Name: identification of rna fragments resulting from enzymatic degradation using maldi-tof mass spectrometry
Uploaded: 2022-04-11T14:00:00
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이 작업은 세 기관, 두 연구 그룹 및 하나의 핵심 시설 간의 공동 노력이라는 점에 유의해야합니다. 분배 및 작업량은 다음과 같이 수행되었다: 단백질 (Xrn-1) 발현은 덴버 대학 (Denver, CO)에서 수행되었다. 올리고뉴클레오티드 합성, 정량화 및 실험(주로 효소적 분해)은 콜로라도 덴버 대학(Denver, CO)에서 수행되었다. 최적화도 거기에서 수행되었습니다. MALDI-TOF 탐지, 인수 및 분석은 콜로라도 주립 대학의 분석 자원 핵심 시설에서 수행되었습니다. (포트 콜린스, CO). SS는 UROP 어워드(CU Denver)와 유레카 보조금(CU Denver)을 인정하여 지원을 받고 싶습니다. E. G.C.는 R00GM115757 을 통해 NIGMS의 지원을 인정합니다. MJER는 1R15GM132816 을 통해 NIGMS의 지원을 인정합니다. K.B.는 리소스 ID: SCR_021758을 승인합니다. 이 작품은 또한 Henry Dreyfus Foundation의 교사 - 학자 상 (MJER), TH-21-028에 의해 지원되었습니다.

RNase-무함유 초순수 (표 1)를 본 연구에 사용하였다.
1. RNA 용액의 농도 결정
<ol><li>아래 단계에 따라 RNA 샘플을 준비한다.<ol>
<li>마이크로 원심분리 튜브 (0.6 mL)를 사용하여 RNase-free H2O. 159 μL의 RNase-freeH2O.를 넣고 19 μL의 원액을 희석하여 RNA 용액을 제조하였다 (10x). 참고: 다양한 큐벳이 상용화되어 있기 때문에 필요?...

