Name: identification of rna fragments resulting from enzymatic degradation using maldi-tof mass spectrometry
Uploaded: 2022-04-11T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Identification of RNA Fragments Resulting from Enzymatic Degradation using MALDI-TOF Mass Spectrometry at JoVE.com

חשוב לציין שעבודה זו הייתה מאמץ משותף בין שלושה מוסדות, שתי קבוצות מחקר ומתקן ליבה אחד. ההפצה ועומס העבודה בוצעו כדלקמן: ביטוי חלבון (Xrn-1) בוצע באוניברסיטת דנבר (דנבר, קולורדו). סינתזה, כימות וניסויים של אוליגונוקלאוטידים (בעיקר השפלה אנזימטית) נערכו באוניברסיטת קולורדו דנבר (דנבר, קולורדו). כמו כן בוצע שם אופטימיזציה. איתור, רכישה וניתוח של MALDI-TOF בוצעו במתקן הליבה של המשאבים האנליטיים באוניברסיטת המדינה של קולורדו. (פורט קולינס, קולורדו). SS רוצה להודות על פרס UROP (CU דנבר) ומענקי Eureca (CU דנבר) לתמיכה. E. G.C. מכיר בתמיכה של NIGMS, באמצעות R00GM115757. MJER מאשרת תמיכה מ- NIGMS, באמצעות 1R15GM132816. K.B. מכיר במזהה משאב: SCR_021758. העבודה נתמכה גם על ידי פרס מורה-חוקר (MJER), TH-21-028, מטעם קרן הנרי דרייפוס.

מים טהורים במיוחד ללא RNase (טבלה 1) שימשו למחקר הנוכחי.
1. קביעת ריכוז של תמיסת RNA
<ol><li>הכן את דגימת ה- RNA בהתאם לשלבים הבאים.<ol>
<li>השתמש בצינור microcentrifuge (0.6 מ"ל) כדי להכין תמיסה של RNA על ידי דילול 1 μL של תמיסת מלאי (המתקבלת באמצעות סינתזה בפאזה מוצקה)19...

