Name: identification of rna fragments resulting from enzymatic degradation using maldi-tof mass spectrometry
Uploaded: 2022-04-11T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Identification of RNA Fragments Resulting from Enzymatic Degradation using MALDI-TOF Mass Spectrometry at JoVE.com

Det er viktig å merke seg at dette arbeidet var et samarbeid mellom tre institusjoner, to forskningsgrupper og ett kjerneanlegg. Fordelingen og arbeidsmengden ble utført som følger: Proteinuttrykk (Xrn-1) ble utført ved University of Denver (Denver, CO). Oligonukleotidsyntese, kvantifisering og eksperimentering (hovedsakelig enzymatisk nedbrytning) ble utført ved University of Colorado Denver (Denver, CO). Optimalisering ble også utført der. MALDI-TOF spotting, oppkjøp og analyse ble utført ved Analytical Resources Core Facility ved Colorado State University. (Fort Collins, CO). SS ønsker å anerkjenne en UROP Award (CU Denver) og Eureca tilskudd (CU Denver) for støtte. E. G.C. anerkjenner støtte fra NIGMS, via R00GM115757. MJER erkjenner støtte fra NIGMS, via 1R15GM132816. K.B. bekrefter ressurs-ID: SCR_021758. Verket ble også støttet av en Teacher-Scholar Award (MJER), TH-21-028, fra Henry Dreyfus Foundation.

RNasefritt ultra rent vann (tabell 1) ble brukt til denne studien.
1. Konsentrasjonsbestemmelse av RNA-løsning
<ol><li>Forbered RNA-eksemplet ved å følge trinnene nedenfor.<ol>
<li>Bruk et mikrocentrifugerør (0,6 ml) til å lage en løsning av RNA ved å fortynne 1 μL lagerløsning (oppnådd via fastfasesyntese)19 til 159 μL RNase-fri H2O. Bland oppløsningen ved å pipetter blandingen opp og ned gjentatte ga...

