Name: identification of rna fragments resulting from enzymatic degradation using maldi-tof mass spectrometry
Uploaded: 2022-04-11T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Identification of RNA Fragments Resulting from Enzymatic Degradation using MALDI-TOF Mass Spectrometry at JoVE.com

É importante ressaltar que este trabalho foi um esforço colaborativo entre três instituições, dois grupos de pesquisa e uma instalação central. A distribuição e a carga de trabalho foram realizadas da seguinte forma: Expressão proteica (Xrn-1) foi realizada na Universidade de Denver (Denver, CO). A síntese de oligonucleotídeos, quantificação e experimentação (principalmente degradação enzimática) foram conduzidas na Universidade do Colorado Denver (Denver, CO). Também foi realizada otimização lá. As manchas, aquisições e análises maldi-TOF foram realizadas no Centro de Recursos Analíticos da Universidade estadual do Colorado. (Fort Collins, CO). A SS gostaria de reconhecer um prêmio UROP Award (CU Denver) e bolsas Eureca (CU Denver) para apoio. E. G.C. reconhece o suporte da NIGMS, via R00GM115757. A MJER reconhece o suporte da NIGMS, via 1R15GM132816. K.B. reconhece iD de recursos: SCR_021758. O trabalho também foi apoiado por um Prêmio Professor-Acadêmico (MJER), TH-21-028, da Fundação Henry Dreyfus.

A água ultra pura sem rnase (Tabela 1) foi utilizada para o presente estudo.
1. Determinação de concentração da solução RNA
<ol><li>Prepare a amostra de RNA seguindo os passos abaixo.<ol>
<li>Use um tubo de microcentrifuge (0,6 mL) para preparar uma solução de RNA diluindo 1 μL de solução de estoque (obtida através de síntese em fase sólida)19 em 159 μL de H2O. Livre de RNase misture a solução pip...

<ol>
	<li>Tanaka, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+and+polymer+analyses+up+to+m/z+100+000+by+laser+ionization+time-of-flight+mass+spectrometry.">Protein and polymer analyses up to m/z 100 000 by laser ionization time-of-flight mass spectrometry.</a> Rapid Communications in Mass Spectrometry. 2 (8), 151-153 (1988).</li><li>Karas, M., Hillenkamp, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+desorption+ionization+of+proteins+with+molecular+masses+exceeding+10,000+daltons.">Laser desorption ionization of proteins with molecular masses exceeding 10,000 daltons.</a> Analytical Chemistry. 60 (20), 2299-2301 (1988).</li><li>Zenobi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemistry+nobel+prize+2002+goes+to+analytical+chemistry.">Chemistry nobel prize 2002 goes to analytical chemistry.</a> Chimia. 57, 73 (2003).</li><li>Aristri, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bio-based+polyurethane+resins+derived+from+tannin:+Source,+synthesis,+characterization,+and+application.">Bio-based polyurethane resins derived from tannin: Source, synthesis, characterization, and application.</a> Forests. 12 (11), 1516 (2021).</li><li>Pedrazzani, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=5-n-Alkylresorcinol+profiles+in+different+cultivars+of+einkorn,+emmer+spelt,+common+wheat,+and+tritordeum.">5-n-Alkylresorcinol profiles in different cultivars of einkorn, emmer spelt, common wheat, and tritordeum.</a> Journal of Agricultural and Food Chemistry. 69 (47), 14092-14102 (2021).</li><li>Unger, M. S., Blank, M., Enzlein, T., Hopf, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Label-free+cell+assays+to+determine+compound+uptake+or+drug+action+using+MALDI-TOF+mass+spectrometry.">Label-free cell assays to determine compound uptake or drug action using MALDI-TOF mass spectrometry.</a> Nature Protocols. 16 (12), 5533-5558 (2021).</li><li>Croxatto, A., Prod'hom, G., Greub, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Applications+of+MALDI-TOF+mass+spectrometry+in+clinical+diagnostic+microbiology.">Applications of MALDI-TOF mass spectrometry in clinical diagnostic microbiology.</a> FEMS Microbiology Reviews. 