Name: identification of rna fragments resulting from enzymatic degradation using maldi-tof mass spectrometry
Uploaded: 2022-04-11T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Identification of RNA Fragments Resulting from Enzymatic Degradation using MALDI-TOF Mass Spectrometry at JoVE.com

Het is belangrijk op te merken dat dit werk een gezamenlijke inspanning was tussen drie instellingen, twee onderzoeksgroepen en één kernfaciliteit. De verdeling en werklast werden als volgt uitgevoerd: Eiwit (Xrn-1) expressie werd uitgevoerd aan de Universiteit van Denver (Denver, CO). Oligonucleotidesynthese, kwantificering en experimenten (voornamelijk enzymatische afbraak) werden uitgevoerd aan de Universiteit van Colorado Denver (Denver, CO). Daar werd ook optimalisatie uitgevoerd. MALDI-TOF spotting, acquisitie en analyse werden uitgevoerd in de Analytical Resources Core Facility aan de Colorado State University. (Fort Collins, CO). SS wil graag een UROP Award (CU Denver) en Eureca-subsidies (CU Denver) voor ondersteuning erkennen. E. G.C. erkent de steun van NIGMS, via R00GM115757. MJER erkent ondersteuning van NIGMS, via 1R15GM132816. K.B. erkent bron-ID: SCR_021758. Het werk werd ook ondersteund door een Teacher-Scholar Award (MJER), TH-21-028, van de Henry Dreyfus Foundation.

Voor dit onderzoek werd RNase-vrij ultrazuiver water (tabel 1) gebruikt.
1. Concentratiebepaling van RNA-oplossing
<ol><li>Bereid het RNA-monster voor volgens de onderstaande stappen.<ol>
<li>Gebruik een microcentrifugebuis (0,6 ml) om een oplossing van RNA te bereiden door 1 μL stamoplossing (verkregen via vastefasesynthese)19 te verdunnen tot 159 μL RNase-vrij H2O. Meng de oplossing door het mengsel herhaaldeli...