<ol>
	<li>Tanaka, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+and+polymer+analyses+up+to+m/z+100+000+by+laser+ionization+time-of-flight+mass+spectrometry.">Protein and polymer analyses up to m/z 100 000 by laser ionization time-of-flight mass spectrometry.</a> Rapid Communications in Mass Spectrometry. 2 (8), 151-153 (1988).</li><li>Karas, M., Hillenkamp, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+desorption+ionization+of+proteins+with+molecular+masses+exceeding+10,000+daltons.">Laser desorption ionization of proteins with molecular masses exceeding 10,000 daltons.</a> Analytical Chemistry. 60 (20), 2299-2301 (1988).</li><li>Zenobi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemistry+nobel+prize+2002+goes+to+analytical+chemistry.">Chemistry nobel prize 2002 goes to analytical chemistry.</a> Chimia. 57, 73 (2003).</li><li>Aristri, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bio-based+polyurethane+resins+derived+from+tannin:+Source,+synthesis,+characterization,+and+application.">Bio-based polyurethane resins derived from tannin: Source, synthesis, characterization, and application.</a> Forests. 12 (11), 1516 (2021).</li><li>Pedrazzani, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=5-n-Alkylresorcinol+profiles+in+different+cultivars+of+einkorn,+emmer+spelt,+common+wheat,+and+tritordeum.">5-n-Alkylresorcinol profiles in different cultivars of einkorn, emmer spelt, common wheat, and tritordeum.</a> Journal of Agricultural and Food Chemistry. 69 (47), 14092-14102 (2021).</li><li>Unger, M. S., Blank, M., Enzlein, T., Hopf, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Label-free+cell+assays+to+determine+compound+uptake+or+drug+action+using+MALDI-TOF+mass+spectrometry.">Label-free cell assays to determine compound uptake or drug action using MALDI-TOF mass spectrometry.</a> Nature Protocols. 16 (12), 5533-5558 (2021).</li><li>Croxatto, A., Prod'hom, G., Greub, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Applications+of+MALDI-TOF+mass+spectrometry+in+clinical+diagnostic+microbiology.">Applications of MALDI-TOF mass spectrometry in clinical diagnostic microbiology.</a> FEMS Microbiology Reviews. 36 (2), 380-407 (2012).</li><li>Kaufmann, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Marrix-assisted+laser+desorption+ionization+(MALDI)+mass+spectrometry:+a+novel+analytical+tool+in+molecular+biology+and+biotechnology.">Marrix-assisted laser desorption ionization (MALDI) mass spectrometry: a novel analytical tool in molecular biology and biotechnology.</a> Journal of Biotechnology. 41 (2-3), 155-175 (1995).</li><li>Kiggins, C., Skinner, A., Resendiz, M. J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=8-Oxo-7,8-dihydroguanosine+inhibits+or+changes+the+selectivity+of+the+theophylline+aptamer.">8-Oxo-7,8-dihydroguanosine inhibits or changes the selectivity of the theophylline aptamer.</a> ChemBioChem. 21 (9), 1347-1355 (2020).</li><li>Chapman, E. G., DeRose, V. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzymatic+processing+of+platinated+RNAs.">Enzymatic processing of platinated RNAs.</a> Journal of the American Chemical Society. 132 (6), 1946-1952 (2010).</li><li>Resendiz, M. J. E., Pottiboyina, V., Sevilla, M. D., Greengerg, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+strand+scission+in+double+stranded+RNA+via+a+C5-pyrimidine+radical.">Direct strand scission in double stranded RNA via a C5-pyrimidine radical.</a> Journal of the American Chemical Society. 134 (8), 3917-3924 (2012).</li><li>Joyner, J. C., Keuper, K. D., Cowan, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+RNA+cleavage+by+MALDI-TOF+mass+spectrometry.">Analysis of RNA cleavage by MALDI-TOF mass spectrometry.</a> Nucleic Acids Research. 41 (1), 2 (2013).</li><li>Ghodke, P. P., Guengerich, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+polymerases+&#951;+and+&#954;+bypass+N2-guanine-O6-alkylguanine+DNA+alkyltransferase+cross-linked+DNA+peptides.">DNA polymerases &#951; and &#954; bypass N2-guanine-O6-alkylguanine DNA alkyltransferase cross-linked DNA peptides.</a> Journal of Biological Chemistry. 297 (4), 101124 (2021).</li><li>JoVE. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=JoVE+Science+Education+Database.+Biochemistry.+MALDI-TOF+Mass+Spectrometry.">JoVE Science Education Database. Biochemistry. MALDI-TOF Mass Spectrometry.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2021).</li><li>Schr&#246;tner, P., Gunzer, F., Sch&#252;ppel, J., Rudolph, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+rare+bacterial+pathogens+by+16S+rRNA+gene+sequencing+and+MALDI-TOF+MS.">Identification of rare bacterial pathogens by 16S rRNA gene sequencing and MALDI-TOF MS.