<ol>
	<li>Tanaka, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+and+polymer+analyses+up+to+m/z+100+000+by+laser+ionization+time-of-flight+mass+spectrometry.">Protein and polymer analyses up to m/z 100 000 by laser ionization time-of-flight mass spectrometry.</a> Rapid Communications in Mass Spectrometry. 2 (8), 151-153 (1988).</li><li>Karas, M., Hillenkamp, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+desorption+ionization+of+proteins+with+molecular+masses+exceeding+10,000+daltons.">Laser desorption ionization of proteins with molecular masses exceeding 10,000 daltons.</a> Analytical Chemistry. 60 (20), 2299-2301 (1988).</li><li>Zenobi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemistry+nobel+prize+2002+goes+to+analytical+chemistry.">Chemistry nobel prize 2002 goes to analytical chemistry.</a> Chimia. 57, 73 (2003).</li><li>Aristri, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bio-based+polyurethane+resins+derived+from+tannin:+Source,+synthesis,+characterization,+and+application.">Bio-based polyurethane resins derived from tannin: Source, synthesis, characterization, and application.</a> Forests. 12 (11), 1516 (2021).</li><li>Pedrazzani, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=5-n-Alkylresorcinol+profiles+in+different+cultivars+of+einkorn,+emmer+spelt,+common+wheat,+and+tritordeum.">5-n-Alkylresorcinol profiles in different cultivars of einkorn, emmer spelt, common wheat, and tritordeum.</a> Journal of Agricultural and Food Chemistry. 69 (47), 14092-14102 (2021).</li><li>Unger, M. S., Blank, M., Enzlein, T., Hopf, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Label-free+cell+assays+to+determine+compound+uptake+or+drug+action+using+MALDI-TOF+mass+spectrometry.">Label-free cell assays to determine compound uptake or drug action using MALDI-TOF mass spectrometry.</a> Nature Protocols. 16 (12), 5533-5558 (2021).</li><li>Croxatto, A., Prod'hom, G., Greub, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Applications+of+MALDI-TOF+mass+spectrometry+in+clinical+diagnostic+microbiology.">Applications of MALDI-TOF mass spectrometry in clinical diagnostic microbiology.</a> FEMS Microbiology Reviews. 36 (2), 380-407 (2012).</li><li>Kaufmann, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Marrix-assisted+laser+desorption+ionization+(MALDI)+mass+spectrometry:+a+novel+analytical+tool+in+molecular+biology+and+biotechnology.">Marrix-assisted laser desorption ionization (MALDI) mass spectrometry: a novel analytical tool in molecular biology and biotechnology.</a> Journal of Biotechnology. 41 (2-3), 155-175 (1995).</li><li>Kiggins, C., Skinner, A., Resendiz, M. J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=8-Oxo-7,8-dihydroguanosine+inhibits+or+changes+the+selectivity+of+the+theophylline+aptamer.">8-Oxo-7,8-dihydroguanosine inhibits or changes the selectivity of the theophylline aptamer.</a> ChemBioChem. 21 (9), 1347-1355 (2020).</li><li>Chapman, E. G., DeRose, V. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzymatic+processing+of+platinated+RNAs.">Enzymatic processing of platinated RNAs.</a> Journal of the American Chemical Society. 132 (6), 1946-1952 (2010).</li><li>Resendiz, M. J. E., Pottiboyina, V., Sevilla, M. D., Greengerg, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+strand+scission+in+double+stranded+RNA+via+a+C5-pyrimidine+radical.">Direct strand scission in double stranded RNA via a C5-pyrimidine radical.</a> Journal of the American Chemical Society. 134 (8), 3917-3924 (2012).</li><li>Joyner, J. C., Keuper, K. D., Cowan, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+RNA+cleavage+by+MALDI-TOF+mass+spectrometry.">Analysis of RNA cleavage by MALDI-TOF mass spectrometry.</a> Nucleic Acids Research. 41 (1), 2 (2013).</li><li>Ghodke, P. P., Guengerich, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+polymerases+&#951;+and+&#954;+bypass+N2-guanine-O6-alkylguanine+DNA+alkyltransferase+cross-linked+DNA+peptides.">DNA polymerases &#951; and &#954; bypass N2-guanine-O6-alkylguanine DNA alkyltransferase cross-linked DNA peptides.</a> Journal of Biological Chemistry. 297 (4), 101124 (2021).</li><li>JoVE. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=JoVE+Science+Education+Database.+Biochemistry.+MALDI-TOF+Mass+Spectrometry.">JoVE Science Education Database. Biochemistry. MALDI-TOF Mass Spectrometry.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2021).</li><li>Schr&#246;tner, P., Gunzer, F., Sch&#252;ppel, J., Rudolph, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+rare+bacterial+pathogens+by+16S+rRNA+gene+sequencing+and+MALDI-TOF+MS.">Identification of rare bacterial pathogens by 16S rRNA gene sequencing and MALDI-TOF MS.