<ol>
	<li>Tanaka, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+and+polymer+analyses+up+to+m/z+100+000+by+laser+ionization+time-of-flight+mass+spectrometry.">Protein and polymer analyses up to m/z 100 000 by laser ionization time-of-flight mass spectrometry.</a> Rapid Communications in Mass Spectrometry. 2 (8), 151-153 (1988).</li><li>Karas, M., Hillenkamp, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+desorption+ionization+of+proteins+with+molecular+masses+exceeding+10,000+daltons.">Laser desorption ionization of proteins with molecular masses exceeding 10,000 daltons.</a> Analytical Chemistry. 60 (20), 2299-2301 (1988).</li><li>Zenobi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemistry+nobel+prize+2002+goes+to+analytical+chemistry.">Chemistry nobel prize 2002 goes to analytical chemistry.</a> Chimia. 57, 73 (2003).</li><li>Aristri, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bio-based+polyurethane+resins+derived+from+tannin:+Source,+synthesis,+characterization,+and+application.">Bio-based polyurethane resins derived from tannin: Source, synthesis, characterization, and application.</a> Forests. 12 (11), 1516 (2021).</li><li>Pedrazzani, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=5-n-Alkylresorcinol+profiles+in+different+cultivars+of+einkorn,+emmer+spelt,+common+wheat,+and+tritordeum.">5-n-Alkylresorcinol profiles in different cultivars of einkorn, emmer spelt, common wheat, and tritordeum.</a> Journal of Agricultural and Food Chemistry. 69 (47), 14092-14102 (2021).</li><li>Unger, M. S., Blank, M., Enzlein, T., Hopf, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Label-free+cell+assays+to+determine+compound+uptake+or+drug+action+using+MALDI-TOF+mass+spectrometry.">Label-free cell assays to determine compound uptake or drug action using MALDI-TOF mass spectrometry.</a> Nature Protocols. 16 (12), 5533-5558 (2021).</li><li>Croxatto, A., Prod'hom, G., Greub, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Applications+of+MALDI-TOF+mass+spectrometry+in+clinical+diagnostic+microbiology.">Applications of MALDI-TOF mass spectrometry in clinical diagnostic microbiology.</a> FEMS Microbiology Reviews. 36 (2), 380-407 (2012).</li><li>Kaufmann, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Marrix-assisted+laser+desorption+ionization+(MALDI)+mass+spectrometry:+a+novel+analytical+tool+in+molecular+biology+and+biotechnology.">Marrix-assisted laser desorption ionization (MALDI) mass spectrometry: a novel analytical tool in molecular biology and biotechnology.</a> Journal of Biotechnology. 41 (2-3), 155-175 (1995).</li><li>Kiggins, C., Skinner, A., Resendiz, M. J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=8-Oxo-7,8-dihydroguanosine+inhibits+or+changes+the+selectivity+of+the+theophylline+aptamer.">8-Oxo-7,8-dihydroguanosine inhibits or changes the selectivity of the theophylline aptamer.</a> ChemBioChem. 21 (9), 1347-1355 (2020).</li><li>Chapman, E. G., DeRose, V. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzymatic+processing+of+platinated+RNAs.">Enzymatic processing of platinated RNAs.</a> Journal of the American Chemical Society. 132 (6), 1946-1952 (2010).</li><li>Resendiz, M. J. E., Pottiboyina, V., Sevilla, M. D., Greengerg, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+strand+scission+in+double+stranded+RNA+via+a+C5-pyrimidine+radical.">Direct strand scission in double stranded RNA via a C5-pyrimidine radical.</a> Journal of the American Chemical Society. 134 (8), 3917-3924 (2012).</li><li>Joyner, J. C., Keuper, K. D., Cowan, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+RNA+cleavage+by+MALDI-TOF+mass+spectrometry.">Analysis of RNA cleavage by MALDI-TOF mass spectrometry.</a> Nucleic Acids Research. 41 (1), 2 (2013).</li><li>Ghodke, P. P., Guengerich, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+polymerases+&#951;+and+&#954;+bypass+N2-guanine-O6-alkylguanine+DNA+alkyltransferase+cross-linked+DNA+peptides.">DNA polymerases &#951; and &#954; bypass N2-guanine-O6-alkylguanine DNA alkyltransferase cross-linked DNA peptides.</a> Journal of Biological Chemistry. 297 (4), 101124 (2021).</li><li>JoVE. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=JoVE+Science+Education+Database.+Biochemistry.+MALDI-TOF+Mass+Spectrometry.">JoVE Science Education Database. Biochemistry. MALDI-TOF Mass Spectrometry.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2021).</li><li>Schr&#246;tner, P., Gunzer, F., Sch&#252;ppel, J., Rudolph, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+rare+bacterial+pathogens+by+16S+rRNA+gene+sequencing+and+MALDI-TOF+MS.">Identification of rare bacterial pathogens by 16S rRNA gene sequencing and MALDI-TOF MS.