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (113), e53176 (2016).</li><li>Su, K. -. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proofreading+and+DNA+repair+assay+using+single+nucleotide+extension+and+MALDI-TOF+mass+spectrometry+analysis.">Proofreading and DNA repair assay using single nucleotide extension and MALDI-TOF mass spectrometry analysis.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (136), e57862 (2018).</li><li>Fagerquist, C. K., Rojas, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+antibacterial+immunity+proteins+in+Escherichia+coli+using+MALDI-TOF-TOF-MS/MS+and+Top-Down+proteomic+analysis.">Identification of antibacterial immunity proteins in Escherichia coli using MALDI-TOF-TOF-MS/MS and Top-Down proteomic analysis.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (171), e62577 (2021).</li><li>Phillips, C. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Processing+of+RNA+containing+8-Oxo-7,8-dihydroguanosine+(8-oxoG)+by+the+exoribonuclease+Xrn-1.">Processing of RNA containing 8-Oxo-7,8-dihydroguanosine (8-oxoG) by the exoribonuclease Xrn-1.</a> Frontiers in Molecular Biosciences. 8, 780315 (2021).</li><li>Francis, A. J., Resendiz, M. J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protocol+for+the+solid-phase+synthesis+of+oligomers+of+RNA+containing+a+2'-O-thiophenylmethyl+modification+and+characterization+via+circular+dichroism.">Protocol for the solid-phase synthesis of oligomers of RNA containing a 2'-O-thiophenylmethyl modification and characterization via circular dichroism.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (125), e56189 (2017).</li><li>Langeberg, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biochemical+characterization+of+yeast+Xrn1.">Biochemical characterization of yeast Xrn1.</a> Biochemistry. 59 (15), 1493-1507 (2020).</li><li>Stevens, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+and+characterization+of+a+Saccharomyces+cerevisiae+exoribonuclease+which+yields+5'-mononucleotides+by+a+5'+leads+to+3'+mode+of+hydrolysis.">Purification and characterization of a Saccharomyces cerevisiae exoribonuclease which yields 5'-mononucleotides by a 5' leads to 3' mode of hydrolysis.</a> Journal of Biological Chemistry. 255 (7), 3080-3085 (1980).</li><li>Yan, L. L., Simms, C. L., McLoughlin, F., Vierstra, R. D., Zaher, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxidation+and+alkylation+stresses+activate+ribosome-quality+control.">Oxidation and alkylation stresses activate ribosome-quality control.</a> Nature Communications. 10 (1), 5611 (2019).</li><li>Fasnacht, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+23S+rRNA+modification+ho5C2501+benefits+Escherichia+coli+under+oxidative+stress.">Dynamic 23S rRNA modification ho5C2501 benefits Escherichia coli under oxidative stress.</a> Nucleic Acids Research. 50 (1), 473-489 (2022).</li><li>Estevez, M., Valesyan, S., Jora, M., Limbach, P. A., Addepalli, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxidative+damage+to+RNA+is+altered+by+the+presence+of+interacting+proteins+or+modified+nucleosides.">Oxidative damage to RNA is altered by the presence of interacting proteins or modified nucleosides.</a> Frontiers in Molecular Biosciences. 8, 697149 (2021).</li><li>Tomar, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+sequence+modulates+the+efficiency+of+NEIL1-catalyzed+excision+of+the+aflatoxin+B1-induced+formamidopyrimidine+guanine+adduct.">DNA sequence modulates the efficiency of NEIL1-catalyzed excision of the aflatoxin B1-induced formamidopyrimidine guanine adduct.</a> Journal of the American Chemical Society. 34 (3), 901-911 (2021).</li><li>Gaffney, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV-1+env-dependent+cell+killing+by+bifunctional+small-molecule/peptide+conjugates.">HIV-1 env-dependent cell killing by bifunctional small-molecule/peptide conjugates.</a> ACS Chemical Biology. 16 (1), 193-204 (2021).</li><li>Sikorski, E. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+display+of+a+chemoattractant+agonist+on+cancer+cells+activates+the+formyl+peptide+receptor+1+on+immune+cells.">Selective display of a chemoattractant agonist on cancer cells activates the formyl peptide receptor 1 on immune cells.</a> ChemBioChem. , 202100521 (2022).</li><li>Kubo, T., Nishimura, Y., Sato, Y., Yanagihara, K., Seyama, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sixteen+different+types+of+lipid-conjugated+siRNAs+containing+saturated+and+unsaturated+fatty+Acids+and+exhibiting+enhanced+RNAi+potency.">Sixteen different types of lipid-conjugated siRNAs containing saturated and unsaturated fatty Acids and exhibiting enhanced RNAi potency.</a> ACS Chemical Biology. 16 (1), 150-164 (2021).</li></ol>