<ol>
	<li>Tanaka, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+and+polymer+analyses+up+to+m/z+100+000+by+laser+ionization+time-of-flight+mass+spectrometry.">Protein and polymer analyses up to m/z 100 000 by laser ionization time-of-flight mass spectrometry.</a> Rapid Communications in Mass Spectrometry. 2 (8), 151-153 (1988).</li><li>Karas, M., Hillenkamp, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+desorption+ionization+of+proteins+with+molecular+masses+exceeding+10,000+daltons.">Laser desorption ionization of proteins with molecular masses exceeding 10,000 daltons.</a> Analytical Chemistry. 60 (20), 2299-2301 (1988).</li><li>Zenobi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemistry+nobel+prize+2002+goes+to+analytical+chemistry.">Chemistry nobel prize 2002 goes to analytical chemistry.</a> Chimia. 57, 73 (2003).</li><li>Aristri, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bio-based+polyurethane+resins+derived+from+tannin:+Source,+synthesis,+characterization,+and+application.">Bio-based polyurethane resins derived from tannin: Source, synthesis, characterization, and application.</a> Forests. 12 (11), 1516 (2021).</li><li>Pedrazzani, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=5-n-Alkylresorcinol+profiles+in+different+cultivars+of+einkorn,+emmer+spelt,+common+wheat,+and+tritordeum.">5-n-Alkylresorcinol profiles in different cultivars of einkorn, emmer spelt, common wheat, and tritordeum.</a> Journal of Agricultural and Food Chemistry. 69 (47), 14092-14102 (2021).</li><li>Unger, M. S., Blank, M., Enzlein, T., Hopf, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Label-free+cell+assays+to+determine+compound+uptake+or+drug+action+using+MALDI-TOF+mass+spectrometry.">Label-free cell assays to determine compound uptake or drug action using MALDI-TOF mass spectrometry.</a> Nature Protocols. 16 (12), 5533-5558 (2021).</li><li>Croxatto, A., Prod'hom, G., Greub, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Applications+of+MALDI-TOF+mass+spectrometry+in+clinical+diagnostic+microbiology.">Applications of MALDI-TOF mass spectrometry in clinical diagnostic microbiology.</a> FEMS Microbiology Reviews. 36 (2), 380-407 (2012).</li><li>Kaufmann, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Marrix-assisted+laser+desorption+ionization+(MALDI)+mass+spectrometry:+a+novel+analytical+tool+in+molecular+biology+and+biotechnology.">Marrix-assisted laser desorption ionization (MALDI) mass spectrometry: a novel analytical tool in molecular biology and biotechnology.</a> Journal of Biotechnology. 41 (2-3), 155-175 (1995).</li><li>Kiggins, C., Skinner, A., Resendiz, M. J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=8-Oxo-7,8-dihydroguanosine+inhibits+or+changes+the+selectivity+of+the+theophylline+aptamer.">8-Oxo-7,8-dihydroguanosine inhibits or changes the selectivity of the theophylline aptamer.</a> ChemBioChem. 21 (9), 1347-1355 (2020).</li><li>Chapman, E. G., DeRose, V. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzymatic+processing+of+platinated+RNAs.">Enzymatic processing of platinated RNAs.</a> Journal of the American Chemical Society. 132 (6), 1946-1952 (2010).</li><li>Resendiz, M. J. E., Pottiboyina, V., Sevilla, M. D., Greengerg, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+strand+scission+in+double+stranded+RNA+via+a+C5-pyrimidine+radical.">Direct strand scission in double stranded RNA via a C5-pyrimidine radical.</a> Journal of the American Chemical Society. 134 (8), 3917-3924 (2012).</li><li>Joyner, J. C., Keuper, K. D., Cowan, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+RNA+cleavage+by+MALDI-TOF+mass+spectrometry.">Analysis of RNA cleavage by MALDI-TOF mass spectrometry.</a> Nucleic Acids Research. 41 (1), 2 (2013).</li><li>Ghodke, P. P., Guengerich, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+polymerases+&#951;+and+&#954;+bypass+N2-guanine-O6-alkylguanine+DNA+alkyltransferase+cross-linked+DNA+peptides.">DNA polymerases &#951; and &#954; bypass N2-guanine-O6-alkylguanine DNA alkyltransferase cross-linked DNA peptides.</a> Journal of Biological Chemistry. 297 (4), 101124 (2021).</li><li>JoVE. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=JoVE+Science+Education+Database.+Biochemistry.+MALDI-TOF+Mass+Spectrometry.">JoVE Science Education Database. Biochemistry. MALDI-TOF Mass Spectrometry.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2021).</li><li>Schr&#246;tner, P., Gunzer, F., Sch&#252;ppel, J., Rudolph, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+rare+bacterial+pathogens+by+16S+rRNA+gene+sequencing+and+MALDI-TOF+MS.">Identification of rare bacterial pathogens by 16S rRNA gene sequencing and MALDI-TOF MS.