan, L. L., Simms, C. L., McLoughlin, F., Vierstra, R. D., Zaher, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxidation+and+alkylation+stresses+activate+ribosome-quality+control.">Oxidation and alkylation stresses activate ribosome-quality control.</a> Nature Communications. 10 (1), 5611 (2019).</li><li>Fasnacht, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+23S+rRNA+modification+ho5C2501+benefits+Escherichia+coli+under+oxidative+stress.">Dynamic 23S rRNA modification ho5C2501 benefits Escherichia coli under oxidative stress.</a> Nucleic Acids Research. 50 (1), 473-489 (2022).</li><li>Estevez, M., Valesyan, S., Jora, M., Limbach, P. A., Addepalli, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxidative+damage+to+RNA+is+altered+by+the+presence+of+interacting+proteins+or+modified+nucleosides.">Oxidative damage to RNA is altered by the presence of interacting proteins or modified nucleosides.</a> Frontiers in Molecular Biosciences. 8, 697149 (2021).</li><li>Tomar, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+sequence+modulates+the+efficiency+of+NEIL1-catalyzed+excision+of+the+aflatoxin+B1-induced+formamidopyrimidine+guanine+adduct.">DNA sequence modulates the efficiency of NEIL1-catalyzed excision of the aflatoxin B1-induced formamidopyrimidine guanine adduct.</a> Journal of the American Chemical Society. 34 (3), 901-911 (2021).</li><li>Gaffney, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV-1+env-dependent+cell+killing+by+bifunctional+small-molecule/peptide+conjugates.">HIV-1 env-dependent cell killing by bifunctional small-molecule/peptide conjugates.</a> ACS Chemical Biology. 16 (1), 193-204 (2021).</li><li>Sikorski, E. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+display+of+a+chemoattractant+agonist+on+cancer+cells+activates+the+formyl+peptide+receptor+1+on+immune+cells.">Selective display of a chemoattractant agonist on cancer cells activates the formyl peptide receptor 1 on immune cells.</a> ChemBioChem. , 202100521 (2022).</li><li>Kubo, T., Nishimura, Y., Sato, Y., Yanagihara, K., Seyama, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sixteen+different+types+of+lipid-conjugated+siRNAs+containing+saturated+and+unsaturated+fatty+Acids+and+exhibiting+enhanced+RNAi+potency.">Sixteen different types of lipid-conjugated siRNAs containing saturated and unsaturated fatty Acids and exhibiting enhanced RNAi potency.</a> ACS Chemical Biology. 16 (1), 150-164 (2021).</li></ol>

نشأ التحدي الرئيسي في سير العمل هذا بين الانتهاء من التجارب وإجراء التحليلات الطيفية الكتلية. أجريت التجارب وأكملت في جامعة كولورادو دنفر وشحنت (بين عشية وضحاها) إلى مرافق جامعة ولاية كولورادو. تم الحصول على البيانات عند استلامها ، حسب الراحة. أدت عدة ظروف غير متوقعة إلى تأخيرات زمنية في ا...