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (113), e53176 (2016).</li><li>Su, K. -. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proofreading+and+DNA+repair+assay+using+single+nucleotide+extension+and+MALDI-TOF+mass+spectrometry+analysis.">Proofreading and DNA repair assay using single nucleotide extension and MALDI-TOF mass spectrometry analysis.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (136), e57862 (2018).</li><li>Fagerquist, C. K., Rojas, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+antibacterial+immunity+proteins+in+Escherichia+coli+using+MALDI-TOF-TOF-MS/MS+and+Top-Down+proteomic+analysis.">Identification of antibacterial immunity proteins in Escherichia coli using MALDI-TOF-TOF-MS/MS and Top-Down proteomic analysis.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (171), e62577 (2021).</li><li>Phillips, C. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Processing+of+RNA+containing+8-Oxo-7,8-dihydroguanosine+(8-oxoG)+by+the+exoribonuclease+Xrn-1.">Processing of RNA containing 8-Oxo-7,8-dihydroguanosine (8-oxoG) by the exoribonuclease Xrn-1.</a> Frontiers in Molecular Biosciences. 8, 780315 (2021).</li><li>Francis, A. J., Resendiz, M. J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protocol+for+the+solid-phase+synthesis+of+oligomers+of+RNA+containing+a+2'-O-thiophenylmethyl+modification+and+characterization+via+circular+dichroism.">Protocol for the solid-phase synthesis of oligomers of RNA containing a 2'-O-thiophenylmethyl modification and characterization via circular dichroism.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (125), e56189 (2017).</li><li>Langeberg, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biochemical+characterization+of+yeast+Xrn1.">Biochemical characterization of yeast Xrn1.</a> Biochemistry. 59 (15), 1493-1507 (2020).</li><li>Stevens, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+and+characterization+of+a+Saccharomyces+cerevisiae+exoribonuclease+which+yields+5'-mononucleotides+by+a+5'+leads+to+3'+mode+of+hydrolysis.">Purification and characterization of a Saccharomyces cerevisiae exoribonuclease which yields 5'-mononucleotides by a 5' leads to 3' mode of hydrolysis.</a> Journal of Biological Chemistry. 255 (7), 3080-3085 (1980).</li><li>Yan, L. L., Simms, C. L., McLoughlin, F., Vierstra, R. D., Zaher, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxidation+and+alkylation+stresses+activate+ribosome-quality+control.">Oxidation and alkylation stresses activate ribosome-quality control.</a> Nature Communications. 10 (1), 5611 (2019).</li><li>Fasnacht, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+23S+rRNA+modification+ho5C2501+benefits+Escherichia+coli+under+oxidative+stress.">Dynamic 23S rRNA modification ho5C2501 benefits Escherichia coli under oxidative stress.</a> Nucleic Acids Research. 50 (1), 473-489 (2022).</li><li>Estevez, M., Valesyan, S., Jora, M., Limbach, P. A., Addepalli, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxidative+damage+to+RNA+is+altered+by+the+presence+of+interacting+proteins+or+modified+nucleosides.">Oxidative damage to RNA is altered by the presence of interacting proteins or modified nucleosides.</a> Frontiers in Molecular Biosciences. 8, 697149 (2021).</li><li>Tomar, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+sequence+modulates+the+efficiency+of+NEIL1-catalyzed+excision+of+the+aflatoxin+B1-induced+formamidopyrimidine+guanine+adduct.">DNA sequence modulates the efficiency of NEIL1-catalyzed excision of the aflatoxin B1-induced formamidopyrimidine guanine adduct.</a> Journal of the American Chemical Society. 34 (3), 901-911 (2021).</li><li>Gaffney, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV-1+env-dependent+cell+killing+by+bifunctional+small-molecule/peptide+conjugates.">HIV-1 env-dependent cell killing by bifunctional small-molecule/peptide conjugates.</a> ACS Chemical Biology. 16 (1), 193-204 (2021).</li><li>Sikorski, E. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+display+of+a+chemoattractant+agonist+on+cancer+cells+activates+the+formyl+peptide+receptor+1+on+immune+cells.">Selective display of a chemoattractant agonist on cancer cells activates the formyl peptide receptor 1 on immune cells.</a> ChemBioChem. , 202100521 (2022).</li><li>Kubo, T., Nishimura, Y., Sato, Y., Yanagihara, K., Seyama, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sixteen+different+types+of+lipid-conjugated+siRNAs+containing+saturated+and+unsaturated+fatty+Acids+and+exhibiting+enhanced+RNAi+potency.">Sixteen different types of lipid-conjugated siRNAs containing saturated and unsaturated fatty Acids and exhibiting enhanced RNAi potency.</a> ACS Chemical Biology. 16 (1), 150-164 (2021).</li></ol>

