Name: identification of rna fragments resulting from enzymatic degradation using maldi-tof mass spectrometry
Uploaded: 2022-04-11T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Identification of RNA Fragments Resulting from Enzymatic Degradation using MALDI-TOF Mass Spectrometry at JoVE.com

Det er vigtigt at bemærke, at dette arbejde var et samarbejde mellem tre institutioner, to forskningsgrupper og en kernefacilitet. Fordelingen og arbejdsbyrden blev udført som følger: Protein (Xrn-1) ekspression blev udført ved University of Denver (Denver, CO). Oligonukleotidsyntese, kvantificering og eksperimentering (hovedsageligt enzymatisk nedbrydning) blev udført ved University of Colorado Denver (Denver, CO). Optimering blev også udført der. MALDI-TOF spotting, erhvervelse og analyse blev udført på Analytical Resources Core Facility ved Colorado State University. (Fort Collins, CO). SS vil gerne anerkende en UROP Award (CU Denver) og Eureca tilskud (CU Denver) til støtte. E. G.C. anerkender støtte fra NIGMS via R00GM115757. MJER anerkender støtte fra NIGMS via 1R15GM132816. K.B. anerkender ressource-ID: SCR_021758. Arbejdet blev også støttet af en Teacher-Scholar Award (MJER), TH-21-028, fra Henry Dreyfus Foundation.

RNase-frit ultrarent vand (tabel 1) blev anvendt til denne undersøgelse.
1. Koncentrationsbestemmelse af RNA-opløsning
<ol><li>Forbered RNA-prøven ved at følge nedenstående trin.<ol>
<li>Der anvendes et mikrocentrifugerør (0,6 ml) til fremstilling af en opløsning af RNA ved fortynding af 1 μL stamopløsning (opnået ved fastfasesyntese)19 til 159 μL RNasefriH20. Opløsningen blandes ved at pipettere blandi...