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (113), e53176 (2016).</li><li>Su, K. -. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proofreading+and+DNA+repair+assay+using+single+nucleotide+extension+and+MALDI-TOF+mass+spectrometry+analysis.">Proofreading and DNA repair assay using single nucleotide extension and MALDI-TOF mass spectrometry analysis.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (136), e57862 (2018).</li><li>Fagerquist, C. K., Rojas, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+antibacterial+immunity+proteins+in+Escherichia+coli+using+MALDI-TOF-TOF-MS/MS+and+Top-Down+proteomic+analysis.">Identification of antibacterial immunity proteins in Escherichia coli using MALDI-TOF-TOF-MS/MS and Top-Down proteomic analysis.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (171), e62577 (2021).</li><li>Phillips, C. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Processing+of+RNA+containing+8-Oxo-7,8-dihydroguanosine+(8-oxoG)+by+the+exoribonuclease+Xrn-1.">Processing of RNA containing 8-Oxo-7,8-dihydroguanosine (8-oxoG) by the exoribonuclease Xrn-1.</a> Frontiers in Molecular Biosciences. 8, 780315 (2021).</li><li>Francis, A. J., Resendiz, M. J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protocol+for+the+solid-phase+synthesis+of+oligomers+of+RNA+containing+a+2'-O-thiophenylmethyl+modification+and+characterization+via+circular+dichroism.">Protocol for the solid-phase synthesis of oligomers of RNA containing a 2'-O-thiophenylmethyl modification and characterization via circular dichroism.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (125), e56189 (2017).</li><li>Langeberg, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biochemical+characterization+of+yeast+Xrn1.">Biochemical characterization of yeast Xrn1.</a> Biochemistry. 59 (15), 1493-1507 (2020).</li><li>Stevens, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+and+characterization+of+a+Saccharomyces+cerevisiae+exoribonuclease+which+yields+5'-mononucleotides+by+a+5'+leads+to+3'+mode+of+hydrolysis.">Purification and characterization of a Saccharomyces cerevisiae exoribonuclease which yields 5'-mononucleotides by a 5' leads to 3' mode of hydrolysis.</a> Journal of Biological Chemistry. 255 (7), 3080-3085 (1980).</li><li>Yan, L. L., Simms, C. L., McLoughlin, F., Vierstra, R. D., Zaher, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxidation+and+alkylation+stresses+activate+ribosome-quality+control.">Oxidation and alkylation stresses activate ribosome-quality control.</a> Nature Communications. 10 (1), 5611 (2019).</li><li>Fasnacht, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+23S+rRNA+modification+ho5C2501+benefits+Escherichia+coli+under+oxidative+stress.">Dynamic 23S rRNA modification ho5C2501 benefits Escherichia coli under oxidative stress.</a> Nucleic Acids Research. 50 (1), 473-489 (2022).</li><li>Estevez, M., Valesyan, S., Jora, M., Limbach, P. A., Addepalli, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxidative+damage+to+RNA+is+altered+by+the+presence+of+interacting+proteins+or+modified+nucleosides.">Oxidative damage to RNA is altered by the presence of interacting proteins or modified nucleosides.</a> Frontiers in Molecular Biosciences. 8, 697149 (2021).</li><li>Tomar, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+sequence+modulates+the+efficiency+of+NEIL1-catalyzed+excision+of+the+aflatoxin+B1-induced+formamidopyrimidine+guanine+adduct.">DNA sequence modulates the efficiency of NEIL1-catalyzed excision of the aflatoxin B1-induced formamidopyrimidine guanine adduct.</a> Journal of the American Chemical Society. 34 (3), 901-911 (2021).</li><li>Gaffney, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV-1+env-dependent+cell+killing+by+bifunctional+small-molecule/peptide+conjugates.">HIV-1 env-dependent cell killing by bifunctional small-molecule/peptide conjugates.</a> ACS Chemical Biology. 16 (1), 193-204 (2021).</li><li>Sikorski, E. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+display+of+a+chemoattractant+agonist+on+cancer+cells+activates+the+formyl+peptide+receptor+1+on+immune+cells.">Selective display of a chemoattractant agonist on cancer cells activates the formyl peptide receptor 1 on immune cells.</a> ChemBioChem. , 202100521 (2022).</li><li>Kubo, T., Nishimura, Y., Sato, Y., Yanagihara, K., Seyama, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sixteen+different+types+of+lipid-conjugated+siRNAs+containing+saturated+and+unsaturated+fatty+Acids+and+exhibiting+enhanced+RNAi+potency.">Sixteen different types of lipid-conjugated siRNAs containing saturated and unsaturated fatty Acids and exhibiting enhanced RNAi potency.</a> ACS Chemical Biology. 16 (1), 150-164 (2021).</li></ol>