이 워크플로우의 주요 과제는 실험을 마무리하고 질량 분광 분석을 수행하는 사이에 있었습니다. 실험은 콜로라도 덴버 대학에서 수행되고 완료되었으며 콜로라도 주립 대학 시설로 (하룻밤) 운송되었습니다. 데이터 수집은 편의에 따라 수령시 수행되었습니다. 몇 가지 예기치 않은 상황으로 인해 프로세스가 시간 지연되었습니다. 일례로, 예상치 못한 기기 오작동으로 인해 시료를 발견하거나 ?...

MALDI-TOF 1,2,3은 다양한 크기와 특성을 가진 분자의 특성화 및/또는 검출을 위해 널리 사용되는 기술입니다. 그것의 용도 중 일부는 천연 자원으로부터의 탄닌 검출4, 식품5의 대사 산물 이미징, 세포 약물 표적 또는 마커6의 발견 또는 모니터링, 임상 진단7과 같은 다양한 응용을 포함한다. 본 연구와 관련성 중 하나는 MALDI-TOF를 DNA 또는 RNA와 함께 사용하는 것이며, 올리고뉴클레오티드에 대한 사용은 삼십 년8 이상으로 거슬러 올라가며, 몇 가지 한계가 지적되었다. 이 기술은 이제 바이오폴리머(9)를 특성화하고 화학적 및 생화학적 반응, 예를 들어 RNA 10에서 도금된 부위의 특성화, 가닥 절단11,12에 따른 RNA 단편의 확인, 또는 단백질-DNA 가교결합의 형성(13)을 식별/이해하기 위해 신뢰할 수 있고 일반적으로 사용되는 수단으로 진화되었다. . 따라서이 기술을 사용하는 중요한 측면을 설명하고 강조하는 것이 중요합니다. MALDI-TOF의 기초는 비디오 포맷 뿐만 아니라도 14에서 설명되었으며, 여기서 더 이상 설명되지 않을 것이다. 더욱이, DNA 또는 단백질 맥락에서의 그의 적용은 상기 포맷15,16,17에 이전에 기술되고 예시되었다.
효소적 가수분해 후에 형성된 RNA 단편을 검출하기 위한 프로토콜이 본원에 보고된다. 실험 모델은 우리 그룹18에 의해 발표 된 최근 발견에 기초하여 선택되었으며, 여기서 MALDI-TOF는 exoribonuclease Xrn-1과 산화 병변 8-oxoG를 포함하는 RNA의 올리고뉴클레오티드 사이의 독특한 반응성을 결정하기 위해 사용되었습니다. 20-뉴클레오티드 긴 가닥을 고체상 합성19를 통해 수득하였고, [5'-CAU GAA ACA A(8-oxoG)G CUA AAA GU] 및 [5'-CAU GAA ACA A(8-oxoG)(8-oxoG) CUA AAA GU], Xrn-1은 앞서 기술된 보고서20에 따라 발현되고 정제되었다. 간단히 말해서, Xrn-121은 산화된 RNA22를 포함한 여러 유형의 RNA를 분해하는 다양한 주요 생물학적 역할을 갖는 5'-3' 엑소리보뉴클레아제이다. 효소의 처리성이 8-oxoG를 만나면 멈추는 것으로 밝혀졌으며, 이는 5'-인산화된 말단[5'-H2PO4-(8-옥소G)G CUA AAA GU], [5'-H2PO4-(8-oxoG)(8-oxoG) cua AAA gu], 및 [5'-H2PO4-(8-oxoG) CUA AAA GU]18을 함유하는 RNA 단편으로 이어졌다.
마지막으로, 질량 분광법은 다양한 방법론을 통해 다른 목적에 적응할 수있는 강력한 방법이라는 점에 유의하는 것이 중요합니다23,24; 따라서 올바른 이온화 방법과 다른 실험 설정을 선택하는 것이 가장 중요합니다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.6 mL MCT Graduated Violet</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>05-408-127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6&#8217;-Trihydroxyacetophenone monohydrate 98%</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>480-66-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile 99.9%, HPLC grade</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>75-05-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adenosine triphosphate, 10 mM</td>
			<td>New Englang Bioscience</td>
			<td>P0756S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium citrate, dibasic 98%</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>3012-65-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium Fluoride 98.0%, ACS grade</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>12125-01-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bruker bacterial test standard</td>
			<td>Bruker Daltonics</td>
			<td>8255343</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Commercial source of Xrn-1</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>M0338S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diethyl pyrocarbonate, 97%</td>
			<td>ACROS Organics</td>
			<td>A0368487</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flex analysis software</td>
			<td>Bruker daltonics</td>
			<td></td>
			<td>FlexAnalysis software version 3.4, Bruker Daltonics</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lambda 365 UV-vis spectrophotometer</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MALDI plate: MSP 96 ground steel target</td>
			<td>Bruker Daltonics</td>
			<td>280799</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mass Spectrometer</td>
			<td>Bruker</td>
			<td></td>
			<td>Microflex LRFTOF mass spectrometer (Bruker Daltonics, Billerica, MA)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mili-Q IQ 7000</td>
			<td>Milipore Sigma</td>
			<td></td>
			<td>A Mili-Q system was used to purify all water used in this work</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanosep Centrifugal Devices with OmegaTM Membrane 10 K, blue (24/pkg)</td>
			<td>Pall Corporation</td>
			<td>OD010C33</td>
			<td>filter media, Omega (modified polyethersulfone) 10 K pore size</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEBuffer 3</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>B7003S</td>
			<td>This is solution B</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oligo Analyzer tool</td>
			<td>IDT-DNA</td>
			<td></td>
			<td>https://www.idtdna.com/calc/analyzer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tips P10</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02-707-441</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tips P200</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02-707-419</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase Away</td>
			<td>Molecular BioProducts</td>
			<td>7005-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 Polynucleotide Kinase</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>M0201S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 Polynucleotide Kinase Reaction Buffer</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>B0201S</td>
			<td>This is solution A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triflouroacetic Acid</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>76-05-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xrn-1 exoribonuclease</td>
			<td>Expressed in house</td>
			<td>See ref. 20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZipTip Pipette Tips for Sample preparation</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>ZTC 18S 096</td>
			<td>10 &#181;L pipette tips loaded with a C18 standard 0.6 &#181;L bed</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