<ol>
	<li>Tanaka, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+and+polymer+analyses+up+to+m/z+100+000+by+laser+ionization+time-of-flight+mass+spectrometry.">Protein and polymer analyses up to m/z 100 000 by laser ionization time-of-flight mass spectrometry.</a> Rapid Communications in Mass Spectrometry. 2 (8), 151-153 (1988).</li><li>Karas, M., Hillenkamp, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+desorption+ionization+of+proteins+with+molecular+masses+exceeding+10,000+daltons.">Laser desorption ionization of proteins with molecular masses exceeding 10,000 daltons.</a> Analytical Chemistry. 60 (20), 2299-2301 (1988).</li><li>Zenobi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemistry+nobel+prize+2002+goes+to+analytical+chemistry.">Chemistry nobel prize 2002 goes to analytical chemistry.</a> Chimia. 57, 73 (2003).</li><li>Aristri, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bio-based+polyurethane+resins+derived+from+tannin:+Source,+synthesis,+characterization,+and+application.">Bio-based polyurethane resins derived from tannin: Source, synthesis, characterization, and application.</a> Forests. 12 (11), 1516 (2021).</li><li>Pedrazzani, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=5-n-Alkylresorcinol+profiles+in+different+cultivars+of+einkorn,+emmer+spelt,+common+wheat,+and+tritordeum.">5-n-Alkylresorcinol profiles in different cultivars of einkorn, emmer spelt, common wheat, and tritordeum.</a> Journal of Agricultural and Food Chemistry. 69 (47), 14092-14102 (2021).</li><li>Unger, M. S., Blank, M., Enzlein, T., Hopf, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Label-free+cell+assays+to+determine+compound+uptake+or+drug+action+using+MALDI-TOF+mass+spectrometry.">Label-free cell assays to determine compound uptake or drug action using MALDI-TOF mass spectrometry.</a> Nature Protocols. 16 (12), 5533-5558 (2021).</li><li>Croxatto, A., Prod'hom, G., Greub, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Applications+of+MALDI-TOF+mass+spectrometry+in+clinical+diagnostic+microbiology.">Applications of MALDI-TOF mass spectrometry in clinical diagnostic microbiology.</a> FEMS Microbiology Reviews. 36 (2), 380-407 (2012).</li><li>Kaufmann, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Marrix-assisted+laser+desorption+ionization+(MALDI)+mass+spectrometry:+a+novel+analytical+tool+in+molecular+biology+and+biotechnology.">Marrix-assisted laser desorption ionization (MALDI) mass spectrometry: a novel analytical tool in molecular biology and biotechnology.</a> Journal of Biotechnology. 41 (2-3), 155-175 (1995).</li><li>Kiggins, C., Skinner, A., Resendiz, M. J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=8-Oxo-7,8-dihydroguanosine+inhibits+or+changes+the+selectivity+of+the+theophylline+aptamer.">8-Oxo-7,8-dihydroguanosine inhibits or changes the selectivity of the theophylline aptamer.</a> ChemBioChem. 21 (9), 1347-1355 (2020).</li><li>Chapman, E. G., DeRose, V. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzymatic+processing+of+platinated+RNAs.">Enzymatic processing of platinated RNAs.</a> Journal of the American Chemical Society. 132 (6), 1946-1952 (2010).</li><li>Resendiz, M. J. E., Pottiboyina, V., Sevilla, M. D., Greengerg, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+strand+scission+in+double+stranded+RNA+via+a+C5-pyrimidine+radical.">Direct strand scission in double stranded RNA via a C5-pyrimidine radical.</a> Journal of the American Chemical Society. 134 (8), 3917-3924 (2012).</li><li>Joyner, J. C., Keuper, K. D., Cowan, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+RNA+cleavage+by+MALDI-TOF+mass+spectrometry.">Analysis of RNA cleavage by MALDI-TOF mass spectrometry.</a> Nucleic Acids Research. 41 (1), 2 (2013).</li><li>Ghodke, P. P., Guengerich, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+polymerases+&#951;+and+&#954;+bypass+N2-guanine-O6-alkylguanine+DNA+alkyltransferase+cross-linked+DNA+peptides.">DNA polymerases &#951; and &#954; bypass N2-guanine-O6-alkylguanine DNA alkyltransferase cross-linked DNA peptides.</a> Journal of Biological Chemistry. 297 (4), 101124 (2021).</li><li>JoVE. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=JoVE+Science+Education+Database.+Biochemistry.+MALDI-TOF+Mass+Spectrometry.">JoVE Science Education Database. Biochemistry. MALDI-TOF Mass Spectrometry.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2021).</li><li>Schr&#246;tner, P., Gunzer, F., Sch&#252;ppel, J., Rudolph, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+rare+bacterial+pathogens+by+16S+rRNA+gene+sequencing+and+MALDI-TOF+MS.">Identification of rare bacterial pathogens by 16S rRNA gene sequencing and MALDI-TOF MS.