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (113), e53176 (2016).</li><li>Su, K. -. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proofreading+and+DNA+repair+assay+using+single+nucleotide+extension+and+MALDI-TOF+mass+spectrometry+analysis.">Proofreading and DNA repair assay using single nucleotide extension and MALDI-TOF mass spectrometry analysis.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (136), e57862 (2018).</li><li>Fagerquist, C. K., Rojas, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+antibacterial+immunity+proteins+in+Escherichia+coli+using+MALDI-TOF-TOF-MS/MS+and+Top-Down+proteomic+analysis.">Identification of antibacterial immunity proteins in Escherichia coli using MALDI-TOF-TOF-MS/MS and Top-Down proteomic analysis.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (171), e62577 (2021).</li><li>Phillips, C. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Processing+of+RNA+containing+8-Oxo-7,8-dihydroguanosine+(8-oxoG)+by+the+exoribonuclease+Xrn-1.">Processing of RNA containing 8-Oxo-7,8-dihydroguanosine (8-oxoG) by the exoribonuclease Xrn-1.</a> Frontiers in Molecular Biosciences. 8, 780315 (2021).</li><li>Francis, A. J., Resendiz, M. J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protocol+for+the+solid-phase+synthesis+of+oligomers+of+RNA+containing+a+2'-O-thiophenylmethyl+modification+and+characterization+via+circular+dichroism.">Protocol for the solid-phase synthesis of oligomers of RNA containing a 2'-O-thiophenylmethyl modification and characterization via circular dichroism.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (125), e56189 (2017).</li><li>Langeberg, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biochemical+characterization+of+yeast+Xrn1.">Biochemical characterization of yeast Xrn1.</a> Biochemistry. 59 (15), 1493-1507 (2020).</li><li>Stevens, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+and+characterization+of+a+Saccharomyces+cerevisiae+exoribonuclease+which+yields+5'-mononucleotides+by+a+5'+leads+to+3'+mode+of+hydrolysis.">Purification and characterization of a Saccharomyces cerevisiae exoribonuclease which yields 5'-mononucleotides by a 5' leads to 3' mode of hydrolysis.</a> Journal of Biological Chemistry. 255 (7), 3080-3085 (1980).</li><li>Yan, L. L., Simms, C. L., McLoughlin, F., Vierstra, R. D., Zaher, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxidation+and+alkylation+stresses+activate+ribosome-quality+control.">Oxidation and alkylation stresses activate ribosome-quality control.</a> Nature Communications. 10 (1), 5611 (2019).</li><li>Fasnacht, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+23S+rRNA+modification+ho5C2501+benefits+Escherichia+coli+under+oxidative+stress.">Dynamic 23S rRNA modification ho5C2501 benefits Escherichia coli under oxidative stress.</a> Nucleic Acids Research. 50 (1), 473-489 (2022).</li><li>Estevez, M., Valesyan, S., Jora, M., Limbach, P. A., Addepalli, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxidative+damage+to+RNA+is+altered+by+the+presence+of+interacting+proteins+or+modified+nucleosides.">Oxidative damage to RNA is altered by the presence of interacting proteins or modified nucleosides.</a> Frontiers in Molecular Biosciences. 8, 697149 (2021).</li><li>Tomar, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+sequence+modulates+the+efficiency+of+NEIL1-catalyzed+excision+of+the+aflatoxin+B1-induced+formamidopyrimidine+guanine+adduct.">DNA sequence modulates the efficiency of NEIL1-catalyzed excision of the aflatoxin B1-induced formamidopyrimidine guanine adduct.</a> Journal of the American Chemical Society. 34 (3), 901-911 (2021).</li><li>Gaffney, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV-1+env-dependent+cell+killing+by+bifunctional+small-molecule/peptide+conjugates.">HIV-1 env-dependent cell killing by bifunctional small-molecule/peptide conjugates.</a> ACS Chemical Biology. 16 (1), 193-204 (2021).</li><li>Sikorski, E. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+display+of+a+chemoattractant+agonist+on+cancer+cells+activates+the+formyl+peptide+receptor+1+on+immune+cells.">Selective display of a chemoattractant agonist on cancer cells activates the formyl peptide receptor 1 on immune cells.</a> ChemBioChem. , 202100521 (2022).</li><li>Kubo, T., Nishimura, Y., Sato, Y., Yanagihara, K., Seyama, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sixteen+different+types+of+lipid-conjugated+siRNAs+containing+saturated+and+unsaturated+fatty+Acids+and+exhibiting+enhanced+RNAi+potency.">Sixteen different types of lipid-conjugated siRNAs containing saturated and unsaturated fatty Acids and exhibiting enhanced RNAi potency.</a> ACS Chemical Biology. 16 (1), 150-164 (2021).</li></ol>