Hovedutfordringen i denne arbeidsflyten oppsto mellom å ferdigstille forsøkene og gjennomføre massespektrometriske analyser. Eksperimenter ble utført og fullført ved University of Colorado Denver og sendt (over natten) til Colorado State University fasiliteter. Datainnsamling ble utført ved mottak, i henhold til bekvemmelighet. Flere uventede omstendigheter førte til tidsforsinkelser i prosessen. I ett tilfelle krevde uventede instrumentfeil at prøvene ble frosset (en gang i 21 dager) før de oppdaget og anskaffe...

MALDI-TOF 1,2,3 er en mye brukt teknikk for karakterisering og / eller deteksjon av molekyler av varierende størrelse og egenskaper. Noen av bruksområdene inkluderer forskjellige bruksområder som å oppdage tanniner fra naturressurs4, avbildning av metabolitter i mat5, oppdagelse eller overvåking av cellulære narkotikamål eller markører6, og klinisk diagnostikk7, for å nevne noen. Av relevans for det nåværende arbeidet er bruken av MALDIV-TOF med DNA eller RNA, med bruk på oligonukleotider som dateres tilbake til over tre tiår8, hvor flere begrensninger ble notert. Denne teknikken har nå utviklet seg til en pålitelig, vanlig brukt måte å karakterisere både biopolymerer9 og identifisere / forstå kjemiske og biokjemiske reaksjoner, for eksempel karakterisering av platinerte steder i RNA10, identifisering av RNA-fragmenter etter strandspalting11,12, eller dannelse av protein-DNA krysskoblinger13 . Dermed er det verdifullt å illustrere og fremheve viktige aspekter ved å bruke denne teknikken. Det grunnleggende om MALDI-TOF er beskrevet i videoformat også14 og vil ikke bli nærmere utdypet heri. Videre har anvendelsen i en DNA- eller proteinkontekst tidligere blitt beskrevet og illustrert i nevnte format 15,16,17.
Protokollen for å oppdage RNA-fragmenter dannet etter enzymatisk hydrolyse rapporteres heri. Den eksperimentelle modellen ble valgt basert på et nylig funn publisert av vår gruppe18, hvor MALDI-TOF ble brukt til å bestemme den unike reaktivitet mellom exoribonuclease Xrn-1 og oligonukleotider av RNA som inneholder den oksidative lesjonen 8-oksidasjon. De 20-nukleotid lange trådene ble oppnådd via fastfasesyntese19, [5'-CAU GAA ACA A(8-oxoG)G CUA AAA GU] og [5'-CAU GAA ACA A(8-oxoG)(8-oxoG) CUA AAA GU], mens Xrn-1 ble uttrykt og renset etter den tidligere beskrevnerapporten. Kort sagt, Xrn-121 er en 5'-3' exoribonuclease med ulike viktige biologiske roller som nedbryter flere typer RNA, inkludert oksidert RNA22. Det ble funnet at prosesjonen til enzymet stopper ved møte med 8-oksoG, noe som førte til RNA-fragmenter som inneholder 5'-fosforylater [5'-H2PO4-(8-oxoG)G CUA AAA GU], [5'-H2PO4-(8-oxoG)(8-oxoG) CUA AAA GU], og [5'-H2PO4-(8-oxoG) CUA AAA GU]18.
Til slutt er det viktig å merke seg at massespektrometri er en kraftig metode som gjennom ulike metoder kan tilpasses andre formål23,24; Dermed er det av største betydning å velge riktig ioniseringsmetode så vel som andre eksperimentelle oppsett.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.6 mL MCT Graduated Violet</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>05-408-127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6&#8217;-Trihydroxyacetophenone monohydrate 98%</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>480-66-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile 99.9%, HPLC grade</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>75-05-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adenosine triphosphate, 10 mM</td>
			<td>New Englang Bioscience</td>
			<td>P0756S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium citrate, dibasic 98%</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>3012-65-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium Fluoride 98.0%, ACS grade</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>12125-01-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bruker bacterial test standard</td>
			<td>Bruker Daltonics</td>
			<td>8255343</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Commercial source of Xrn-1</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>M0338S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diethyl pyrocarbonate, 97%</td>
			<td>ACROS Organics</td>
			<td>A0368487</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flex analysis software</td>
			<td>Bruker daltonics</td>
			<td></td>
			<td>FlexAnalysis software version 3.4, Bruker Daltonics</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lambda 365 UV-vis spectrophotometer</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MALDI plate: MSP 96 ground steel target</td>
			<td>Bruker Daltonics</td>
			<td>280799</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mass Spectrometer</td>
			<td>Bruker</td>
			<td></td>
			<td>Microflex LRFTOF mass spectrometer (Bruker Daltonics, Billerica, MA)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mili-Q IQ 7000</td>
			<td>Milipore Sigma</td>
			<td></td>
			<td>A Mili-Q system was used to purify all water used in this work</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanosep Centrifugal Devices with OmegaTM Membrane 10 K, blue (24/pkg)</td>
			<td>Pall Corporation</td>
			<td>OD010C33</td>
			<td>filter media, Omega (modified polyethersulfone) 10 K pore size</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEBuffer 3</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>B7003S</td>
			<td>This is solution B</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oligo Analyzer tool</td>
			<td>IDT-DNA</td>
			<td></td>
			<td>https://www.idtdna.com/calc/analyzer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tips P10</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02-707-441</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tips P200</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02-707-419</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase Away</td>
			<td>Molecular BioProducts</td>
			<td>7005-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 Polynucleotide Kinase</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>M0201S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 Polynucleotide Kinase Reaction Buffer</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>B0201S</td>
			<td>This is solution A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triflouroacetic Acid</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>76-05-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xrn-1 exoribonuclease</td>
			<td>Expressed in house</td>
			<td>See ref. 20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZipTip Pipette Tips for Sample preparation</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>ZTC 18S 096</td>
			<td>10 &#181;L pipette tips loaded with a C18 standard 0.6 &#181;L bed</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