De belangrijkste uitdaging in deze workflow lag tussen het afronden van de experimenten en het uitvoeren van de massaspectrometrische analyses. Experimenten werden uitgevoerd en voltooid aan de Universiteit van Colorado Denver en ('s nachts) verscheept naar de faciliteiten van de Colorado State University. Gegevensverzameling werd uitgevoerd na ontvangst, zoals het gemak biedt. Verschillende onverwachte omstandigheden leidden tot tijdsvertragingen in het proces. In één geval moesten onverwachte instrumentstoringen de m...

MALDI-TOF 1,2,3 is een veelgebruikte techniek voor de karakterisering en/of detectie van moleculen van verschillende groottes en eigenschappen. Sommige van de toepassingen omvatten diverse toepassingen, zoals het detecteren van tannines uit natuurlijke hulpbronnen4, beeldvorming van metabolieten in voedsel5, ontdekking of monitoring van cellulaire medicijndoelen of markers6 en klinische diagnostiek7, om er maar een paar te noemen. Van belang voor het huidige werk is het gebruik van MALDI-TOF met DNA of RNA, waarbij het gebruik ervan op oligonucleotiden dateert uit meer dan drie decennia8, waar verschillende beperkingen werden opgemerkt. Deze techniek is nu geëvolueerd naar een betrouwbaar, veelgebruikt middel om zowel biopolymeren9 te karakteriseren als chemische en biochemische reacties te identificeren/begrijpen, bijvoorbeeld karakterisering van platinated sites in RNA10, identificatie van RNA-fragmenten na strengsplitsing 11,12, of vorming van eiwit-DNA cross-links13 . Het is dus waardevol om belangrijke aspecten van het gebruik van deze techniek te illustreren en te benadrukken. De basis van MALDI-TOF is ook in videoformaat beschreven14 en zal hierin niet verder worden uitgewerkt. Bovendien is de toepassing ervan in een DNA- of eiwitcontext eerder beschreven en geïllustreerd in het genoemde formaat 15,16,17.
Het protocol voor het detecteren van RNA-fragmenten gevormd na enzymatische hydrolyse wordt hierin gerapporteerd. Het experimentele model werd gekozen op basis van een recente bevinding gepubliceerd door onze groep18, waar MALDI-TOF werd gebruikt om de unieke reactiviteit te bepalen tussen het exoribonuclease Xrn-1 en oligonucleotiden van RNA dat de oxidatieve laesie 8-oxoG bevat. De 20-nucleotide lange strengen werden verkregen via vaste-fase synthese19, [5'-CAU GAA ACA A(8-oxoG)G CUA AAA GU] en [5'-CAU GAA ACA A(8-oxoG)(8-oxoG) CUA AAA GU], terwijl Xrn-1 werd uitgedrukt en gezuiverd na het eerder beschreven rapport20. Kortom, Xrn-121 is een 5'-3' exoribonuclease met verschillende belangrijke biologische rollen die meerdere soorten RNA afbreken, waaronder geoxideerd RNA22. Het bleek dat de processiviteit van het enzym stagneert bij het tegenkomen van 8-oxoG, wat leidde tot RNA-fragmenten met 5'-gefosforyleerde uiteinden [5'-H2PO4-(8-oxoG)G CUA AAA GU], [5'-H2PO4-(8-oxoG)(8-oxoG) CUA AAA GU], en [5'-H2PO4-(8-oxoG) CUA AAA GU]18.
Ten slotte is het belangrijk op te merken dat massaspectrometrie een krachtige methode is die, door middel van verschillende methodologieën, kan worden aangepast aan andere doeleinden23,24; daarom is het kiezen van de juiste ionisatiemethode en andere experimentele opstellingen van het grootste belang.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.6 mL MCT Graduated Violet</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>05-408-127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6&#8217;-Trihydroxyacetophenone monohydrate 98%</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>480-66-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile 99.9%, HPLC grade</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>75-05-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adenosine triphosphate, 10 mM</td>
			<td>New Englang Bioscience</td>
			<td>P0756S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium citrate, dibasic 98%</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>3012-65-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium Fluoride 98.0%, ACS grade</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>12125-01-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bruker bacterial test standard</td>
			<td>Bruker Daltonics</td>
			<td>8255343</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Commercial source of Xrn-1</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>M0338S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diethyl pyrocarbonate, 97%</td>
			<td>ACROS Organics</td>
			<td>A0368487</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flex analysis software</td>
			<td>Bruker daltonics</td>
			<td></td>
			<td>FlexAnalysis software version 3.4, Bruker Daltonics</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lambda 365 UV-vis spectrophotometer</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MALDI plate: MSP 96 ground steel target</td>
			<td>Bruker Daltonics</td>
			<td>280799</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mass Spectrometer</td>
			<td>Bruker</td>
			<td></td>
			<td>Microflex LRFTOF mass spectrometer (Bruker Daltonics, Billerica, MA)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mili-Q IQ 7000</td>
			<td>Milipore Sigma</td>
			<td></td>
			<td>A Mili-Q system was used to purify all water used in this work</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanosep Centrifugal Devices with OmegaTM Membrane 10 K, blue (24/pkg)</td>
			<td>Pall Corporation</td>
			<td>OD010C33</td>
			<td>filter media, Omega (modified polyethersulfone) 10 K pore size</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEBuffer 3</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>B7003S</td>
			<td>This is solution B</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oligo Analyzer tool</td>
			<td>IDT-DNA</td>
			<td></td>
			<td>https://www.idtdna.com/calc/analyzer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tips P10</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02-707-441</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tips P200</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02-707-419</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase Away</td>
			<td>Molecular BioProducts</td>
			<td>7005-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 Polynucleotide Kinase</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>M0201S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 Polynucleotide Kinase Reaction Buffer</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>B0201S</td>
			<td>This is solution A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triflouroacetic Acid</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>76-05-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xrn-1 exoribonuclease</td>
			<td>Expressed in house</td>
			<td>See ref. 20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZipTip Pipette Tips for Sample preparation</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>ZTC 18S 096</td>
			<td>10 &#181;L pipette tips loaded with a C18 standard 0.6 &#181;L bed</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