identification of rna fragments resulting from enzymatic degradation using maldi-tof mass spectrometry

RNA는 생명의 모든 도메인에 존재하는 생체 고분자이며, 다른 분자 및 / 또는 반응성 종, 예를 들어 DNA, 단백질, 이온, 약물 및 자유 라디칼과의 상호 작용은 유비쿼터스입니다. 결과적으로, RNA는 절단, 분해 또는 변형을 포함한 다양한 반응을 겪으며 뚜렷한 기능과 함의를 가진 생물학적으로 관련된 종으로 이어집니다. 한 가지 예는 반응성 산소 종 (ROS)의 존재 하에서 발생할 수 있는 7,8-디히드로-8-옥소구아닌 (8-oxoG)에 대한 구아닌의 산화이다. 전반적으로, 그러한 제품과 변형을 특징 짓는 절차는 과학계에 크게 가치가 있습니다. 이를 위해, 매트릭스 보조 레이저 탈착 이온화 비행 시간(MALDI-TOF) 질량 분광법은 널리 사용되는 방법이다. 본 프로토콜은 효소적 처리 후에 형성된 RNA 단편을 특성화하는 방법을 기술한다. 선택된 모델은 RNA와 엑소리보뉴클레아제 Xrn-1 사이의 반응을 사용하며, 여기서 효소 소화는 산화된 부위에서 중단된다. 두 개의 20-뉴클레오티드 긴 RNA 서열 [5'-CAU GAA ACA A(8-oxoG)G CUA AAA GU] 및 [5'-CAU GAA ACA A(8-oxoG)(8-oxoG) CUA AAA GU]를 고상 합성을 통해 수득하고, UV-vis 분광법에 의해 정량하고, MALDI-TOF를 통해 특성화하였다. 수득된 가닥은 이어서 (1) 5'-인산화되고 MALDI-TOF를 통해 특성화되고; (2) Xrn-1로 처리된 단계; (3) 여과 및 탈염; (4) MALDI-TOF를 통해 분석. 이러한 실험적 셋업은 Xrn-1의 실속과 관련된 단편의 명백한 동정을 이끌었다: [5'-H2PO4-(8-옥소G)g cua AAA 구], [5'-H2PO4-(8-옥소G)(8-옥소G) cua aaa gu], 및 [5'-H2PO4-(8-옥소G) cua AAA 구]. 기술된 실험은 200개의 피코몰의 RNA (MALDI 분석에 사용된 20 pmol)로 수행되었다; 그러나 더 적은 양은이 작업에 사용 된 것보다 더 많은 전력을 가진 레이저 소스를 사용하여 분광계로 감지 가능한 피크를 초래할 수 있습니다. 중요하게도, 기술된 방법론은 일반화될 수 있고 잠재적으로 RNA 및 DNA를 포함하는 다른 공정에 대한 생성물 식별로 확장될 수 있고, 다른 생화학적 경로의 특성화/해명에 도움이 될 수 있다.

이 작업에 사용된 올리고뉴클레오티드는 사용 전에 합성, 특성화 및 정량화되었다. 모든 올리고뉴클레오티드의 농도는 이차 구조물의 잠재적 형성으로부터 발생하는 잘못된 판독을 피하기 위해 90°C에서 기록된 UV-vis 분광법을 통해 결정되었다. 도 3은 이 작업에 사용된 RNA의 모델 올리고뉴클레오티드의 스펙트럼을 상온에서 취하고, 열을 가한 후에 측정한 것이다....