האתגר העיקרי בתהליך עבודה זה התעורר בין השלמת הניסויים לבין ביצוע הניתוחים הספקטרומטריים של המסות. הניסויים בוצעו והושלמו באוניברסיטת קולורדו דנבר ונשלחו (בן לילה) למתקני אוניברסיטת המדינה של קולורדו. איסוף הנתונים בוצע עם קבלתו, לפי הנוחות. מספר נסיבות בלתי צפויות הובילו לעיכובים בזמן ?...

MALDI-TOF 1,2,3 היא טכניקה נפוצה לאפיון ו/או זיהוי של מולקולות בגדלים ומאפיינים שונים. חלק מהשימושים בו כוללים יישומים מגוונים כגון איתור טאנינים ממשאבי טבע4, מטבוליטים של הדמיה במזון5, גילוי או ניטור של מטרות או סמנים של תרופות תאיות6, ואבחון קליני7, אם להזכיר כמה. הרלוונטיות לעבודה הנוכחית היא השימוש ב-MALDI-TOF עם DNA או RNA, כאשר השימוש בו על אוליגונוקלאוטידים מתוארך ליותר משלושה עשורים8, שם צוינו מספר מגבלות. טכניקה זו התפתחה כעת לאמצעי אמין ונפוץ לאפיון שני הביופולימרים9 ולזיהוי/הבנה של תגובות כימיות וביוכימיות, למשל, אפיון של אתרים מוקפים ברנ"א10, זיהוי שברי RNA בעקבות ביקוע גדיל 11,12, או יצירת קשרים צולבים בין חלבון לדנ"א13 . לפיכך, חשוב להמחיש ולהדגיש היבטים חשובים של שימוש בטכניקה זו. היסודות של MALDI-TOF תוארו בפורמט וידאו גםכן 14 ולא יפורטו עוד יותר כאן. יתר על כן, היישום שלו בהקשר של דנ"א או חלבון תואר בעבר והודגם בפורמט האמור 15,16,17.
הפרוטוקול לאיתור מקטעי RNA שנוצרו לאחר הידרוליזה אנזימטית מדווח כאן. המודל הניסיוני נבחר על סמך ממצא שפורסם לאחרונה על ידי הקבוצה שלנו18, שבו MALDI-TOF שימש כדי לקבוע את התגובתיות הייחודית בין exoribonuclease Xrn-1 לבין oligonucleotides של RNA המכיל את הנגע החמצוני 8-oxoG. גדילי 20 הנוקלאוטידים הארוכים התקבלו באמצעות סינתזה של פאזה מוצקה19, [5'-CAU GAA ACA ACA A(8-oxoG)G CUA AAA GU] ו-[5'-CAU GAA ACA ACA A(8-oxoG)(8-oxoG) CUA AAA GU], בעוד ש-Xrn-1 הובטא וטוהר בעקבות דו"ח20 שתואר קודם לכן. בקצרה, Xrn-121 הוא אקסוריבונוקלאז 5'-3' עם תפקידים ביולוגיים מרכזיים שונים המפרקים סוגים רבים של RNA, כולל RNA22 מחומצן. נמצא כי התהליכיות של האנזים מתעכבת כאשר נתקלים ב-8-oxoG, מה שהוביל למקטעי RNA המכילים 5'-קצוות זרחניים [5'-H 2 PO4-(8-oxoG)G CUA AAA GU], [5'-H2PO4-(8-oxoG)(8-oxoG) CUA AAA GU], ו-[5'-H2PO4-(8-oxoG) CUA AAA GU]18.
לבסוף, חשוב לציין כי ספקטרומטריית מסות היא שיטה רבת עוצמה, שבאמצעות מתודולוגיות שונות, ניתן להתאים אותה למטרות אחרות23,24; לפיכך, בחירת שיטת היינון הנכונה, כמו גם מערך ניסיוני אחר, היא בעלת חשיבות עליונה.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.6 mL MCT Graduated Violet</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>05-408-127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6&#8217;-Trihydroxyacetophenone monohydrate 98%</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>480-66-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile 99.9%, HPLC grade</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>75-05-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adenosine triphosphate, 10 mM</td>
			<td>New Englang Bioscience</td>
			<td>P0756S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium citrate, dibasic 98%</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>3012-65-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium Fluoride 98.0%, ACS grade</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>12125-01-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bruker bacterial test standard</td>
			<td>Bruker Daltonics</td>
			<td>8255343</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Commercial source of Xrn-1</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>M0338S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diethyl pyrocarbonate, 97%</td>
			<td>ACROS Organics</td>
			<td>A0368487</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flex analysis software</td>
			<td>Bruker daltonics</td>
			<td></td>
			<td>FlexAnalysis software version 3.4, Bruker Daltonics</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lambda 365 UV-vis spectrophotometer</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MALDI plate: MSP 96 ground steel target</td>
			<td>Bruker Daltonics</td>
			<td>280799</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mass Spectrometer</td>
			<td>Bruker</td>
			<td></td>
			<td>Microflex LRFTOF mass spectrometer (Bruker Daltonics, Billerica, MA)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mili-Q IQ 7000</td>
			<td>Milipore Sigma</td>
			<td></td>
			<td>A Mili-Q system was used to purify all water used in this work</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanosep Centrifugal Devices with OmegaTM Membrane 10 K, blue (24/pkg)</td>
			<td>Pall Corporation</td>
			<td>OD010C33</td>
			<td>filter media, Omega (modified polyethersulfone) 10 K pore size</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEBuffer 3</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>B7003S</td>
			<td>This is solution B</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oligo Analyzer tool</td>
			<td>IDT-DNA</td>
			<td></td>
			<td>https://www.idtdna.com/calc/analyzer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tips P10</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02-707-441</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tips P200</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02-707-419</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase Away</td>
			<td>Molecular BioProducts</td>
			<td>7005-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 Polynucleotide Kinase</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>M0201S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 Polynucleotide Kinase Reaction Buffer</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>B0201S</td>
			<td>This is solution A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triflouroacetic Acid</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>76-05-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xrn-1 exoribonuclease</td>
			<td>Expressed in house</td>
			<td>See ref. 20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZipTip Pipette Tips for Sample preparation</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>ZTC 18S 096</td>
			<td>10 &#181;L pipette tips loaded with a C18 standard 0.6 &#181;L bed</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

identification of rna fragments resulting from enzymatic degradation using maldi-tof mass spectrometry