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (113), e53176 (2016).</li><li>Su, K. -. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proofreading+and+DNA+repair+assay+using+single+nucleotide+extension+and+MALDI-TOF+mass+spectrometry+analysis.">Proofreading and DNA repair assay using single nucleotide extension and MALDI-TOF mass spectrometry analysis.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (136), e57862 (2018).</li><li>Fagerquist, C. K., Rojas, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+antibacterial+immunity+proteins+in+Escherichia+coli+using+MALDI-TOF-TOF-MS/MS+and+Top-Down+proteomic+analysis.">Identification of antibacterial immunity proteins in Escherichia coli using MALDI-TOF-TOF-MS/MS and Top-Down proteomic analysis.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (171), e62577 (2021).</li><li>Phillips, C. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Processing+of+RNA+containing+8-Oxo-7,8-dihydroguanosine+(8-oxoG)+by+the+exoribonuclease+Xrn-1.">Processing of RNA containing 8-Oxo-7,8-dihydroguanosine (8-oxoG) by the exoribonuclease Xrn-1.</a> Frontiers in Molecular Biosciences. 8, 780315 (2021).</li><li>Francis, A. J., Resendiz, M. J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protocol+for+the+solid-phase+synthesis+of+oligomers+of+RNA+containing+a+2'-O-thiophenylmethyl+modification+and+characterization+via+circular+dichroism.">Protocol for the solid-phase synthesis of oligomers of RNA containing a 2'-O-thiophenylmethyl modification and characterization via circular dichroism.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (125), e56189 (2017).</li><li>Langeberg, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biochemical+characterization+of+yeast+Xrn1.">Biochemical characterization of yeast Xrn1.</a> Biochemistry. 59 (15), 1493-1507 (2020).</li><li>Stevens, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+and+characterization+of+a+Saccharomyces+cerevisiae+exoribonuclease+which+yields+5'-mononucleotides+by+a+5'+leads+to+3'+mode+of+hydrolysis.">Purification and characterization of a Saccharomyces cerevisiae exoribonuclease which yields 5'-mononucleotides by a 5' leads to 3' mode of hydrolysis.</a> Journal of Biological Chemistry. 255 (7), 3080-3085 (1980).</li><li>Yan, L. L., Simms, C. L., McLoughlin, F., Vierstra, R. D., Zaher, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxidation+and+alkylation+stresses+activate+ribosome-quality+control.">Oxidation and alkylation stresses activate ribosome-quality control.</a> Nature Communications. 10 (1), 5611 (2019).</li><li>Fasnacht, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+23S+rRNA+modification+ho5C2501+benefits+Escherichia+coli+under+oxidative+stress.">Dynamic 23S rRNA modification ho5C2501 benefits Escherichia coli under oxidative stress.</a> Nucleic Acids Research. 50 (1), 473-489 (2022).</li><li>Estevez, M., Valesyan, S., Jora, M., Limbach, P. A., Addepalli, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxidative+damage+to+RNA+is+altered+by+the+presence+of+interacting+proteins+or+modified+nucleosides.">Oxidative damage to RNA is altered by the presence of interacting proteins or modified nucleosides.</a> Frontiers in Molecular Biosciences. 8, 697149 (2021).</li><li>Tomar, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+sequence+modulates+the+efficiency+of+NEIL1-catalyzed+excision+of+the+aflatoxin+B1-induced+formamidopyrimidine+guanine+adduct.">DNA sequence modulates the efficiency of NEIL1-catalyzed excision of the aflatoxin B1-induced formamidopyrimidine guanine adduct.</a> Journal of the American Chemical Society. 34 (3), 901-911 (2021).</li><li>Gaffney, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV-1+env-dependent+cell+killing+by+bifunctional+small-molecule/peptide+conjugates.">HIV-1 env-dependent cell killing by bifunctional small-molecule/peptide conjugates.</a> ACS Chemical Biology. 16 (1), 193-204 (2021).</li><li>Sikorski, E. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+display+of+a+chemoattractant+agonist+on+cancer+cells+activates+the+formyl+peptide+receptor+1+on+immune+cells.">Selective display of a chemoattractant agonist on cancer cells activates the formyl peptide receptor 1 on immune cells.</a> ChemBioChem. , 202100521 (2022).</li><li>Kubo, T., Nishimura, Y., Sato, Y., Yanagihara, K., Seyama, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sixteen+different+types+of+lipid-conjugated+siRNAs+containing+saturated+and+unsaturated+fatty+Acids+and+exhibiting+enhanced+RNAi+potency.">Sixteen different types of lipid-conjugated siRNAs containing saturated and unsaturated fatty Acids and exhibiting enhanced RNAi potency.</a> ACS Chemical Biology. 16 (1), 150-164 (2021).</li></ol>