MALDI-TOF 1,2,3 هي تقنية تستخدم على نطاق واسع لتوصيف و / أو الكشف عن الجزيئات ذات الأحجام والخصائص المختلفة. وتشمل بعض استخداماته تطبيقات متنوعة مثل الكشف عن العفص من الموارد الطبيعية4 ، وتصوير المستقلبات في الغذاء5 ، واكتشاف أو مراقبة أهداف أو علامات الأدوية الخلوية6 ، والتشخيص السريري7 ، على سبيل المثال لا الحصر. ومما له صلة بهذا العمل استخدام MALDI-TOF مع الحمض النووي أو الحمض النووي الريبي، مع استخدامه على أوليغونوكليوتيدات يعود تاريخها إلى أكثر من ثلاثة عقود8، حيث لوحظت عدة قيود. تطورت هذه التقنية الآن إلى وسيلة موثوقة وشائعة الاستخدام لتوصيف كل من البوليمرات الحيوية9 وتحديد / فهم التفاعلات الكيميائية والكيميائية الحيوية ، على سبيل المثال ، توصيف المواقع المطلية في الحمض النووي الريبي 10 ، وتحديد شظايا الحمض النووي الريبي بعد انقسام الخيط11,12 ، أو تشكيل روابط متقاطعة بين البروتين والحمض النووي13 . وبالتالي ، من المفيد توضيح وتسليط الضوء على الجوانب المهمة لاستخدام هذه التقنية. تم وصف أساسيات MALDI-TOF في شكل فيديو بالإضافة إلى14 ولن يتم تفصيلها بشكل أكبر هنا. علاوة على ذلك ، تم وصف تطبيقه في سياق الحمض النووي أو البروتين سابقا وتوضيحه في الشكل المذكور15،16،17.
بروتوكول الكشف عن شظايا الحمض النووي الريبي التي تشكلت بعد التحلل المائي الأنزيمي هو المبلغ عنه هنا. تم اختيار النموذج التجريبي بناء على اكتشاف حديث نشرته مجموعتنا18 ، حيث تم استخدام MALDI-TOF لتحديد التفاعل الفريد بين exoribonuclease Xrn-1 و oligonucleotides من الحمض النووي الريبي الذي يحتوي على الآفة التأكسدية 8-oxoG. تم الحصول على خيوط طويلة من 20 نيوكليوتيد عن طريق تخليق الطور الصلب19 ، [5'-CAU GAA ACA A(8-oxoG)G CUA AAA GU] و [5'-CAU GAA ACA A(8-oxoG) (8-oxoG) cua AAA GU] ، في حين تم التعبير عن Xrn-1 وتنقيته بعد التقرير20 الموصوف سابقا. باختصار ، Xrn-121 هو إكسريبونوكلياز 5 '-3' مع العديد من الأدوار البيولوجية الرئيسية التي تحلل أنواع متعددة من الحمض النووي الريبي ، بما في ذلك الحمض النووي الريبي المؤكسد22. وجد أن عملية الإنزيم تتوقف عند مواجهة 8-oxoG ، مما أدى إلى شظايا الحمض النووي الريبي التي تحتوي على نهايات 5'-phosphorylated [5'-H 2 PO 4-(8-oxoG)G CUA AAA GU] ، [5'-H 2 PO 4-(8-oxoG) (8-oxoG) cua aaa gu] ، و [5'-H2PO 4-(8-oxoG) cua aaa gu]18.
وأخيرا، من المهم ملاحظة أن قياس الطيف الكتلي هو طريقة قوية يمكن، من خلال منهجيات مختلفة، تكييفها مع أغراض أخرى23،24؛ وبالتالي ، فإن اختيار طريقة التأين الصحيحة بالإضافة إلى الإعداد التجريبي الآخر له أهمية قصوى.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.6 mL MCT Graduated Violet</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>05-408-127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6&#8217;-Trihydroxyacetophenone monohydrate 98%</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>480-66-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile 99.9%, HPLC grade</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>75-05-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adenosine triphosphate, 10 mM</td>
			<td>New Englang Bioscience</td>
			<td>P0756S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium citrate, dibasic 98%</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>3012-65-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium Fluoride 98.0%, ACS grade</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>12125-01-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bruker bacterial test standard</td>
			<td>Bruker Daltonics</td>
			<td>8255343</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Commercial source of Xrn-1</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>M0338S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diethyl pyrocarbonate, 97%</td>
			<td>ACROS Organics</td>
			<td>A0368487</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flex analysis software</td>
			<td>Bruker daltonics</td>
			<td></td>
			<td>FlexAnalysis software version 3.4, Bruker Daltonics</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lambda 365 UV-vis spectrophotometer</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MALDI plate: MSP 96 ground steel target</td>
			<td>Bruker Daltonics</td>
			<td>280799</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mass Spectrometer</td>
			<td>Bruker</td>
			<td></td>
			<td>Microflex LRFTOF mass spectrometer (Bruker Daltonics, Billerica, MA)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mili-Q IQ 7000</td>
			<td>Milipore Sigma</td>
			<td></td>
			<td>A Mili-Q system was used to purify all water used in this work</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanosep Centrifugal Devices with OmegaTM Membrane 10 K, blue (24/pkg)</td>
			<td>Pall Corporation</td>
			<td>OD010C33</td>
			<td>filter media, Omega (modified polyethersulfone) 10 K pore size</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEBuffer 3</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>B7003S</td>
			<td>This is solution B</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oligo Analyzer tool</td>
			<td>IDT-DNA</td>
			<td></td>
			<td>https://www.idtdna.com/calc/analyzer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tips P10</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02-707-441</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tips P200</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02-707-419</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase Away</td>
			<td>Molecular BioProducts</td>
			<td>7005-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 Polynucleotide Kinase</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>M0201S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 Polynucleotide Kinase Reaction Buffer</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>B0201S</td>
			<td>This is solution A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triflouroacetic Acid</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>76-05-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xrn-1 exoribonuclease</td>
			<td>Expressed in house</td>
			<td>See ref. 20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZipTip Pipette Tips for Sample preparation</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>ZTC 18S 096</td>
			<td>10 &#181;L pipette tips loaded with a C18 standard 0.6 &#181;L bed</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