identification of rna fragments resulting from enzymatic degradation using maldi-tof mass spectrometry

RNA er en biopolymer tilstede på alle områder av livet, og dens interaksjoner med andre molekyler og / eller reaktive arter, for eksempel DNA, proteiner, ioner, narkotika og frie radikaler, er allestedsnærværende. Som et resultat gjennomgår RNA ulike reaksjoner som inkluderer spalting, nedbrytning eller modifikasjon, noe som fører til biologisk relevante arter med distinkte funksjoner og implikasjoner. Et eksempel er oksidasjon av guanin til 7,8-dihydro-8-oksoguanin (8-oksoG), som kan oppstå i nærvær av reaktive oksygenarter (ROS). Totalt sett er prosedyrer som karakteriserer slike produkter og transformasjoner i stor grad verdifulle for det vitenskapelige samfunnet. For dette formål er matriseassistert laserdesorpsjonsionionisering tid-of-flight (MALDI-TOF) massespektrometri en mye brukt metode. Den nåværende protokollen beskriver hvordan man karakteriserer RNA-fragmenter dannet etter enzymatisk behandling. Den valgte modellen bruker en reaksjon mellom RNA og exoribonuclease Xrn-1, hvor enzymatisk fordøyelse stoppes på oksiderte steder. To 20-nukleotid lange RNA-sekvenser [5'-CAU GAA ACA A(8-oxoG)G CUA AAA GU] og [5'-CAU GAA ACA A(8-oxoG)(8-oxoG) CUA AAA GU] ble oppnådd via solidfasesyntese, kvantifisert av UV-vis spektroskopier, og karakterisert via MALDI-TOF. De oppnådde trådene ble da (1) 5'-fosforylatert og karakterisert via Maldiv-TOF; (2) behandlet med Xrn-1; (3) filtrert og avsaltet; (4) analysert via Maldiven-TOF. Dette eksperimentelle oppsettet førte til en utvetydig identifisering av fragmentene knyttet til stansingen av Xrn-1: [5'-H2PO4-(8-oxoG)G CUA AAA GU], [5'-H2PO4-(8-oxoG)(8-oxoG) CUA AAA GU], og [5'-H2PO4-(8-oxoG) CUA AAA GU]. De beskrevne eksperimentene ble utført med 200 picomols av RNA (20 pmol brukt til MALDI-analyser); Lavere mengder kan imidlertid føre til påvisbare topper med spektrometre som bruker laserkilder med mer kraft enn den som brukes i dette arbeidet. Det er viktig at den beskrevne metodikken generaliseres og potensielt utvides til produktidentifikasjon for andre prosesser som involverer RNA og DNA, og kan hjelpe til med karakterisering/belysning av andre biokjemiske veier.