רנ"א הוא ביופולימר הנמצא בכל תחומי החיים, והאינטראקציות שלו עם מולקולות אחרות ו/או מינים תגובתיים אחרים, למשל דנ"א, חלבונים, יונים, תרופות ורדיקלים חופשיים, נמצאות בכל מקום. כתוצאה מכך, הרנ"א עובר תגובות שונות הכוללות את הבקיעה, ההתפרקות או השינוי שלו, מה שמוביל למינים רלוונטיים מבחינה ביולוגית עם פונקציות והשלכות שונות. דוגמה אחת היא חמצון של גואנין ל-7,8-דיהידרו-8-אוקסוגואנין (8-oxoG), שעשוי להתרחש בנוכחות מיני חמצן תגובתי (ROS). באופן כללי, נהלים המאפיינים מוצרים ותמורות כאלה הם בעלי ערך רב לקהילה המדעית. לשם כך, ספקטרומטריית מסה של יינון יינון לייזר בסיוע מטריצה (MALDI-TOF) היא שיטה נפוצה. הפרוטוקול הנוכחי מתאר כיצד לאפיין שברי RNA שנוצרו לאחר טיפול אנזימטי. המודל שנבחר משתמש בתגובה בין RNA לבין exoribonuclease Xrn-1, שבו העיכול האנזימטי נעצר באתרים מחומצנים. שני רצפי RNA באורך 20 נוקלאוטידים [5'-CAU GAA ACA A(8-oxoG)G CUA AAA GU] ו-[5'-CAU GAA ACA ACA A(8-oxoG)(8-oxoG) CUA AAA GU] התקבלו באמצעות סינתזה של פאזה מוצקה, כומתו על ידי ספקטרוסקופיית UV-vis, ואופיינו באמצעות MALDI-TOF. הגדילים שהתקבלו היו אז (1) 5'-זרחן ואופיינו באמצעות MALDI-TOF; (2) מטופל ב-Xrn-1; (3) מסונן ומתופל; (4) נותח באמצעות MALDI-TOF. מערך ניסוי זה הוביל לזיהוי חד משמעי של השברים הקשורים לעיכוב של Xrn-1: [5'-H2PO4-(8-oxoG)G CUA AAA GU], [5'-H2PO4-(8-oxoG)(8-oxoG) CUA AAA GU], ו-[5'-H2PO4-(8-oxoG) CUA AAA GU]. הניסויים המתוארים בוצעו עם 200 פיקומולים של RNA (20 pmol המשמשים לניתוחי MALDI); עם זאת, כמויות נמוכות יותר עשויות לגרום לשיאים הניתנים לזיהוי עם ספקטרומטרים המשתמשים במקורות לייזר עם יותר כוח מזה המשמש בעבודה זו. חשוב לציין כי ניתן להכליל את המתודולוגיה המתוארת ולהרחיב אותה באופן פוטנציאלי לזיהוי מוצרים עבור תהליכים אחרים המערבים רנ"א ודנ"א, ועשויה לסייע באפיון/הבהרה של מסלולים ביוכימיים אחרים.

האוליגונוקלאוטידים ששימשו בעבודה זו סונתזו, אופיינו וכימתו לפני השימוש. הריכוז של כל האוליגונוקלאוטידים נקבע באמצעות ספקטרוסקופיה UV-vis שנרשמה ב-90 מעלות צלזיוס כדי למנוע קריאות שגויות הנובעות מההיווצרות הפוטנציאלית של המבנים המשניים. איור 3 מציג את הספקטרום של המודל ...

Watch this Scientific Journal Video about Identification of RNA Fragments Resulting from Enzymatic Degradation using MALDI-TOF Mass Spectrometry at JoVE.com

Identification of RNA Fragments Resulting from Enzymatic Degradation using MALDI-TOF Mass Spectrometry

MALDI-TOF שימש לאפיון שברים שהתקבלו מהתגובתיות בין RNA מחומצן לבין exoribonuclease Xrn-1. הפרוטוקול הנוכחי מתאר מתודולוגיה שניתן ליישם על תהליכים אחרים המערבים רנ"א ו/או דנ"א.