Den største udfordring i denne arbejdsgang opstod mellem færdiggørelsen af eksperimenterne og udførelsen af massespektrometriske analyser. Eksperimenter blev udført og afsluttet ved University of Colorado Denver og afsendt (natten over) til Colorado State University faciliteter. Dataindsamling blev udført ved modtagelse, som bekvemmelighed. Flere uventede omstændigheder førte til tidsforsinkelser i processen. I et tilfælde krævede uventede instrumentfejl, at prøverne blev frosset (en gang i 21 dage) inden spot...

MALDI-TOF 1,2,3 er en meget anvendt teknik til karakterisering og/eller påvisning af molekyler af varierende størrelse og egenskaber. Nogle af dets anvendelser omfatter forskellige anvendelser såsom påvisning af tanniner fra naturressourcer4, billeddannelse af metabolitter i fødevarer5, opdagelse eller overvågning af cellulære lægemiddelmål eller markører6 og klinisk diagnostik7, for at nævne nogle få. Af relevans for det nuværende arbejde er brugen af MALDI-TOF med DNA eller RNA, med dets anvendelse på oligonukleotider, der går tilbage til over tre årtier8, hvor flere begrænsninger blev noteret. Denne teknik har nu udviklet sig til et pålideligt, almindeligt anvendt middel til at karakterisere både biopolymerer9 og identificere/forstå kemiske og biokemiske reaktioner, f.eks. karakterisering af platinerede steder i RNA10, identifikation af RNA-fragmenter efter strengspaltning11,12 eller dannelse af protein-DNA-tværbindinger13 . Det er således værdifuldt at illustrere og fremhæve vigtige aspekter ved at bruge denne teknik. Det grundlæggende i MALDI-TOF er også beskrevet i videoformat14 og vil ikke blive uddybet yderligere heri. Desuden er dets anvendelse i en DNA- eller proteinsammenhæng tidligere blevet beskrevet og illustreret i det nævnte format 15,16,17.
Protokollen til påvisning af RNA-fragmenter dannet efter enzymatisk hydrolyse er rapporteret heri. Den eksperimentelle model blev valgt på baggrund af et nyligt fund offentliggjort af vores gruppe18, hvor MALDI-TOF blev brugt til at bestemme den unikke reaktivitet mellem exoribonuklease Xrn-1 og oligonukleotider af RNA indeholdende den oxidative læsion 8-oxoG. De lange 20-nukleotidstrenge blev opnået ved fastfasesyntese19, [5'-CAU GAA ACA A(8-oxoG)G CUA AAA GU] og [5'-CAU GAA ACA A(8-oxoG)(8-oxoG) CUA AAA GU], mens Xrn-1 blev udtrykt og renset efter den tidligere beskrevne rapport20. Kort fortalt er Xrn-121 en 5'-3' exoribonuklease med forskellige biologiske nøgleroller, der nedbryder flere typer RNA, herunder oxideret RNA22. Det blev konstateret, at enzymets processivitet går i stå ved mødet med 8-oxoG, hvilket førte til RNA-fragmenter indeholdende 5'-phosphorylerede ender [5'-H2PO4-(8-oxoG)G CUA AAA GU], [5'-H2PO4-(8-oxoG)(8-oxoG) CUA AAA GU] og [5'-H2PO4-(8-oxoG) CUA AAA GU]18.
Endelig er det vigtigt at bemærke, at massespektrometri er en kraftfuld metode, der gennem forskellige metoder kan tilpasses til andre formål23,24; Derfor er det yderst vigtigt at vælge den rigtige ioniseringsmetode såvel som anden eksperimentel opsætning.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.6 mL MCT Graduated Violet</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>05-408-127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6&#8217;-Trihydroxyacetophenone monohydrate 98%</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>480-66-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile 99.9%, HPLC grade</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>75-05-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adenosine triphosphate, 10 mM</td>
			<td>New Englang Bioscience</td>
			<td>P0756S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium citrate, dibasic 98%</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>3012-65-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium Fluoride 98.0%, ACS grade</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>12125-01-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bruker bacterial test standard</td>
			<td>Bruker Daltonics</td>
			<td>8255343</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Commercial source of Xrn-1</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>M0338S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diethyl pyrocarbonate, 97%</td>
			<td>ACROS Organics</td>
			<td>A0368487</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flex analysis software</td>
			<td>Bruker daltonics</td>
			<td></td>
			<td>FlexAnalysis software version 3.4, Bruker Daltonics</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lambda 365 UV-vis spectrophotometer</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MALDI plate: MSP 96 ground steel target</td>
			<td>Bruker Daltonics</td>
			<td>280799</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mass Spectrometer</td>
			<td>Bruker</td>
			<td></td>
			<td>Microflex LRFTOF mass spectrometer (Bruker Daltonics, Billerica, MA)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mili-Q IQ 7000</td>
			<td>Milipore Sigma</td>
			<td></td>
			<td>A Mili-Q system was used to purify all water used in this work</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanosep Centrifugal Devices with OmegaTM Membrane 10 K, blue (24/pkg)</td>
			<td>Pall Corporation</td>
			<td>OD010C33</td>
			<td>filter media, Omega (modified polyethersulfone) 10 K pore size</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEBuffer 3</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>B7003S</td>
			<td>This is solution B</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oligo Analyzer tool</td>
			<td>IDT-DNA</td>
			<td></td>
			<td>https://www.idtdna.com/calc/analyzer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tips P10</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02-707-441</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tips P200</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02-707-419</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase Away</td>
			<td>Molecular BioProducts</td>
			<td>7005-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 Polynucleotide Kinase</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>M0201S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 Polynucleotide Kinase Reaction Buffer</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>B0201S</td>
			<td>This is solution A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triflouroacetic Acid</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>76-05-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xrn-1 exoribonuclease</td>
			<td>Expressed in house</td>
			<td>See ref. 20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZipTip Pipette Tips for Sample preparation</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>ZTC 18S 096</td>
			<td>10 &#181;L pipette tips loaded with a C18 standard 0.6 &#181;L bed</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