Oligonukleotidene som ble brukt i dette arbeidet ble syntetisert, karakterisert og kvantifisert før bruk. Konsentrasjonen av alle oligonukleotider ble bestemt via UV-vis spektroskopi registrert ved 90 °C for å unngå feilaktige avlesninger som følge av den potensielle dannelsen av sekundærstrukturene. Figur 3 viser spektra av modellen oligonukleotider av RNA som brukes i dette arbeidet, tatt ved romtemperatur og etter påføring av varme.
Den generel...

Watch this Scientific Journal Video about Identification of RNA Fragments Resulting from Enzymatic Degradation using MALDI-TOF Mass Spectrometry at JoVE.com

Identification of RNA Fragments Resulting from Enzymatic Degradation using MALDI-TOF Mass Spectrometry

MALDI-TOF ble brukt til å karakterisere fragmenter oppnådd fra reaktivitet mellom oksidert RNA og exoribonuclease Xrn-1. Den nåværende protokollen beskriver en metodikk som kan brukes på andre prosesser som involverer RNA og/eller DNA.

Identifisering av RNA Fragments som følge av enzymatisk nedbrytning ved bruk av MALDI-TOF massespektrometri

RNA is a biopolymer present in all domains of life, and its interactions with other molecules and/or reactive species, e.g., DNA, proteins, ions, drugs, ...