36 (2), 380-407 (2012).</li><li>Kaufmann, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Marrix-assisted+laser+desorption+ionization+(MALDI)+mass+spectrometry:+a+novel+analytical+tool+in+molecular+biology+and+biotechnology.">Marrix-assisted laser desorption ionization (MALDI) mass spectrometry: a novel analytical tool in molecular biology and biotechnology.</a> Journal of Biotechnology. 41 (2-3), 155-175 (1995).</li><li>Kiggins, C., Skinner, A., Resendiz, M. J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=8-Oxo-7,8-dihydroguanosine+inhibits+or+changes+the+selectivity+of+the+theophylline+aptamer.">8-Oxo-7,8-dihydroguanosine inhibits or changes the selectivity of the theophylline aptamer.</a> ChemBioChem. 21 (9), 1347-1355 (2020).</li><li>Chapman, E. G., DeRose, V. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzymatic+processing+of+platinated+RNAs.">Enzymatic processing of platinated RNAs.</a> Journal of the American Chemical Society. 132 (6), 1946-1952 (2010).</li><li>Resendiz, M. J. E., Pottiboyina, V., Sevilla, M. D., Greengerg, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+strand+scission+in+double+stranded+RNA+via+a+C5-pyrimidine+radical.">Direct strand scission in double stranded RNA via a C5-pyrimidine radical.</a> Journal of the American Chemical Society. 134 (8), 3917-3924 (2012).</li><li>Joyner, J. C., Keuper, K. D., Cowan, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+RNA+cleavage+by+MALDI-TOF+mass+spectrometry.">Analysis of RNA cleavage by MALDI-TOF mass spectrometry.</a> Nucleic Acids Research. 41 (1), 2 (2013).</li><li>Ghodke, P. P., Guengerich, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+polymerases+&#951;+and+&#954;+bypass+N2-guanine-O6-alkylguanine+DNA+alkyltransferase+cross-linked+DNA+peptides.">DNA polymerases &#951; and &#954; bypass N2-guanine-O6-alkylguanine DNA alkyltransferase cross-linked DNA peptides.</a> Journal of Biological Chemistry. 297 (4), 101124 (2021).</li><li>JoVE. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=JoVE+Science+Education+Database.+Biochemistry.+MALDI-TOF+Mass+Spectrometry.">JoVE Science Education Database. Biochemistry. MALDI-TOF Mass Spectrometry.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2021).</li><li>Schr&#246;tner, P., Gunzer, F., Sch&#252;ppel, J., Rudolph, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+rare+bacterial+pathogens+by+16S+rRNA+gene+sequencing+and+MALDI-TOF+MS.">Identification of rare bacterial pathogens by 16S rRNA gene sequencing and MALDI-TOF MS.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (113), e53176 (2016).</li><li>Su, K. -. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proofreading+and+DNA+repair+assay+using+single+nucleotide+extension+and+MALDI-TOF+mass+spectrometry+analysis.">Proofreading and DNA repair assay using single nucleotide extension and MALDI-TOF mass spectrometry analysis.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (136), e57862 (2018).</li><li>Fagerquist, C. K., Rojas, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+antibacterial+immunity+proteins+in+Escherichia+coli+using+MALDI-TOF-TOF-MS/MS+and+Top-Down+proteomic+analysis.">Identification of antibacterial immunity proteins in Escherichia coli using MALDI-TOF-TOF-MS/MS and Top-Down proteomic analysis.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (171), e62577 (2021).</li><li>Phillips, C. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Processing+of+RNA+containing+8-Oxo-7,8-dihydroguanosine+(8-oxoG)+by+the+exoribonuclease+Xrn-1.">Processing of RNA containing 8-Oxo-7,8-dihydroguanosine (8-oxoG) by the exoribonuclease Xrn-1.</a> Frontiers in Molecular Biosciences. 8, 780315 (2021).</li><li>Francis, A. J., Resendiz, M. J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protocol+for+the+solid-phase+synthesis+of+oligomers+of+RNA+containing+a+2'-O-thiophenylmethyl+modification+and+characterization+via+circular+dichroism.">Protocol for the solid-phase synthesis of oligomers of RNA containing a 2'-O-thiophenylmethyl modification and characterization via circular dichroism.