identification of rna fragments resulting from enzymatic degradation using maldi-tof mass spectrometry

الحمض النووي الريبي هو بوليمر حيوي موجود في جميع مجالات الحياة ، وتفاعلاته مع الجزيئات الأخرى و / أو الأنواع التفاعلية ، على سبيل المثال ، الحمض النووي والبروتينات والأيونات والأدوية والجذور الحرة ، موجودة في كل مكان. ونتيجة لذلك، يخضع الحمض النووي الريبي لتفاعلات مختلفة تشمل انقسامه أو تدهوره أو تعديله، مما يؤدي إلى أنواع ذات صلة بيولوجيا ذات وظائف وآثار متميزة. أحد الأمثلة على ذلك هو أكسدة الغوانين إلى 7,8-dihydro-8-oxoguanine (8-oxoG) ، والتي قد تحدث في وجود أنواع الأكسجين التفاعلية (ROS). وعموما، فإن الإجراءات التي تميز هذه المنتجات والتحولات ذات قيمة كبيرة للمجتمع العلمي. وتحقيقا لهذه الغاية، فإن قياس الطيف الكتلي للازتناص بالليزر بمساعدة المصفوفة (MALDI-TOF) هو طريقة مستخدمة على نطاق واسع. يصف البروتوكول الحالي كيفية توصيف شظايا الحمض النووي الريبي التي تشكلت بعد العلاج الإنزيمي. يستخدم النموذج المختار تفاعلا بين الحمض النووي الريبي و exoribonuclease Xrn-1 ، حيث يتم إيقاف الهضم الأنزيمي في المواقع المؤكسدة. تم الحصول على تسلسلين من الحمض النووي الريبي الطويل المكون من 20 نيوكليوتيد [5'-CAU GAA ACA A(8-oxoG)G CUA AAA GU] و [5'-CAU GAA ACA A(8-oxoG) (8-oxoG) cua AAA GU] عن طريق توليف الطور الصلب ، الذي تم تحديده كميا بواسطة التحليل الطيفي للأشعة فوق البنفسجية ، وتم تمييزه عبر MALDI-TOF. ثم كانت الخيوط التي تم الحصول عليها (1) 5'-فسفوريلات وتتميز عبر MALDI-TOF. (2) تعامل مع Xrn-1 ؛ (3) تصفيتها ومملحة ؛ (4) تم تحليلها عبر MALDI-TOF. أدى هذا الإعداد التجريبي إلى تحديد لا لبس فيه للشظايا المرتبطة بتوقف Xrn-1: [5'-H 2 PO 4-(8-oxoG)G CUA AAA GU] ، [5'-H 2 PO 4-(8-oxoG) (8-oxoG) CUA AAA GU] ، و [5'-H2PO 4-(8-oxoG) CUA AAA GU]. وأجريت التجارب الموصوفة باستخدام 200 بيكومول من الحمض النووي الريبي (20 بيمول يستخدم في تحليلات MALDI)؛ ومع ذلك ، قد تؤدي الكميات المنخفضة إلى قمم يمكن اكتشافها باستخدام مطياف باستخدام مصادر ليزر ذات طاقة أكبر من تلك المستخدمة في هذا العمل. والأهم من ذلك، أن المنهجية الموصوفة يمكن تعميمها وربما توسيعها لتشمل تحديد المنتجات لعمليات أخرى تنطوي على الحمض النووي الريبي والحمض النووي، وقد تساعد في توصيف/توضيح المسارات البيوكيميائية الأخرى.