identification of rna fragments resulting from enzymatic degradation using maldi-tof mass spectrometry

RNA er en biopolymer, der er til stede i alle livets domæner, og dets interaktioner med andre molekyler og / eller reaktive arter, f.eks. DNA, proteiner, ioner, lægemidler og frie radikaler, er allestedsnærværende. Som et resultat gennemgår RNA forskellige reaktioner, der inkluderer dets spaltning, nedbrydning eller modifikation, hvilket fører til biologisk relevante arter med forskellige funktioner og implikationer. Et eksempel er oxidation af guanin til 7,8-dihydro-8-oxoguanin (8-oxoG), som kan forekomme i nærvær af reaktive oxygenarter (ROS). Samlet set er procedurer, der karakteriserer sådanne produkter og transformationer, stort set værdifulde for det videnskabelige samfund. Til dette formål er matrixassisteret laserdesorptionsioniseringstid (MALDI-TOF) massespektrometri en meget anvendt metode. Den foreliggende protokol beskriver, hvordan man karakteriserer RNA-fragmenter dannet efter enzymatisk behandling. Den valgte model anvender en reaktion mellem RNA og exoribonuklease Xrn-1, hvor enzymatisk fordøjelse standses på oxiderede steder. To lange RNA-sekvenser med 20 nukleotid [5'-CAU GAA ACA A(8-oxoG)G CUA AAA GU] og [5'-CAU GAA ACA A(8-oxoG)(8-oxoG) CUA AAA GU] blev opnået ved fastfasesyntese, kvantificeret ved UV-vis-spektroskopi og karakteriseret via MALDI-TOF. De opnåede tråde blev derefter (1) 5'-fosforyleret og karakteriseret via MALDI-TOF; (2) behandlet med Xrn-1; 3) filtreret og afsaltet (4) analyseret via MALDI-TOF. Denne eksperimentelle opsætning førte til en entydig identifikation af fragmenterne i forbindelse med standsningen af Xrn-1: [5'-H2PO4-(8-oxoG)G CUA AAA GU], [5'-H2PO4-(8-oxoG)(8-oxoG) CUA AAA GU] og [5'-H2PO4-(8-oxoG) CUA AAA GU]. De beskrevne eksperimenter blev udført med 200 picomol RNA (20 pmol anvendt til MALDI-analyser); lavere mængder kan dog resultere i detekterbare toppe med spektrometre ved hjælp af laserkilder med mere effekt end den, der anvendes i dette arbejde. Det er vigtigt, at den beskrevne metode kan generaliseres og potentielt udvides til produktidentifikation for andre processer, der involverer RNA og DNA, og kan hjælpe med karakterisering / belysning af andre biokemiske veje.