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (125), e56189 (2017).</li><li>Langeberg, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biochemical+characterization+of+yeast+Xrn1.">Biochemical characterization of yeast Xrn1.</a> Biochemistry. 59 (15), 1493-1507 (2020).</li><li>Stevens, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+and+characterization+of+a+Saccharomyces+cerevisiae+exoribonuclease+which+yields+5'-mononucleotides+by+a+5'+leads+to+3'+mode+of+hydrolysis.">Purification and characterization of a Saccharomyces cerevisiae exoribonuclease which yields 5'-mononucleotides by a 5' leads to 3' mode of hydrolysis.</a> Journal of Biological Chemistry. 255 (7), 3080-3085 (1980).</li><li>Yan, L. L., Simms, C. L., McLoughlin, F., Vierstra, R. D., Zaher, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxidation+and+alkylation+stresses+activate+ribosome-quality+control.">Oxidation and alkylation stresses activate ribosome-quality control.</a> Nature Communications. 10 (1), 5611 (2019).</li><li>Fasnacht, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+23S+rRNA+modification+ho5C2501+benefits+Escherichia+coli+under+oxidative+stress.">Dynamic 23S rRNA modification ho5C2501 benefits Escherichia coli under oxidative stress.</a> Nucleic Acids Research. 50 (1), 473-489 (2022).</li><li>Estevez, M., Valesyan, S., Jora, M., Limbach, P. A., Addepalli, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxidative+damage+to+RNA+is+altered+by+the+presence+of+interacting+proteins+or+modified+nucleosides.">Oxidative damage to RNA is altered by the presence of interacting proteins or modified nucleosides.</a> Frontiers in Molecular Biosciences. 8, 697149 (2021).</li><li>Tomar, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+sequence+modulates+the+efficiency+of+NEIL1-catalyzed+excision+of+the+aflatoxin+B1-induced+formamidopyrimidine+guanine+adduct.">DNA sequence modulates the efficiency of NEIL1-catalyzed excision of the aflatoxin B1-induced formamidopyrimidine guanine adduct.</a> Journal of the American Chemical Society. 34 (3), 901-911 (2021).</li><li>Gaffney, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV-1+env-dependent+cell+killing+by+bifunctional+small-molecule/peptide+conjugates.">HIV-1 env-dependent cell killing by bifunctional small-molecule/peptide conjugates.</a> ACS Chemical Biology. 16 (1), 193-204 (2021).</li><li>Sikorski, E. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+display+of+a+chemoattractant+agonist+on+cancer+cells+activates+the+formyl+peptide+receptor+1+on+immune+cells.">Selective display of a chemoattractant agonist on cancer cells activates the formyl peptide receptor 1 on immune cells.</a> ChemBioChem. , 202100521 (2022).</li><li>Kubo, T., Nishimura, Y., Sato, Y., Yanagihara, K., Seyama, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sixteen+different+types+of+lipid-conjugated+siRNAs+containing+saturated+and+unsaturated+fatty+Acids+and+exhibiting+enhanced+RNAi+potency.">Sixteen different types of lipid-conjugated siRNAs containing saturated and unsaturated fatty Acids and exhibiting enhanced RNAi potency.</a> ACS Chemical Biology. 16 (1), 150-164 (2021).</li></ol>

O principal desafio nesse fluxo de trabalho surgiu entre finalizar os experimentos e realizar as análises espectrométricas em massa. Experimentos foram realizados e concluídos na Universidade do Colorado Denver e enviados (durante a noite) para as instalações da Universidade estadual do Colorado. A aquisição de dados foi realizada mediante recebimento, conforme conveniência. Várias circunstâncias inesperadas levaram a atrasos de tempo no processo. Em um caso, defeitos inesperados de instrumentos exigiram que as...