identification of rna fragments resulting from enzymatic degradation using maldi-tof mass spectrometry

RNA is een biopolymeer dat aanwezig is in alle domeinen van het leven en de interacties met andere moleculen en / of reactieve soorten, bijvoorbeeld DNA, eiwitten, ionen, medicijnen en vrije radicalen, zijn alomtegenwoordig. Als gevolg hiervan ondergaat RNA verschillende reacties, waaronder de splitsing, afbraak of modificatie, wat leidt tot biologisch relevante soorten met verschillende functies en implicaties. Een voorbeeld is de oxidatie van guanine tot 7,8-dihydro-8-oxoguanine (8-oxoG), die kan optreden in aanwezigheid van reactieve zuurstofsoorten (ROS). Over het algemeen zijn procedures die dergelijke producten en transformaties kenmerken grotendeels waardevol voor de wetenschappelijke gemeenschap. Hiertoe is matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight (MALDI-TOF) massaspectrometrie een veel gebruikte methode. Het huidige protocol beschrijft hoe RNA-fragmenten gevormd na enzymatische behandeling kunnen worden gekarakteriseerd. Het gekozen model maakt gebruik van een reactie tussen RNA en het exoribonuclease Xrn-1, waarbij de enzymatische spijsvertering wordt gestopt op geoxideerde plaatsen. Twee 20-nucleotide lange RNA-sequenties [5'-CAU GAA ACA A(8-oxoG)G CUA AAA GU] en [5'-CAU GAA ACA A(8-oxoG)(8-oxoG) CUA AAA GU] werden verkregen via vastefasesynthese, gekwantificeerd door UV-vis spectroscopie, en gekarakteriseerd via MALDI-TOF. De verkregen strengen werden vervolgens (1) 5'-gefosforyleerd en gekarakteriseerd via MALDI-TOF; (2) behandeld met Xrn-1; (3) gefilterd en ontzout; (4) geanalyseerd via MALDI-TOF. Deze experimentele opstelling leidde tot de ondubbelzinnige identificatie van de fragmenten geassocieerd met het stallen van Xrn-1: [5'-H2PO4-(8-oxoG)G CUA AAA GU], [5'-H2PO4-(8-oxoG)(8-oxoG) CUA AAA GU], en [5'-H2PO4-(8-oxoG) CUA AAA GU]. De beschreven experimenten werden uitgevoerd met 200 picomol RNA (20 pmol gebruikt voor MALDI-analyses); lagere hoeveelheden kunnen echter resulteren in detecteerbare pieken met spectrometers met behulp van laserbronnen met meer vermogen dan degene die in dit werk wordt gebruikt. Belangrijk is dat de beschreven methodologie kan worden gegeneraliseerd en mogelijk kan worden uitgebreid tot productidentificatie voor andere processen waarbij RNA en DNA betrokken zijn, en kan helpen bij de karakterisering / opheldering van andere biochemische routes.

De oligonucleotiden die in dit werk werden gebruikt, werden voorafgaand aan gebruik gesynthetiseerd, gekarakteriseerd en gekwantificeerd. De concentratie van alle oligonucleotiden werd bepaald via UV-vis spectroscopie geregistreerd bij 90 °C om foutieve metingen als gevolg van de potentiële vorming van de secundaire structuren te voorkomen. Figuur 3 toont de spectra van de model oligonucleotiden van RNA die in dit werk worden gebruikt, genomen bij kamertemperatuur en na het toepas...