De oligonukleotider, der blev anvendt i dette arbejde, blev syntetiseret, karakteriseret og kvantificeret inden brug. Koncentrationen af alle oligonukleotider blev bestemt ved hjælp af UV-vis-spektroskopi registreret ved 90 °C for at undgå fejlagtige aflæsninger som følge af den potentielle dannelse af de sekundære strukturer. Figur 3 viser spektrene af modellen oligonukleotider af RNA, der anvendes i dette arbejde, taget ved stuetemperatur og efter påføring af varme.
<p...

Watch this Scientific Journal Video about Identification of RNA Fragments Resulting from Enzymatic Degradation using MALDI-TOF Mass Spectrometry at JoVE.com

Identification of RNA Fragments Resulting from Enzymatic Degradation using MALDI-TOF Mass Spectrometry

MALDI-TOF blev anvendt til at karakterisere fragmenter opnået ved reaktiviteten mellem oxideret RNA og exoribonuklease Xrn-1. Den foreliggende protokol beskriver en metode, der kan anvendes på andre processer, der involverer RNA og / eller DNA.

Identifikation af RNA-fragmenter som følge af enzymatisk nedbrydning ved anvendelse af MALDI-TOF massespektrometri

RNA is a biopolymer present in all domains of life, and its interactions with other molecules and/or reactive species, e.g., DNA, proteins, ions, drugs, ...