تم تصنيع الأوليغنوكليوتيدات المستخدمة في هذا العمل وتمييزها وتحديدها كميا قبل الاستخدام. تم تحديد تركيز جميع النوكليوتيدات القليلة عن طريق التحليل الطيفي للأشعة فوق البنفسجية المسجل عند 90 درجة مئوية لتجنب القراءات الخاطئة الناشئة عن التكوين المحتمل للهياكل الثانوية. يعرض <strong class="...

Watch this Scientific Journal Video about Identification of RNA Fragments Resulting from Enzymatic Degradation using MALDI-TOF Mass Spectrometry at JoVE.com

Identification of RNA Fragments Resulting from Enzymatic Degradation using MALDI-TOF Mass Spectrometry

تم استخدام MALDI-TOF لتوصيف الشظايا التي تم الحصول عليها من التفاعل بين الحمض النووي الريبي المؤكسد و exoribonuclease Xrn-1. يصف هذا البروتوكول منهجية يمكن تطبيقها على العمليات الأخرى التي تنطوي على الحمض النووي الريبي و / أو الحمض النووي.

تحديد شظايا الحمض النووي الريبي الناتجة عن التحلل الأنزيمي باستخدام مطياف الكتلة MALDI-TOF

RNA is a biopolymer present in all domains of life, and its interactions with other molecules and/or reactive species, e.g., DNA, proteins, ions, drugs, ...