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Identification of RNA Fragments Resulting from Enzymatic Degradation using MALDI-TOF Mass Spectrometry

MALDI-TOF는 산화된 RNA와 엑소리보뉴클레아제 Xrn-1 사이의 반응성으로부터 수득된 단편을 특성화하는데 사용되었다. 본 프로토콜은 RNA 및/또는 DNA를 포함하는 다른 공정에 적용될 수 있는 방법론을 기술한다.

MALDI-TOF 질량 분광법을 이용한 효소적 분해로 인한 RNA 단편의 확인

RNA is a biopolymer present in all domains of life, and its interactions with other molecules and/or reactive species, e.g., DNA, proteins, ions, drugs, ...

질량 분광법은 다양한 응용을 위해 널리 채택되어 왔다. 이 기사의 방법론은 시험관내 효소 공정으로부터 수득된 RNA 단편의 명확한 특성화를 제공한다. 이 기술의 장점은 분자 철 피크가 얻어지고, 실험이 시험관내 응용을 위해 소량의 물질로 수행될 수 있고, 프로토콜이 최소한의 훈련으로 달성될 수 있다는 것을 포함한다.기술된 방법론은 DNA, RNA 또는 단백질을 포함하는 연구 과정에 널리 적용될 수 있다. 예에는 교차 정보, 화학적 변형의 확인, 또는 다른 생체중합체 상호작용 및 반응성과 같은 생화학적 변형이 포함된다. 이 서비스를 제공하는 MALDI 분광계 또는 핵심 시설에 대한 접근성에서 한 가지 어려움이 발생할 수 있습니다.또 다른 측면은 계측기에 따라 더 높거나 낮을 수있는 감지 한계를 설정하는 것입니다. 시작하려면 UV-Vis 분광 광도계를 켠 다음 PerkinElmer UV WinLab 아이콘을 클릭하여 기기 작동 제어 창을 엽니 다. 계측기 오른쪽에 있는 스위치를 사용하여 Peltier 온도 컨트롤러 분광광도계를 켜고 기본 방법 아래에 있는 Scan-Lambda 365를 클릭합니다.다른 화면이 열리고 사용자에게 셀 홀더가 비어 있는지 확인하라는 메시지가 표시됩니다. 확인을 클릭하고 계측기가 시스템 검사를 수행하도록 허용합니다. 이제 데이터 수집을 선택하여 스캔 매개 변수를 조정하십시오.스캔 설정 아래의 새 창에서 시작을 350나노미터로, 끝을 215나노미터로 변경합니다. 액세서리 왼쪽에 있는 플러스를 선택하여 펠티에를 활성화합니다. 그런 다음 다중 셀 펠티에를 클릭하고 온도를 섭씨 온도도 25로 변경한 다음 펠티에 온을 클릭합니다.샘플 정보 탭으로 이동하여 원하는 샘플, 이름 및 셀 위치를 입력합니다.Autozero를 클릭하고 배경 솔루션이 들어있는 큐벳을 삽입하십시오. 시작을 클릭하고 원하는 셀에 큐벳을 삽입하고 큐벳 창이 계측기의 앞면과 평행하게 향하도록 합니다. 이제 확인을 클릭하여 섭씨 25도에서 첫 번째 스캔을 시작합니다.더 높은 온도에서 측정하려면 다중 셀 펠티에를 클릭하고 온도를 원하는 샘플 온도로 변경한 다음 스캔을 반복하십시오. 파일, 내보내기를 클릭하고 원하는 파일 위치를 선택하고 XY 데이터를 선택하여 텍스트 파일을 가져옵니다. RNA의 5' 인산화를 수행하기 위해, 33.5-마이크로리터의 RNase-free 물, 5마이크로리터의 용액 A, 10 밀리몰의 아데노신 트리포스페이트의 6마이크로라이트, 200 마이크로몰의 RNA 수용액 1개, 및 4.5-마이크로리터의 폴리뉴클레오티드 키나제를 첨가하여 0.6-마이크로리터 마이크로원심분리 튜브에서 용액을 제조하고, 용액을 부드럽게 혼합한다.