Massespektrometri har blitt mye vedtatt for ulike applikasjoner. Metodikken i denne artikkelen gir en utvetydig karakterisering av RNA-fragmenter hentet fra en in vitro enzymatisk prosess. Fordelene med denne teknikken inkluderer at molekyljernstoppen oppnås, at forsøkene kan utføres med små mengder materiale for in vitro-applikasjoner, og at protokollen kan oppnås med minimal trening.Den beskrevne metodikken kan brukes mye på studieprosesser som involverer DNA, RNA eller proteiner. Eksempler er biokjemiske transformasjoner som kryssinformasjon, identifisering av kjemiske modifikasjoner eller andre biopolymerinteraksjoner og reaktivitet. En vanskelighet kan oppstå fra tilgjengeligheten til et MALDI-spektrometer eller kjernefasiliteter som tilbyr denne tjenesten.Et annet aspekt er å etablere deteksjonsgrensen som kan være høyere eller lavere, avhengig av instrumentet. For å begynne med, slå på UV-Vis spektrofotometeret, og klikk deretter på PerkinElmer UV WinLab-ikonet for å åpne instrumentets driftskontrollvindu. Slå på spektrofotometeret for peltiertemperaturkontrolleren ved hjelp av bryteren til høyre for instrumentet, og klikk på Scan-Lambda 365, som finnes under Grunnmetoder.Et annet skjermbilde åpnes og ber brukeren om å sørge for at celleholderne er tomme. Klikk på OK og la instrumentet utføre sine systemkontroller. Juster nå skanneparametrene ved å velge Datainnsamling.I det nye vinduet under Skanneinnstillinger endrer du starten til 350 nanometer og slutter til 215 nanometer. Aktiver pelsen ved å velge pluss til venstre for tilbehøret. Klikk deretter på Multiple Cell Peltier, endre temperaturgradene Celsius til 25, og klikk på Peltier On.Navigate til eksempelinformasjonsfanen og skriv inn antall prøver, navn og celleplassering ønsket.Klikk på Autozero og sett inn cuvette som inneholder bakgrunnsløsningen. Klikk på Start og sett inn cuvette i ønsket celle og sørg for at cuvette-vinduet er orientert parallelt med forsiden av instrumentet. Klikk nå OK for å starte den første skanningen ved 25 grader Celsius.For målinger ved høyere temperaturer, klikk på Multiple Cell Peltier, endre temperaturen til ønsket prøvetemperatur og gjenta skanningen. Klikk på Fil, Eksporter og velg ønsket filplassering og velg XY Data for å få en tekstfil. For å utføre 5'fosforylering av RNA, lag en løsning i et 0,6-mikroliter mikro sentrifugerrør ved å tilsette 33,5-mikroliter RNase-fritt vann, fem mikroliter av løsning A, seks mikrolitter av 10 millimolar adenosintrifosfat, en mikrolitt av 200 mikromolar RNA vandig oppløsning og 4,5 mikroliter polynukleotid kinase og bland løsningen forsiktig.Inkuber reaksjonsblandingen ved 37 grader Celsius i 45 minutter ved å plassere den i et vannbad. Deretter inaktiverer enzymet ved å plassere reaksjonsrøret i en varmeblokk, forvarmet ved 65 grader Celsius i 10 minutter. La løsningen avkjøles til romtemperatur for å gi en endelig 5'fosforilert RNA-løsning.Etter inkubasjon, bruk 50 mikroliter av denne løsningen, tilsett fem mikroliter av løsning B og fem mikroliter 1-femtomoloppløsning av Xrn-1 for å utføre RNA hydrolyse. Inkuber reaksjonsrøret ved romtemperatur i to timer. Overfør denne reaksjonsblandingen til en sentrifugalenhet på 10 kilodalton porestørrelse og filtrer enzymene ved sentrifugering i 10 minutter ved 700 ganger G.Overfør filtratet til et sentrifugerør på 0,6 milliliter.Tilsett deretter 20 mikroliter RNase-fritt vann for å vaske gjenværende RNA på sentrifugalrøret, etterfulgt av sentrifugering. Til slutt, kombiner dette filtratet med det resulterende filtratet oppnådd tidligere ved sentrifugering i 10 kilodaltonn porestørrelse sentrifugalenhet, og frys løsningen ved null grader Celsius eller skip for analyse. For å avsalte og konsentrere prøven, bruk kommersielt tilgjengelig kationutveksling C18 pipettespisser lastet med en seng av C18 kromatografimedier på slutten.For dette, plasser pipettespissen på 10 mikroliter på en 10-mikroliterpipette og vask denne spissen to ganger med 50% vandig acetylnitriloppløsning. Kast de brukte volumene i et separat avfallsrør hver gang og likevekt C18-spissen med 10 mikroliter 0,1 % vandig trifluoroedinsyreoppløsning to ganger. Fjern C18-spissen manuelt fra pipetten og fest den på en pipette på 200 mikroliter som inneholder en P200 pipettespiss.Senk deretter C18-spissen ned i den resulterende løsningen fremstilt under hydrolyse av oligonukleotider av RNA ved Xrn-1 og aspirer løsningen gjennom C18-spissen 10 ganger. Nå løsner du C18-spissen fra P200-pipetten, plasserer den ned til en 10-mikroliterpipette og vasker C18-spissen ved hjelp av en vandig løsning på 0,1% trifluoroacetisk syreoppløsning to ganger. Kast de brukte volumene i et separat avfallsrør hver gang.Vask C18-spissen med 10 mikroliter RNase-fritt vann to ganger. For å oppdage på MALDI-platen, elute RNA oligonukleotid fra C18-spissen ved å nedsenke prøven i ønsket matrise og dispensere løsningen tilbake i røret 10 ganger. Pipette ut denne løsningen på to separate flekker på en mikroliter hver på platen og la flekker lufttørke.Konsentrasjonen av RNA som ble brukt i dette arbeidet ble bestemt via UV-synlig spektroskopi registrert ved 90 grader Celsius for å unngå feilaktige avlesninger som følge av den potensielle dannelsen av sekundærstrukturene. Den generelle hendelsessekvensen inkluderte to deler. Den ene, den effektive 5'fosforylering av RNA, bevist ved utseendet på bare en topp som tilsvarer det forventede produktet.Og to, stalling fragmentet som oppstår ved behandling av prøveblandingen med Xrn-1. De samme resultatene ble oppnådd ved hjelp av en annen sekvens som inneholdt to oksidative lesjoner. Potensielle endringer å vurdere inkluderer å eliminere bruken av filtreringsenheten eller vurdere forskjellige matriser for MALDI-spotting.For eksempel sinapinsyre eller picolinsyre. RNA-fragmentene ble hentet fra en enzymatisk prosess. Denne prosessen ble etablert ved kobling av MALDI, elektroforetisk analyse, fastfasesyntese og sirkulær dikroisme.Den beskrevne protokollen har et potensial til å bli brukt på ulike felt, fra forskning innen kjemisk vitenskap til anvendelser innen biomedisinsk felt.