تم اعتماد قياس الطيف الكتلي على نطاق واسع لمختلف التطبيقات. توفر المنهجية الواردة في هذه المقالة توصيفا لا لبس فيه لشظايا الحمض النووي الريبي التي تم الحصول عليها من عملية إنزيمية في المختبر. تشمل مزايا هذه التقنية أنه يتم الحصول على ذروة جزيء الحديد ، وأنه يمكن إجراء التجارب بكميات صغيرة من المواد للتطبيقات في المختبر ، وأنه يمكن إنجاز البروتوكول بأقل قدر من التدريب.يمكن تطبيق المنهجية الموصوفة على نطاق واسع لدراسة العمليات التي تنطوي على الحمض النووي أو الحمض النووي الريبي أو البروتينات. وتشمل الأمثلة التحولات الكيميائية الحيوية مثل المعلومات المتقاطعة، وتحديد التعديلات الكيميائية، أو غيرها من تفاعلات البوليمر الحيوي والتفاعل. يمكن أن تحدث صعوبة واحدة من إمكانية الوصول إلى مطياف MALDI أو المرافق الأساسية التي تقدم هذه الخدمة.جانب آخر هو تحديد حد الكشف الذي قد يكون أعلى أو أقل اعتمادا على الأداة. للبدء ، قم بتشغيل مقياس الطيف الضوئي UV-Vis ، ثم انقر فوق رمز PerkinElmer UV WinLab لفتح نافذة التحكم في تشغيل الجهاز. قم بتشغيل مقياس الطيف الضوئي لوحدة التحكم في درجة الحرارة Peltier باستخدام المفتاح الموجود على يمين الجهاز وانقر فوق Scan-Lambda 365 ، الموجود ضمن الطرق الأساسية.سيتم فتح شاشة أخرى ومطالبة المستخدم بالتأكد من أن حاملات الخلايا فارغة. انقر فوق موافق واسمح للأداة بإجراء فحوصات النظام الخاصة بها. الآن ، اضبط معلمات المسح الضوئي عن طريق تحديد جمع البيانات.في النافذة الجديدة ضمن إعدادات المسح الضوئي، قم بتغيير البداية إلى 350 نانومتر والنهاية إلى 215 نانومتر. قم بتنشيط Peltier عن طريق تحديد علامة الجمع الموجودة على يسار الملحق. ثم انقر فوق Peltier متعدد الخلايا ، وقم بتغيير درجة الحرارة المئوية إلى 25 ، وانقر فوق Peltier On.انتقل إلى علامة تبويب معلومات العينة وأدخل عدد العينات والأسماء وموضع الخلية المطلوب.انقر فوق Autozero وأدخل cuvette الذي يحتوي على حل الخلفية. انقر فوق Start (ابدأ) وأدخل cuvette في الخلية المطلوبة وتأكد من توجيه نافذة cuvette بالتوازي مع الوجه الأمامي للأداة. الآن ، انقر فوق موافق لبدء الفحص الأول عند 25 درجة مئوية.للحصول على قياسات في درجات حرارة أعلى ، انقر فوق Multi Cell Peltier ، وقم بتغيير درجة الحرارة إلى درجة حرارة العينة المطلوبة وكرر المسح. انقر فوق ملف ، تصدير واختر موقع الملف المطلوب وحدد XY Data للحصول على ملف نصي. لإجراء 5' فسفرة الحمض النووي الريبي ، قم بإعداد محلول في أنبوب طرد مركزي صغير سعة 0.6 ميكرولتر عن طريق إضافة 33.5 ميكرولتر من الماء الخالي من RNase ، وخمسة ميكرولترات من المحلول A ، وستة ميكرولايت من 10 ملليمولار أدينوسين ثلاثي الفوسفات ، وميكرولايت واحد من 200 محلول مائي للحمض النووي الريبي المموج ، و 4.5 ميكرولتر من كيناز متعدد النوكليوتيدات وخلط المحلول بلطف.احتضن خليط التفاعل عند 37 درجة مئوية لمدة 45 دقيقة عن طريق وضعه في حمام مائي. ثم تعطيل الإنزيم عن طريق وضع أنبوب التفاعل في كتلة حرارية ، مسخنة مسبقا عند 65 درجة مئوية لمدة 10 دقائق. اسمح للمحلول بأن يبرد إلى درجة حرارة الغرفة لإنتاج محلول RNA نهائي مفسفر.