Watch this Scientific Journal Video about Identification of RNA Fragments Resulting from Enzymatic Degradation using MALDI-TOF Mass Spectrometry at JoVE.com

Identification of RNA Fragments Resulting from Enzymatic Degradation using MALDI-TOF Mass Spectrometry

MALDI-TOF werd gebruikt om fragmenten te karakteriseren die werden verkregen uit de reactiviteit tussen geoxideerd RNA en het exoribonuclease Xrn-1. Dit protocol beschrijft een methodiek die toepasbaar is op andere processen waarbij RNA en/of DNA betrokken is.

Identificatie van RNA-fragmenten als gevolg van enzymatische degradatie met behulp van MALDI-TOF-massaspectrometrie

RNA is a biopolymer present in all domains of life, and its interactions with other molecules and/or reactive species, e.g., DNA, proteins, ions, drugs, ...

Massaspectrometrie is op grote schaal toegepast voor verschillende toepassingen. De methodologie in dit artikel biedt de ondubbelzinnige karakterisering van RNA-fragmenten verkregen uit een in vitro enzymatisch proces. Voordelen van deze techniek zijn onder meer dat het molecuul ijzerpiek wordt verkregen, dat de experimenten kunnen worden uitgevoerd met kleine hoeveelheden materiaal voor in vitro toepassingen en dat het protocol kan worden bereikt met minimale training.De beschreven methodologie kan op grote schaal worden toegepast op het bestuderen van processen waarbij DNA, RNA of eiwitten betrokken zijn. Voorbeelden hiervan zijn biochemische transformaties zoals kruisinformatie, identificatie van chemische modificaties of andere biopolymeerinteracties en reactiviteit. Een moeilijkheid kan zich voordoen bij de toegankelijkheid van een MALDI-spectrometer of kernfaciliteiten die deze service aanbieden.Een ander aspect is het vaststellen van de detectielimiet die afhankelijk van het instrument hoger of lager kan zijn. Schakel om te beginnen de UV-Vis-spectrofotometer in en klik vervolgens op het Pictogram PerkinElmer UV WinLab om het bedieningsvenster van het instrument te openen. Schakel de Peltier-temperatuurregelaarspectrofotometer in met behulp van de schakelaar rechts van het instrument en klik op Scan-Lambda 365, aanwezig onder Basismethoden.Een ander scherm wordt geopend en de gebruiker wordt gevraagd ervoor te zorgen dat de celhouders leeg zijn. Klik op OK en laat het instrument zijn systeemcontroles uitvoeren. Pas nu de scanparameters aan door Gegevensverzameling te selecteren.Wijzig in het nieuwe venster onder Scaninstellingen de begin in 350 nanometer en het einde in 215 nanometer. Activeer de Peltier door de plus links van het accessoire te selecteren. Klik vervolgens op Multiple Cell Peltier, wijzig de temperatuurgraden Celsius naar 25 en klik op Peltier On.Navigeer naar het tabblad Sample Info en voer het gewenste aantal monsters, namen en celpositie in.Klik op Autozero en plaats de cuvette met de achtergrondoplossing. Klik op Start en plaats de cuvette in de gewenste cel en zorg ervoor dat het cuvettevenster evenwijdig aan de voorkant van het instrument is georiënteerd. Klik nu op OK om de eerste scan bij 25 graden Celsius te starten.Voor metingen bij hogere temperaturen klikt u op Multiple Cell Peltier, wijzigt u de temperatuur in de gewenste monstertemperatuur en herhaalt u de scan. Klik op Bestand, Exporteren en kies de gewenste bestandslocatie en selecteer XY Data om een tekstbestand te verkrijgen. Om 5'fosforylering van RNA uit te voeren, bereidt u een oplossing in een microcentrifugebuis van 0,6 microliter door 33,5 microliter RNase-vrij water, vijf microliter oplossing A, zes microlieten van 10 millimolair adenosinetrifosfaat, één microliet van 200 micromolaire RNA-waterige oplossing en 4,5 microliter polynucleotidekinase toe te voegen en mengt u de oplossing voorzichtig.Incubeer het reactiemengsel bij 37 graden Celsius gedurende 45 minuten door het in een