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Cell Biology

Biochemistry

Unit 1

Analyzing Cells and Proteins

SCIENTISTS IN ACTION

Time-resolved ElectroSpray Ionization Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry for Studying Protein Structure and Dynamics

Time-løst elektrospray-ionisering Hydrogen-deuterium Veksling massespektrometri for å studere Protein struktur og dynamikk

Intrinsically disordered proteins (IDPs) have long been a challenge to structural biologists due to their lack of stable secondary structure elements. ...

Resolving Affinity Purified Protein Complexes by Blue Native PAGE and Protein Correlation Profiling

Løse affinitetsrenset protein komplekser av Blå Native PAGE og Protein korrelasjon Profiling

Most proteins act in association with others; hence, it is crucial to characterize these functional units in order to fully understand biological ...

Lipid Droplet Isolation for Quantitative Mass Spectrometry Analysis

Lipid Droplet Isolasjon for Quantitative massespektrometri analyse

Lipid droplets are vital to the replication of a variety of different pathogens, most prominently the Hepatitis C Virus (HCV), as the putative site of ...

Sample Preparation for Mass Spectrometry-based Identification of RNA-binding Regions

Eksempel forberedelse til masse massespektrometri-baserte identifikasjon av RNA-bindende områder

Noncoding RNAs play important roles in several nuclear processes, including regulating gene expression, chromatin structure, and DNA repair. In most ...

The Determination of Protease Specificity in Mouse Tissue Extracts by MALDI-TOF Mass Spectrometry: Manipulating PH to Cause Specificity Changes

Fastsettelse av Protease spesifisitet i musen vev ekstrakter av MALDI-TOF massespektrometri: manipulere PH å forårsake spesifisitet endringer

Proteases have several biological functions, including protein activation/inactivation and food digestion. Identifying protease specificity is important ...

Proofreading and DNA Repair Assay Using Single Nucleotide Extension and MALDI-TOF Mass Spectrometry Analysis

Korrekturlesing og DNA reparasjon analysen Single nukleotid forlengelse og MALDI-TOF massespektrometri analyse

The maintenance of the genome and its faithful replication is paramount for conserving genetic information. To assess high fidelity replication, we have ...

Analyzing Dynamic Protein Complexes Assembled On and Released From Biolayer Interferometry Biosensor Using Mass Spectrometry and Electron Microscopy

Analysere dynamisk Protein komplekser sammen på og løslatt fra Biolayer Interferometry Biosensor massespektrometri og elektronmikroskop

In vivo, proteins are often part of large macromolecular complexes where binding specificity and dynamics ultimately dictate functional outputs. In this ...

Capture and Identification of RNA-binding Proteins by Using Click Chemistry-assisted RNA-interactome Capture (CARIC) Strategy

Capture and Identification of RNA-binding Proteins by Using Click Chemistry-assisted RNA-interactome Capture CARIC Strategy

Fangst og identifikasjon av RNA-bindende proteiner ved hjelp av Klikk kjemi-assistert RNA-interactome Capture (CARIC) strategi

A comprehensive identification of RNA-binding proteins (RBPs) is key to understanding the posttranscriptional regulatory network in cells. A widely used ...

Using the Open-Source MALDI TOF-MS IDBac Pipeline for Analysis of Microbial Protein and Specialized Metabolite Data

Ved hjelp av Open-Source MALDI TOF-MS IDBac rørledning for analyse av mikrobiell protein og spesialiserte metabolitten data

In order to visualize the relationship between bacterial phylogeny and specialized metabolite production of bacterial colonies growing on nutrient agar, ...

Nitropeptide Profiling and Identification Illustrated by Angiotensin II

Nitropeptide profilering og identifisering illustrert av angiotensin II

Protein nitration is one of the most important post-translational modifications (PTM) on tyrosine residues and it can be induced by chemical actions of ...