بعد الحضانة ، استخدم 50 ميكرولتر من هذا المحلول ، وأضف خمسة ميكرولترات من المحلول B ، وخمسة ميكرولترات من محلول 1-femtomole من Xrn-1 لإجراء التحلل المائي للحمض النووي الريبي. احتضان أنبوب التفاعل في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعتين. انقل خليط التفاعل هذا إلى جهاز طرد مركزي بحجم 10 كيلودالتون بحجم المسام وقم بتصفية الإنزيمات عن طريق الطرد المركزي لمدة 10 دقائق عند 700 مرة G.انقل الترشيح إلى أنبوب طرد مركزي سعة 0.6 ملليلتر.ثم أضف 20 ميكرولتر من الماء الخالي من RNase لغسل الحمض النووي الريبي المتبقي على أنبوب الطرد المركزي ، يليه الطرد المركزي. وأخيرا، اجمع هذا الترشيح مع الترشيح الناتج الذي تم الحصول عليه مسبقا عن طريق الطرد المركزي في جهاز طرد مركزي بحجم 10 كيلودالتون بحجم المسام، وقم بتجميد المحلول عند صفر درجة مئوية أو السفينة للتحليل. لإزالة الملح من العينة وتركيزها، استخدم أطراف ماصة C18 لتبادل الكاتيون المتاحة تجاريا والمحملة بسرير من وسائط كروماتوغرافيا C18 في نهايتها.لهذا ، ضع طرف ماصة 10 ميكرولتر على ماصة سعة 10 ميكرولتر واغسل هذا الطرف مرتين بمحلول نتريل أسيتيل مائي بنسبة 50٪. تخلص من الكميات المستخدمة في أنبوب نفايات منفصل في كل مرة وقم بموازنة طرف C18 مع 10 ميكرولترات من محلول حمض ثلاثي فلورو أسيتيك المائي بنسبة 0.1٪ مرتين. قم بإزالة طرف C18 يدويا من الماصة وتثبيته على ماصة سعة 200 ميكرولتر تحتوي على طرف ماصة P200.ثم اغمر طرف C18 في المحلول الناتج المحضر أثناء التحلل المائي ل oligonucleotides من الحمض النووي الريبي بواسطة Xrn-1 وقم بشفط المحلول من خلال طرف C18 10 مرات. الآن ، افصل طرف C18 عن ماصة P200 ، وضعه في ماصة سعة 10 ميكرولتر واغسل طرف C18 باستخدام محلول مائي من محلول حمض ثلاثي فلورو أسيتيك بنسبة 0.1٪ مرتين. تخلص من الكميات المستخدمة في أنبوب نفايات منفصل في كل مرة.اغسل طرف C18 بماء خال من RNase سعة 10 ميكرولترات مرتين. للاكتشاف على لوحة MALDI ، قم بإلغاء أوليغونوكليوتيد الحمض النووي الريبي من طرف C18 عن طريق غمر العينة في المصفوفة المطلوبة وتوزيع المحلول مرة أخرى في الأنبوب 10 مرات. ضعي هذا المحلول على نقطتين منفصلتين لكل منهما ميكرولتر واحد على اللوحة واتركي البقع لتجف في الهواء.تم تحديد تركيز الحمض النووي الريبي المستخدم في هذا العمل عن طريق التحليل الطيفي المرئي للأشعة فوق البنفسجية المسجل عند 90 درجة مئوية لتجنب القراءات الخاطئة الناشئة عن التكوين المحتمل للهياكل الثانوية. وشمل التسلسل العام للأحداث جزأين. الأول ، الفسفرة الفعالة 5' للحمض النووي الريبي ، يتضح من ظهور ذروة واحدة فقط تتوافق مع المنتج المتوقع.والثاني ، الجزء المتوقف الناشئ عن معالجة خليط العينة مع Xrn-1. تم الحصول على نفس النتائج باستخدام تسلسل مختلف يحتوي على آفتين مؤكسدتين. وتشمل التغييرات المحتملة التي يجب مراعاتها القضاء على استخدام جهاز التصفية أو النظر في مصفوفات مختلفة لاكتشاف MALDI.على سبيل المثال ، حمض السينابينيك أو حمض البيكولينيك. تم الحصول على شظايا الحمض النووي الريبي من عملية إنزيمية. تم تأسيس هذه العملية عن طريق اقتران MALDI ، والتحليل الكهربائي ، وتوليف الطور الصلب ، والثنائيات الدائرية.البروتوكول الموصوف لديه القدرة على استخدامه في مختلف المجالات ، من البحوث في العلوم الكيميائية إلى التطبيقات في مجال الطب الحيوي.