זיהוי שברי RNA כתוצאה מהשפלה אנזימטית באמצעות ספקטרומטריית מסה MALDI-TOF

RNA is a biopolymer present in all domains of life, and its interactions with other molecules and/or reactive species, e.g., DNA, proteins, ions, drugs, ...

ספקטרומטריית מסות אומצה באופן נרחב ליישומים שונים. המתודולוגיה במאמר זה מספקת את האפיון החד משמעי של מקטעי RNA המתקבלים מתהליך אנזימטי במבחנה. היתרונות של טכניקה זו כוללים את קבלת שיא הברזל של המולקולה, כי הניסויים יכולים להתבצע עם כמויות קטנות של חומר עבור יישומים במבחנה, וכי ניתן לבצע את הפרוטוקול עם אימון מינימלי.ניתן ליישם את המתודולוגיה המתוארת באופן נרחב בתהליכי מחקר המערבים דנ"א, רנ"א או חלבונים. דוגמאות לכך כוללות טרנספורמציות ביוכימיות כגון מידע צולב, זיהוי שינויים כימיים, או אינטראקציות ותגובתיות ביופולימריות אחרות. קושי אחד יכול להתרחש מהנגישות לספקטרומטר MALDI או למתקני ליבה המציעים שירות זה.היבט נוסף הוא קביעת מגבלת הזיהוי שעשויה להיות גבוהה או נמוכה יותר בהתאם למכשיר. כדי להתחיל, הפעל את הספקטרופוטומטר UV-Vis, ולאחר מכן לחץ על סמל PerkinElmer UV WinLab כדי לפתוח את חלון בקרת פעולת המכשיר. הפעל את הספקטרופוטומטר של בקר הטמפרטורה Peltier באמצעות המתג הממוקם מימין למכשיר ולחץ על Scan-Lambda 365, הנמצא תחת שיטות בסיס.מסך נוסף ייפתח ויבקש מהמשתמש לוודא שמחזיקי התאים ריקים. לחץ על אישור ואפשר למכשיר לבצע את בדיקות המערכת שלו. כעת, התאם את פרמטרי הסריקה על-ידי בחירה באיסוף נתונים.בחלון החדש תחת הגדרות סריקה, שנה את ההתחלה ל-350 ננומטר ואת הסוף ל-215 ננומטר. הפעל את ה- Peltier על-ידי בחירת הפלוס משמאל לאביזר. לאחר מכן לחץ על Multi Cell Peltier, שנה את מעלות הטמפרטורה צלזיוס ל- 25, ולחץ על Peltier On.נווט לכרטיסיית המידע לדוגמה והזן את מספר הדגימות, השמות ומיקום התא הרצויים.לחץ על Autozero והוסף את הקובט המכיל את פתרון הרקע. לחץ על התחל והכנס את הקובטה לתא הרצוי וודא שחלון הקובטה מכוון במקביל לפנים הקדמיות של המכשיר. כעת, לחץ על אישור כדי להתחיל את הסריקה הראשונה ב 25 מעלות צלזיוס.למדידות בטמפרטורות גבוהות יותר, לחצו על Multi Cell Peltier, שנו את הטמפרטורה לטמפרטורת הדגימה הרצויה ושחקו על הסריקה. לחץ על קובץ, ייצא ובחר את מיקום הקובץ הרצוי ובחר XY Data כדי להשיג קובץ טקסט. כדי לבצע 5'פוספורילציה של רנ"א, הכינו תמיסה בצינור מיקרו צנטריפוגה של 0.6 מיקרוליטרים על ידי הוספת 33.5 מיקרוליטרים מים נטולי RNase, חמישה מיקרוליטרים של תמיסה A, שישה מיקרוליטים של 10 אדנוזין טריפוספט מילימולרי, מיקרוליט אחד של 200 מיקרומולרים RNA תמיסה מימית, ו-4.5-מיקרוליטרים של פולינוקלאוטיד קינאז וערבבו את התמיסה בעדינות.דגירה של תערובת התגובה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 45 דקות על ידי הנחתה באמבטיית מים. לאחר מכן השבתת האנזים על ידי הצבת צינור התגובה בבלוק חום, שחומם מראש ב-65 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות. אפשרו לתמיסה להתקרר לטמפרטורת החדר כדי להניב תמיסת RNA סופית של 5'phosphorylated.