반응 혼합물을 섭씨 37도에서 45분 동안 수조에 위치시켜 인큐베이션한다. 그런 다음 반응 튜브를 열 블록에 넣고 섭씨 65도에서 10 분 동안 예열하여 효소를 불활성화시킵니다. 용액을 실온으로 냉각시켜 최종 5'인산화된 RNA 용액을 수득한다.인큐베이션 후,이 용액 50 마이크로 리터를 사용하고, 5 마이크로 리터의 용액 B와 Xrn-1의 1-펨토 몰 용액 5 마이크로 리터를 첨가하여 RNA 가수분해를 수행하십시오. 반응 튜브를 실온에서 두 시간 동안 인큐베이션한다. 이 반응 혼합물을 10-킬로달톤 기공 크기의 원심 장치로 옮기고 여액을 0.6 밀리리터 원심분리 튜브로 옮기고 700 배 G.Transfer 에서 10 분 동안 원심분리하여 효소를 여과하십시오.이어서, 20-마이크로리터의 RNase-free 물을 첨가하여 원심 튜브 상에서 잔류 RNA를 세척한 다음, 원심분리하였다. 마지막으로, 이 여액을 10킬로달톤 공극 크기의 원심 장치에서 원심분리하여 이전에 얻은 결과물 여액과 결합하고, 분석을 위해 용액을 섭씨 영도 또는 선박에서 동결시킨다. 샘플을 탈염하고 농축하려면 시판되는 양이온 교환 C18 피펫 팁에 C18 크로마토그래피 매질의 침대가 로딩된 것을 사용하십시오.이를 위해 10 마이크로 리터 피펫 팁을 10 마이크로 리터 피펫 위에 놓고 50 % 수성 아세틸 니트릴 용액으로이 팁을 두 번 씻으십시오. 사용 된 부피를 매번 별도의 폐관에 버리고 C18 팁을 0.1 % 트리플루오로 아세트산 수용액 10 마이크로 리터로 두 번 평형화하십시오. 피펫에서 C18 팁을 수동으로 분리하여 P200 피펫 팁이 들어있는 200마이크로리터 피펫에 고정합니다.그 후 Xrn-1에 의해 RNA의 올리고뉴클레오티드를 가수분해하는 동안 제조된 생성된 용액에 C18 팁을 침지시키고, 흡인물은 C18 팁을 통해 용액을 10회 방출한다. 이제 P200 피펫에서 C18 팁을 분리하고 10 마이크로 리터 피펫으로 내려 놓은 다음 0.1 % 트리플루오로 아세트산 수용액을 사용하여 C18 팁을 두 번 씻습니다. 사용 된 볼륨을 매번 별도의 폐기물 튜브에 버리십시오.C18 팁을 10 마이크로리터의 RNase가 없는 물로 두 번 세척하십시오. MALDI 플레이트 상에 스팟팅을 위해, 샘플을 원하는 매트릭스에 침지시키고 용액을 다시 튜브 내로 10회 분주함으로써 C18 팁으로부터 RNA 올리고뉴클레오티드를 용출시킨다. 이 용액을 플레이트에 각각 하나의 마이크로 리터의 두 개의 분리 된 지점에 피펫을 꺼내어 반점이 공기 건조되도록하십시오.이 작업에 사용 된 RNA의 농도는 이차 구조의 잠재적 인 형성으로 인해 발생하는 잘못된 판독을 피하기 위해 섭씨 90도에서 기록 된 UV-Visible 분광법을 통해 결정되었습니다. 전체 이벤트 시퀀스에는 두 부분이 포함되었습니다. 하나, RNA의 효율적인 5' 인산화는, 예상 생성물에 상응하는 단 하나의 피크의 출현에 의해 입증된다.및 두 번째로, 샘플 혼합물을 Xrn-1로 처리한 것으로부터 발생하는 실속 단편이다. 동일한 결과가 두 개의 산화성 병변을 포함하는 상이한 서열을 사용하여 수득되었다. 고려해야 할 잠재적 변경에는 필터링 장치의 사용을 제거하거나 MALDI 스포팅을 위한 다른 매트릭스를 고려하는 것이 포함됩니다.예를 들어, 시나핀산 또는 피콜린산. RNA 단편을 효소적 과정으로부터 수득하였다. 이 과정은 결합 MALDI, 전기 영동 분석, 고상 합성 및 원형 이색성에 의해 확립되었다.기술된 프로토콜은 화학 과학 연구에서부터 생물 의학 분야의 응용에 이르기까지 다양한 분야에서 사용될 수 있는 잠재력을 갖는다.