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Cell Biology

Biochemistry

Unit 1

Analyzing Cells and Proteins

SCIENTISTS IN ACTION

Time-resolved ElectroSpray Ionization Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry for Studying Protein Structure and Dynamics

وقت حل التأين electrospray الهيدروجين، الديوتيريوم تبادل الطيف الكتلي لدراسة بنية البروتين وديناميكية

Intrinsically disordered proteins (IDPs) have long been a challenge to structural biologists due to their lack of stable secondary structure elements. ...

Resolving Affinity Purified Protein Complexes by Blue Native PAGE and Protein Correlation Profiling

حل تقارب تنقية البروتين المجمعات التي كتبها Blue الأصلية PAGE والبروتين الارتباط التنميط

Most proteins act in association with others; hence, it is crucial to characterize these functional units in order to fully understand biological ...

Lipid Droplet Isolation for Quantitative Mass Spectrometry Analysis

الدهون عزل القطرة عن التحليل الكمي الطيف الكتلي

Lipid droplets are vital to the replication of a variety of different pathogens, most prominently the Hepatitis C Virus (HCV), as the putative site of ...

Sample Preparation for Mass Spectrometry-based Identification of RNA-binding Regions

إعداد نموذج لتحديد الهوية الجماعية على أساس قياس الطيف الكتلي للجيش الملكي النيبالي-ربط المناطق

Noncoding RNAs play important roles in several nuclear processes, including regulating gene expression, chromatin structure, and DNA repair. In most ...

The Determination of Protease Specificity in Mouse Tissue Extracts by MALDI-TOF Mass Spectrometry: Manipulating PH to Cause Specificity Changes

مقتطفات البت في حوزتي خصوصية في الأنسجة الماوس باستخدام TOF الكتلي: التلاعب بدرجة الحموضة تسبب التغييرات النوعية

Proteases have several biological functions, including protein activation/inactivation and food digestion. Identifying protease specificity is important ...

Proofreading and DNA Repair Assay Using Single Nucleotide Extension and MALDI-TOF Mass Spectrometry Analysis

تصحيح التجارب المطبعية ومقايسة إصلاح الحمض النووي باستخدام ملحق النوكليوتيدات واحدة واستخدام TOF تحليل الطيف الكتلي

The maintenance of the genome and its faithful replication is paramount for conserving genetic information. To assess high fidelity replication, we have ...

Analyzing Dynamic Protein Complexes Assembled On and Released From Biolayer Interferometry Biosensor Using Mass Spectrometry and Electron Microscopy

تحليل البروتين الحيوي المجمعات تجميعها على والإفراج عن بيوسينسور بيولايير قياس التداخل باستخدام الطيف الكتلي والمجهر الإلكتروني

In vivo, proteins are often part of large macromolecular complexes where binding specificity and dynamics ultimately dictate functional outputs. In this ...

Capture and Identification of RNA-binding Proteins by Using Click Chemistry-assisted RNA-interactome Capture (CARIC) Strategy

Capture and Identification of RNA-binding Proteins by Using Click Chemistry-assisted RNA-interactome Capture CARIC Strategy

التقاط وتحديد البروتينات الحمض النووي الريبي ملزم باستخدام نقرة الكيمياء-وساعدت الجيش الملكي النيبالي-إينتيراكتومي التقاط استراتيجية (كاريك)

A comprehensive identification of RNA-binding proteins (RBPs) is key to understanding the posttranscriptional regulatory network in cells. A widely used ...

Using the Open-Source MALDI TOF-MS IDBac Pipeline for Analysis of Microbial Protein and Specialized Metabolite Data

استخدام خط أنابيب MALDI TOF-MS IDBac المفتوح المصدر لتحليل البروتين الميكروبي وبيانات المستقلب المتخصصة

In order to visualize the relationship between bacterial phylogeny and specialized metabolite production of bacterial colonies growing on nutrient agar, ...

Nitropeptide Profiling and Identification Illustrated by Angiotensin II

توصيف وتعريف الببتيد الموضحة من قبل أنجيوتنسين الثاني

Protein nitration is one of the most important post-translational modifications (PTM) on tyrosine residues and it can be induced by chemical actions of ...