לאחר הדגירה, השתמש ב-50 מיקרוליטרים של פתרון זה, הוסף חמישה מיקרוליטרים של פתרון B, וחמישה מיקרוליטרים של תמיסת 1-femtomole של Xrn-1 כדי לבצע הידרוליזה של RNA. דגירה של צינור התגובה בטמפרטורת החדר למשך שעתיים. מעבירים את תערובת התגובה הזו למכשיר צנטריפוגלי בגודל נקבובית של 10 קילודלטון ומסננים את האנזימים על ידי צנטריפוגה למשך 10 דקות ב-700 פעמים G.העבירו את התסיס לתוך צינור צנטריפוגה של 0.6 מיליליטר.לאחר מכן, הוסיפו 20 מיקרוליטרים של מים נטולי RNase כדי לשטוף את שאריות הרנ"א על הצינור הצנטריפוגלי, ולאחר מכן צנטריפוגה. לבסוף, שלבו את התסיס הזה עם התסיס המתקבל שהושג בעבר על ידי צנטריפוגה במכשיר צנטריפוגלי בגודל נקבובית של 10 קילודלטון, והקפיאו את התמיסה באפס מעלות צלזיוס או ספינה לניתוח. כדי להתפלות ולרכז את הדגימה, השתמש בקצות פיפטה של החלפת קטיונים C18 הזמינים מסחרית, הטעונים במצע של מדיית כרומטוגרפיה C18 בקצהה.לשם כך, מקם את קצה הפיפטה של 10 מיקרוליטר על פיפטה של 10 מיקרוליטר ושטף את הקצה הזה פעמיים עם תמיסת אצטיל ניטריל מימית של 50%. השליכו את הנפחים המשומשים לתוך צינור פסולת נפרד בכל פעם ושיזבו את קצה C18 עם 10 מיקרוליטרים של תמיסת חומצה תלת-פלואורואצטית מימית של 0.1% פעמיים. הסירו ידנית את קצה ה-C18 מהפיפטה והצמידו אותו לפיפטה של 200 מיקרוליטר המכילה קצה פיפטה P200.לאחר מכן לטבול את קצה C18 לתוך התמיסה המתקבלת שהוכנה במהלך הידרוליזה של אוליגונוקלאוטידים של RNA על ידי Xrn-1 ולשאוף לשחרר את התמיסה דרך קצה C18 10 פעמים. כעת, נתקו את קצה ה-C18 מהפיפטה P200, מיקמו אותו לפיפטה של 10 מיקרוליטר ושטפו את קצה ה-C18 באמצעות תמיסה מימית של תמיסת חומצה טריפלואורואצטית של 0.1% פעמיים. יש להשליך את אמצעי האחסון המשומשים לצינור פסולת נפרד בכל פעם.שטפו את קצה ה-C18 עם מים נטולי RNase של 10 מיקרוליטרים פעמיים. לצורך תצפית על לוחית ה-MALDI, יש להבהיר את ה-RNA oligonucleotide מקצה ה-C18 על ידי טבילת הדגימה לתוך המטריצה הרצויה והעברת התמיסה בחזרה לתוך הצינור 10 פעמים. פיפטה את התמיסה הזו על שני כתמים נפרדים של מיקרוליטר אחד כל אחד על הצלחת ומאפשרת לכתמים להתייבש באוויר.ריכוז הרנ"א ששימש בעבודה זו נקבע באמצעות ספקטרוסקופיה של UV-Visible שנרשמה ב-90 מעלות צלזיוס כדי למנוע קריאות שגויות הנובעות מהיווצרות פוטנציאלית של המבנים המשניים. רצף האירועים הכולל כלל שני חלקים. האחד, 5'phosphorylation יעיל של RNA, עדות לכך היא הופעתו של שיא אחד בלבד המתאים למוצר הצפוי.ושתיים, שבר ההשהיה הנובע מהטיפול בתערובת הדגימה עם Xrn-1. אותן תוצאות התקבלו באמצעות רצף שונה שהכיל שני נגעים חמצוניים. שינויים אפשריים שיש לקחת בחשבון כוללים ביטול השימוש בהתקן הסינון או התחשבות במטריצות שונות לאיתור MALDI.לדוגמה, חומצה סינפינית או חומצה פיקולינית. שברי הרנ"א התקבלו מתהליך אנזימטי. תהליך זה הוקם על ידי צימוד MALDI, אנליזה אלקטרופורטית, סינתזה של פאזה מוצקה ודיכרואיזם מעגלי.לפרוטוקול המתואר יש פוטנציאל לשמש בתחומים שונים, החל ממחקר במדעי הכימיה וכלה ביישומים בתחום הביו-רפואי.