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Analyzing Cells and Proteins

SCIENTISTS IN ACTION

Time-resolved ElectroSpray Ionization Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry for Studying Protein Structure and Dynamics

시간 해결 전기 분무 이온화 수소 - 중수소 교환 질량 분석 단백질 구조와 역학 연구를위한

Intrinsically disordered proteins (IDPs) have long been a challenge to structural biologists due to their lack of stable secondary structure elements. ...

연구

생화학

Resolving Affinity Purified Protein Complexes by Blue Native PAGE and Protein Correlation Profiling

블루 기본 페이지와 단백질 상관 관계 프로파일 링에 의한 선호도 정제 단백질 복합체 해결

Most proteins act in association with others; hence, it is crucial to characterize these functional units in order to fully understand biological ...

Lipid Droplet Isolation for Quantitative Mass Spectrometry Analysis

양적 질량 분광법 분석을위한 지질 물방울 절연

Lipid droplets are vital to the replication of a variety of different pathogens, most prominently the Hepatitis C Virus (HCV), as the putative site of ...

Sample Preparation for Mass Spectrometry-based Identification of RNA-binding Regions

질량 분석 기반 식별 RNA 바인딩 영역에 대 한 샘플 준비

Noncoding RNAs play important roles in several nuclear processes, including regulating gene expression, chromatin structure, and DNA repair. In most ...

The Determination of Protease Specificity in Mouse Tissue Extracts by MALDI-TOF Mass Spectrometry: Manipulating PH to Cause Specificity Changes

마우스 조직에서 효소 특이성 결정 TOF MALDI 질량 분석에 의해 추출: PH 특이성 변경를 조작

Proteases have several biological functions, including protein activation/inactivation and food digestion. Identifying protease specificity is important ...

Proofreading and DNA Repair Assay Using Single Nucleotide Extension and MALDI-TOF Mass Spectrometry Analysis

교정 및 DNA 복구 분석 결과 단일 뉴클레오티드 확장 및 TOF MALDI 질량 분석 분석을 사용 하 여

The maintenance of the genome and its faithful replication is paramount for conserving genetic information. To assess high fidelity replication, we have ...

Analyzing Dynamic Protein Complexes Assembled On and Released From Biolayer Interferometry Biosensor Using Mass Spectrometry and Electron Microscopy

동적 단백질 복합물 분석에 조립 하 고 질량 분석 및 전자 현미경을 사용 하 여 Biolayer 간섭계 바이오 센서에서 발표

In vivo, proteins are often part of large macromolecular complexes where binding specificity and dynamics ultimately dictate functional outputs. In this ...

Capture and Identification of RNA-binding Proteins by Using Click Chemistry-assisted RNA-interactome Capture (CARIC) Strategy

Capture and Identification of RNA-binding Proteins by Using Click Chemistry-assisted RNA-interactome Capture CARIC Strategy

캡처 클릭 화학 기반 RNA 위하여를 사용 하 여 RNA 의무적인 단백질의 포착 (CARIC) 전략

A comprehensive identification of RNA-binding proteins (RBPs) is key to understanding the posttranscriptional regulatory network in cells. A widely used ...

Using the Open-Source MALDI TOF-MS IDBac Pipeline for Analysis of Microbial Protein and Specialized Metabolite Data

미생물 단백질 및 특수 대사 산물 데이터 분석을 위한 오픈 소스 MALDI TOF-MS IDBac 파이프라인 사용

In order to visualize the relationship between bacterial phylogeny and specialized metabolite production of bacterial colonies growing on nutrient agar, ...

Nitropeptide Profiling and Identification Illustrated by Angiotensin II

안지오텐신 II에 의해 설명 니트로 펩티드 프로파일링 및 식별

Protein nitration is one of the most important post-translational modifications (PTM) on tyrosine residues and it can be induced by chemical actions of ...