waterbad te plaatsen. Vervolgens het enzym inactiveren door de reactiebuis in een warmteblok te plaatsen, voorverwarmd op 65 graden Celsius gedurende 10 minuten. Laat de oplossing afkoelen tot kamertemperatuur om een uiteindelijke 5'gefosforyleerde RNA-oplossing te verkrijgen.Gebruik na incubatie 50 microliter van deze oplossing, voeg vijf microliter oplossing B en vijf microliter 1-femtomole-oplossing van Xrn-1 toe om RNA-hydrolyse uit te voeren. Incubeer de reactiebuis bij kamertemperatuur gedurende twee uur. Breng dit reactiemengsel over op een centrifugaalapparaat ter grootte van een porie van 10 kilodalton en filtreer de enzymen door gedurende 10 minuten te centrifugeren op 700 keer G.Breng het filtraat over in een centrifugebuis van 0,6 milliliter.Voeg vervolgens 20 microliter RNase-vrij water toe om het resterende RNA op de centrifugaalbuis te wassen, gevolgd door centrifugatie. Combineer ten slotte dit filtraat met het resulterende filtraat dat eerder is verkregen door centrifugeren in een centrifugaalapparaat ter grootte van een porie van 10 kilodalton en vries de oplossing in bij nul graden Celsius of verzend voor analyse. Om het monster te ontzouten en te concentreren, gebruikt u in de handel verkrijgbare C18-pipetpunten van kationenuitwisseling geladen met een bed van C18-chromatografiemedia aan het uiteinde.Plaats hiervoor de pipetpunt van 10 microliter op een pipet van 10 microliter en was deze tip tweemaal met 50% waterige acetylnitriloplossing. Gooi de gebruikte volumes telkens weg in een aparte afvalbuis en breng de C18-tip twee keer in evenwicht met 10 microliter 0,1% waterige trifluorazijnzuuroplossing. Verwijder de C18-punt handmatig uit de pipet en bevestig deze op een pipet van 200 microliter met een P200-pipetpunt.Dompel vervolgens de C18-tip onder in de resulterende oplossing die is bereid tijdens hydrolyse van oligonucleotiden van RNA door Xrn-1 en aspiraat geeft de oplossing 10 keer vrij via de C18-tip. Maak nu de C18-tip los van de P200-pipet, plaats deze op een pipet van 10 microliter en was de C18-tip tweemaal met een waterige oplossing van 0,1% trifluorazijnzuuroplossing. Gooi de gebruikte volumes telkens weg in een aparte afvalbuis.Was de C18-tip twee keer met RNase-vrij water van 10 microliter. Voor spotting op de MALDI-plaat elueert u het RNA-oligonucleotide uit de C18-tip door het monster in de gewenste matrix onder te dompelen en de oplossing 10 keer terug in de buis te doseren. Pipetteer deze oplossing op twee afzonderlijke plekken van elk één microliter op de plaat en laat de plekken aan de lucht drogen.De concentratie van RNA die in dit werk werd gebruikt, werd bepaald via UV-zichtbare spectroscopie geregistreerd bij 90 graden Celsius om foutieve metingen als gevolg van de potentiële vorming van de secundaire structuren te voorkomen. De totale opeenvolging van gebeurtenissen bestond uit twee delen. Eén, de efficiënte 5'fosforylering van RNA, blijkt uit het verschijnen van slechts één piek die overeenkomt met het verwachte product.En twee, het stallingsfragment dat ontstaat bij de behandeling van het monstermengsel met Xrn-1. Dezelfde resultaten werden verkregen met behulp van een andere sequentie die twee oxidatieve laesies bevatte. Mogelijke wijzigingen die moeten worden overwogen, zijn onder meer het elimineren van het gebruik van het filterapparaat of het overwegen van verschillende matrices voor MALDI-spotting.Bijvoorbeeld sinapinic acid of picolinezuur. De RNA-fragmenten werden verkregen uit een enzymatisch proces. Dit proces werd tot stand gebracht door MALDI, elektroforetische analyse, vastefasesynthese en circulair dichroïsme te koppelen.Het beschreven protocol heeft een potentieel om te worden gebruikt op verschillende gebieden, van onderzoek in de chemische wetenschappen tot toepassingen op biomedisch gebied.