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Cell Biology

Biochemistry

Unit 1

Analyzing Cells and Proteins

SCIENTISTS IN ACTION

Time-resolved ElectroSpray Ionization Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry for Studying Protein Structure and Dynamics

המרת מימן-דאוטריום electrospray יינון זמן נפתרה ספקטרומטריית מסה לימוד מבנה החלבון Dynamics

Intrinsically disordered proteins (IDPs) have long been a challenge to structural biologists due to their lack of stable secondary structure elements. ...

Resolving Affinity Purified Protein Complexes by Blue Native PAGE and Protein Correlation Profiling

פתרון מתחמי פרוטאין טהור זיקה לפי דף Native הכחול פרופיל מתאם חלבון

Most proteins act in association with others; hence, it is crucial to characterize these functional units in order to fully understand biological ...

Lipid Droplet Isolation for Quantitative Mass Spectrometry Analysis

בידוד אגל ליפידים על ניתוח כמותי ספקטרומטריית מסה

Lipid droplets are vital to the replication of a variety of different pathogens, most prominently the Hepatitis C Virus (HCV), as the putative site of ...

Sample Preparation for Mass Spectrometry-based Identification of RNA-binding Regions

הכנת הדוגמא לזיהוי מבוססי ספקטרומטר מסה של RNA-איגוד אזורים

Noncoding RNAs play important roles in several nuclear processes, including regulating gene expression, chromatin structure, and DNA repair. In most ...

The Determination of Protease Specificity in Mouse Tissue Extracts by MALDI-TOF Mass Spectrometry: Manipulating PH to Cause Specificity Changes

קביעת כמות מועטת פרוטאז ברקמת העכבר של תמציות באמצעות ספקטרומטר מסה MALDI-תוף: מניפולציה PH כדי לגרום לשינויים ירידה לפרטים

Proteases have several biological functions, including protein activation/inactivation and food digestion. Identifying protease specificity is important ...

Proofreading and DNA Repair Assay Using Single Nucleotide Extension and MALDI-TOF Mass Spectrometry Analysis

הגהה ואת וזמינותו תיקון ה-DNA באמצעות ניתוח ספקטרומטר מסה MALDI-TOF והסיומת נוקלאוטיד יחיד

The maintenance of the genome and its faithful replication is paramount for conserving genetic information. To assess high fidelity replication, we have ...

Analyzing Dynamic Protein Complexes Assembled On and Released From Biolayer Interferometry Biosensor Using Mass Spectrometry and Electron Microscopy

ניתוח דינאמי חלבון מתחמי נאסף בנושא ושוחרר מן Biolayer אינטרפרומטריה ביוסנסור באמצעות ספקטרומטר מסה ואלקטרון

In vivo, proteins are often part of large macromolecular complexes where binding specificity and dynamics ultimately dictate functional outputs. In this ...

Capture and Identification of RNA-binding Proteins by Using Click Chemistry-assisted RNA-interactome Capture (CARIC) Strategy

Capture and Identification of RNA-binding Proteins by Using Click Chemistry-assisted RNA-interactome Capture CARIC Strategy

לכידת וזיהוי של RNA-מחייב חלבונים באמצעות לחץ בסיוע כימיה RNA-interactome ללכוד אסטרטגיה (CARIC)

A comprehensive identification of RNA-binding proteins (RBPs) is key to understanding the posttranscriptional regulatory network in cells. A widely used ...

Using the Open-Source MALDI TOF-MS IDBac Pipeline for Analysis of Microbial Protein and Specialized Metabolite Data

באמצעות מקור פתוח MALDI תוף-MS IDBac הניתוח של חלבון מיקרוביאלית ונתונים מיוחדים מטבוליט

In order to visualize the relationship between bacterial phylogeny and specialized metabolite production of bacterial colonies growing on nutrient agar, ...

Nitropeptide Profiling and Identification Illustrated by Angiotensin II

ניטרופפטיד פרופיל וזיהוי מאויר על ידי אנגיוטנסין השני

Protein nitration is one of the most important post-translational modifications (PTM) on tyrosine residues and it can be induced by chemical actions of ...