Massespektrometri er blevet bredt vedtaget til forskellige anvendelser. Metoden i denne artikel giver den utvetydige karakterisering af RNA-fragmenter opnået fra en in vitro enzymatisk proces. Fordelene ved denne teknik er, at molekylet jerntop opnås, at eksperimenterne kan udføres med små mængder materiale til in vitro-applikationer, og at protokollen kan udføres med minimal træning.Den beskrevne metode kan anvendes bredt til at studere processer, der involverer DNA, RNA eller proteiner. Eksempler omfatter biokemiske transformationer såsom krydsinformation, identifikation af kemiske modifikationer eller andre biopolymerinteraktioner og reaktivitet. Et problem kan opstå ved tilgængeligheden til et MALDI-spektrometer eller kernefaciliteter, der tilbyder denne service.Et andet aspekt er at fastsætte detektionsgrænsen, som kan være højere eller lavere afhængigt af instrumentet. Til at begynde med skal du tænde UV-Vis-spektrofotometeret og derefter klikke på PerkinElmer UV WinLab-ikonet for at åbne instrumentbetjeningskontrolvinduet. Tænd for Peltier-temperaturregulatorens spektrofotometer ved hjælp af kontakten til højre for instrumentet, og klik på Scan-Lambda 365, der findes under Basismetoder.En anden skærm åbnes og beder brugeren om at sikre, at celleholderne er tomme. Klik på OK, og lad instrumentet udføre sine systemkontroller. Juster nu scanningsparametrene ved at vælge Dataindsamling.I det nye vindue under Scanningsindstillinger skal du ændre starten til 350 nanometer og slutningen til 215 nanometer. Aktivér Peltier ved at vælge plus til venstre for tilbehøret. Klik derefter på Multiple Cell Peltier, skift temperaturgraderne Celsius til 25, og klik på Peltier On.Naviger til fanen Prøveinfo, og indtast antallet af prøver, navne og ønskede celleposition.Klik på Autozero, og indsæt kuvetten, der indeholder baggrundsopløsningen. Klik på Start, og indsæt kuvetten i den ønskede celle, og sørg for, at kuvettevinduet er orienteret parallelt med instrumentets forside. Klik nu på OK for at starte den første scanning ved 25 grader Celsius.For målinger ved højere temperaturer skal du klikke på Multiple Cell Peltier, ændre temperaturen til den ønskede prøvetemperatur og gentage scanningen. Klik på Filer, Eksporter og vælg den ønskede filplacering, og vælg XY Data for at få en tekstfil. For at udføre 5'phosphorylering af RNA fremstilles en opløsning i et 0,6 mikroliter mikrocentrifugerør ved at tilsætte 33,5 mikroliter RNasefrit vand, fem mikroliter opløsning A, seks mikroliter 10 millimolært adenosintrifosfat, en mikrolite af 200 mikromolær RNA vandig opløsning og 4,5 mikroliter polynukleotidkinase og bland opløsningen forsigtigt.Inkuber reaktionsblandingen ved 37 grader Celsius i 45 minutter ved at placere den i et vandbad. Derefter inaktiveres enzymet ved at placere reaktionsrøret i en varmeblok, forvarmet ved 65 grader Celsius i 10 minutter. Lad opløsningen afkøle til stuetemperatur for at give en endelig 5'phosphoryleret RNA-opløsning.Efter inkubation anvendes 50 mikroliter af denne opløsning, tilsættes fem mikroliter opløsning B og fem mikroliter 1-femtomolopløsning af Xrn-1 til udførelse af RNA-hydrolyse. Inkuber reaktionsrøret ved stuetemperatur i to timer. Overfør denne reaktionsblanding til en 10 kilodalton poreformet centrifugalanordning og filtrer enzymerne ved centrifugering i 10 minutter ved 700 gange G.Overfør filtratet til et 0,6 ml centrifugerør.Derefter tilsættes 20 mikroliter RNase-frit vand for at vaske det resterende RNA på centrifugalrøret efterfulgt af centriifugation. Endelig kombineres dette filtrat med det resulterende filtrat opnået tidligere ved centrifugering i 10 kilodaltons centrifugalanordning i porestørrelse og fryser opløsningen ved nul grader Celsius eller sendes til analyse. For at afsalte og koncentrere prøven skal du bruge kommercielt tilgængelige kationbytter C18-pipettespidser fyldt med en seng af C18-kromatografimedier i slutningen.Til dette skal du placere pipettespidsen på 10 mikroliter på en 10-mikroliter pipette og vaske dette tip to gange med 50% vandig acetylnitrilopløsning. De brugte mængder kasseres i et separat affaldsrør hver gang, og C18-spidsen ligestilles med 10 mikroliter 0,1 % vandig trifluoreddikesyreopløsning to gange. Fjern C18-spidsen manuelt fra pipetten, og fastgør den på en pipette på 200 mikroliter, der indeholder en P200-pipettespids.Derefter nedsænkes C18-spidsen i den resulterende opløsning fremstillet under hydrolyse af oligonukleotider af RNA ved Xrn-1, og aspirat frigiver opløsningen gennem C18-spidsen 10 gange. Fjern nu C18-spidsen fra P200-pipetten, placer den ned til en 10-mikroliterpipette, og vask C18-spidsen ved hjælp af en vandig opløsning af 0,1% trifluoreddikesyreopløsning to gange. Kassér de brugte mængder i et separat affaldsrør hver gang.Vask C18-spidsen med 10 mikroliter RNase-frit vand to gange. Til spotting på MALDI-pladen elueres RNA-oligonukleotid fra C18-spidsen ved at nedsænke prøven i den ønskede matrix og dispensere opløsningen tilbage i røret 10 gange. Pipette denne opløsning ud på to separate pletter på en mikroliter hver på pladen og lade pletter lufttørre.Koncentrationen af RNA, der blev anvendt i dette arbejde, blev bestemt via UV-synlig spektroskopi registreret ved 90 grader Celsius for at undgå fejlagtige aflæsninger som følge af den potentielle dannelse af de sekundære strukturer. Den overordnede rækkefølge af begivenheder omfattede to dele. Den ene, den effektive 5'phosphorylering af RNA, fremgår af udseendet af kun en top svarende til det forventede produkt.Og to, det stallende fragment som følge af behandlingen af prøveblandingen med Xrn-1. De samme resultater blev opnået ved anvendelse af en anden sekvens, der indeholdt to oxidative læsioner. Potentielle ændringer, der skal overvejes, omfatter eliminering af brugen af filtreringsanordningen eller overvejelse af forskellige matricer til MALDI-spotting.For eksempel sinapinsyre eller picolinsyre. RNA-fragmenterne blev opnået fra en enzymatisk proces. Denne proces blev etableret ved kobling af MALDI, elektroforetisk analyse, fastfasesyntese og cirkulær dichroisme.Den beskrevne protokol har potentiale til at blive brugt på forskellige områder, fra forskning inden for de kemiske videnskaber til anvendelser på det biomedicinske område.