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Cell Biology

Biochemistry

Unit 1

Analyzing Cells and Proteins

SCIENTISTS IN ACTION

Time-resolved ElectroSpray Ionization Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry for Studying Protein Structure and Dynamics

Tijdsgeresolveerde elektrosprayionisatie waterstof-deuterium Exchange Massaspectrometrie voor het bestuderen van Protein Structure en Dynamics

Intrinsically disordered proteins (IDPs) have long been a challenge to structural biologists due to their lack of stable secondary structure elements. ...

Resolving Affinity Purified Protein Complexes by Blue Native PAGE and Protein Correlation Profiling

Het oplossen van Affiniteit gezuiverde eiwit complexen door Blue inheemse PAGE en Protein Correlatie Profiling

Most proteins act in association with others; hence, it is crucial to characterize these functional units in order to fully understand biological ...

Lipid Droplet Isolation for Quantitative Mass Spectrometry Analysis

Lipide Druppeltje Isolatie kwantitatieve massaspectrometrie Analyse

Lipid droplets are vital to the replication of a variety of different pathogens, most prominently the Hepatitis C Virus (HCV), as the putative site of ...

Sample Preparation for Mass Spectrometry-based Identification of RNA-binding Regions

Bereiding van de monsters voor de massa spectrometrie gebaseerde identificatie van RNA-bindende regio 's

Noncoding RNAs play important roles in several nuclear processes, including regulating gene expression, chromatin structure, and DNA repair. In most ...

The Determination of Protease Specificity in Mouse Tissue Extracts by MALDI-TOF Mass Spectrometry: Manipulating PH to Cause Specificity Changes

De vaststelling van specificiteit uit Protease in muis weefsel extracten met behulp van de Spectrometrie van de massa van de MALDI-TOF: manipuleren van de PH veroorzaken specificiteit wijzigingen

Proteases have several biological functions, including protein activation/inactivation and food digestion. Identifying protease specificity is important ...

Proofreading and DNA Repair Assay Using Single Nucleotide Extension and MALDI-TOF Mass Spectrometry Analysis

Proeflezen en DNA Repair Assay met behulp van één Nucleotide uitbreiding en MALDI-TOF massa spectrometrie analyse

The maintenance of the genome and its faithful replication is paramount for conserving genetic information. To assess high fidelity replication, we have ...

Analyzing Dynamic Protein Complexes Assembled On and Released From Biolayer Interferometry Biosensor Using Mass Spectrometry and Electron Microscopy

Analyseren van de dynamische eiwitcomplexen op gemonteerd en vrijgelaten uit Biolayer interferometrie Biosensor met behulp van spectrometrie van de massa en elektronenmicroscopie

In vivo, proteins are often part of large macromolecular complexes where binding specificity and dynamics ultimately dictate functional outputs. In this ...

Capture and Identification of RNA-binding Proteins by Using Click Chemistry-assisted RNA-interactome Capture (CARIC) Strategy

Capture and Identification of RNA-binding Proteins by Using Click Chemistry-assisted RNA-interactome Capture CARIC Strategy

Vastleggen en identificatie van RNA-bindende proteÃ¯nen met behulp van klik chemie-bijgewoonde RNA-interactome vangen (CARIC) strategie

A comprehensive identification of RNA-binding proteins (RBPs) is key to understanding the posttranscriptional regulatory network in cells. A widely used ...

Using the Open-Source MALDI TOF-MS IDBac Pipeline for Analysis of Microbial Protein and Specialized Metabolite Data

Met behulp van de open-source MALDI TOF-MS IDBac pijpleiding voor analyse van microbiële eiwitten en gespecialiseerde metaboliet gegevens

In order to visualize the relationship between bacterial phylogeny and specialized metabolite production of bacterial colonies growing on nutrient agar, ...

Nitropeptide Profiling and Identification Illustrated by Angiotensin II

Nitropeptide profilering en identificatie geïllustreerd door angiotensine II

Protein nitration is one of the most important post-translational modifications (PTM) on tyrosine residues and it can be induced by chemical actions of ...