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Cell Biology

Biochemistry

Unit 1

Analyzing Cells and Proteins

SCIENTISTS IN ACTION

Time-resolved ElectroSpray Ionization Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry for Studying Protein Structure and Dynamics

Time-løst elektrosprayioniserings Brint-deuterium Exchange-massespektrometri til at studere proteiners struktur og Dynamics

Intrinsically disordered proteins (IDPs) have long been a challenge to structural biologists due to their lack of stable secondary structure elements. ...

Resolving Affinity Purified Protein Complexes by Blue Native PAGE and Protein Correlation Profiling

Løsning affinitetsrensede proteinkomplekser ved Blå Native PAGE og protein Korrelation Profilering

Most proteins act in association with others; hence, it is crucial to characterize these functional units in order to fully understand biological ...

Lipid Droplet Isolation for Quantitative Mass Spectrometry Analysis

Lipid Droplet Isolation for Kvantitativ massespektrometri Analyse

Lipid droplets are vital to the replication of a variety of different pathogens, most prominently the Hepatitis C Virus (HCV), as the putative site of ...

Sample Preparation for Mass Spectrometry-based Identification of RNA-binding Regions

Prøveforberedelse til massespektrometri-baseret identifikation af RNA-bindende regioner

Noncoding RNAs play important roles in several nuclear processes, including regulating gene expression, chromatin structure, and DNA repair. In most ...

The Determination of Protease Specificity in Mouse Tissue Extracts by MALDI-TOF Mass Spectrometry: Manipulating PH to Cause Specificity Changes

Bestemmelse af Protease specificitet i mus væv ekstrakter af MALDI-TOF-massespektrometri: manipulere PH for at forårsage specificitet ændringer

Proteases have several biological functions, including protein activation/inactivation and food digestion. Identifying protease specificity is important ...

Proofreading and DNA Repair Assay Using Single Nucleotide Extension and MALDI-TOF Mass Spectrometry Analysis

Korrekturlæsning og DNA reparation analyse ved hjælp af Single Nucleotide udvidelse og MALDI-TOF-massespektrometri analyse

The maintenance of the genome and its faithful replication is paramount for conserving genetic information. To assess high fidelity replication, we have ...

Analyzing Dynamic Protein Complexes Assembled On and Released From Biolayer Interferometry Biosensor Using Mass Spectrometry and Electron Microscopy

Analysere dynamisk proteinkomplekser samles på og frigivet fra Biolayer interferometri Biosensor ved hjælp af massespektrometri og elektronmikroskopi

In vivo, proteins are often part of large macromolecular complexes where binding specificity and dynamics ultimately dictate functional outputs. In this ...

Capture and Identification of RNA-binding Proteins by Using Click Chemistry-assisted RNA-interactome Capture (CARIC) Strategy

Capture and Identification of RNA-binding Proteins by Using Click Chemistry-assisted RNA-interactome Capture CARIC Strategy

Opsamling og identifikation af RNA-bindende proteiner ved hjælp af klik kemi-assisteret RNA-interactome Capture (CARIC) strategi

A comprehensive identification of RNA-binding proteins (RBPs) is key to understanding the posttranscriptional regulatory network in cells. A widely used ...

Using the Open-Source MALDI TOF-MS IDBac Pipeline for Analysis of Microbial Protein and Specialized Metabolite Data

Brug af open source-MALDI TOF-MS IDBac-rørledningen til analyse af mikrobiel protein og specialiserede metabolit data

In order to visualize the relationship between bacterial phylogeny and specialized metabolite production of bacterial colonies growing on nutrient agar, ...

Nitropeptide Profiling and Identification Illustrated by Angiotensin II

Nitropeptid profilering og identifikation illustreret af angiotensin II

Protein nitration is one of the most important post-translational modifications (PTM) on tyrosine residues and it can be induced by chemical actions of ...