MALDI-TOF 1,2,3 é uma técnica amplamente utilizada para a caracterização e/ou detecção de moléculas de tamanhos e características variados. Alguns de seus usos incluem diversas aplicações como a detecção de taninos a partir de recursos naturais4, metabólitos por imagem em alimentos5, descoberta ou monitoramento de alvos ou marcadores de drogas celulares6, e diagnóstico clínico7, para citar alguns. De relevância para o presente trabalho é o uso de MALDI-TOF com DNA ou RNA, com seu uso em oligonucleotídeos datando de mais de três décadas8, onde várias limitações foram observadas. Esta técnica evoluiu agora para um meio confiável e comumente utilizado para caracterizar tanto biopolímeros9 quanto identificar/entender reações químicas e bioquímicas, por exemplo, caracterização de locais platinados no RNA10, identificação de fragmentos de RNA após o decotedo fio 11,12, ou formação de ligações cruzadas proteína-DNA13 . Assim, é valioso ilustrar e destacar aspectos importantes do uso dessa técnica. Os fundamentos do MALDI-TOF foram descritos em formato de vídeo, bem como14 e não serão mais elaborados aqui. Além disso, sua aplicação em um contexto de DNA ou proteína foi previamente descrita e ilustrada no referido formato 15,16,17.
O protocolo de detecção de fragmentos de RNA formados após hidrólise enzimática é relatado aqui. O modelo experimental foi escolhido com base em um achado recente publicado pelo nosso grupo18, onde o MALDI-TOF foi usado para determinar a reatividade única entre o exoribonuclease Xrn-1 e os oligonucleotídeos do RNA contendo a lesão oxidativa 8-oxoG. Os fios longos de 20 nucleotídeos foram obtidos através da síntese em fase sólida19, [5'-CAU GAA ACA A(8-oxoG)G CUA AAA GU] e [5'-CAU GAA ACA A(8-oxoG)(8-oxoG) CUA AAA GU], enquanto Xrn-1 foi expresso e purificado após o relatório descrito anteriormente20. Resumindo, Xrn-121 é uma exorapenasnucleação de 5'3' com vários papéis biológicos importantes que degradam vários tipos de RNA, incluindo RNAoxidado 22. Verificou-se que a processividade da enzima para ao encontrar 8-oxoG, o que levou a fragmentos de RNA contendo extremidades fosfoiladas de 5'-phosphoiladas [5'-H2PO4-(8-oxoG)G CUA AAA GU], [5'-H2PO4-(8-oxoG)(8-oxoG) CUA AAA GU], e [5'-H2PO4-(8-oxoG) CUA AAA GU]18.
Por fim, é importante notar que a espectrometria de massa é um método poderoso que, através de várias metodologias, pode ser adaptado para outros propósitos23,24; assim, escolher o método de ionização certo, bem como outras configurações experimentais é de extrema importância.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.6 mL MCT Graduated Violet</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>05-408-127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6&#8217;-Trihydroxyacetophenone monohydrate 98%</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>480-66-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile 99.9%, HPLC grade</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>75-05-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adenosine triphosphate, 10 mM</td>
			<td>New Englang Bioscience</td>
			<td>P0756S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium citrate, dibasic 98%</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>3012-65-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium Fluoride 98.0%, ACS grade</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>12125-01-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bruker bacterial test standard</td>
			<td>Bruker Daltonics</td>
			<td>8255343</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Commercial source of Xrn-1</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>M0338S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diethyl pyrocarbonate, 97%</td>
			<td>ACROS Organics</td>
			<td>A0368487</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flex analysis software</td>
			<td>Bruker daltonics</td>
			<td></td>
			<td>FlexAnalysis software version 3.4, Bruker Daltonics</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lambda 365 UV-vis spectrophotometer</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MALDI plate: MSP 96 ground steel target</td>
			<td>Bruker Daltonics</td>
			<td>280799</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mass Spectrometer</td>
			<td>Bruker</td>
			<td></td>
			<td>Microflex LRFTOF mass spectrometer (Bruker Daltonics, Billerica, MA)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mili-Q IQ 7000</td>
			<td>Milipore Sigma</td>
			<td></td>
			<td>A Mili-Q system was used to purify all water used in this work</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanosep Centrifugal Devices with OmegaTM Membrane 10 K, blue (24/pkg)</td>
			<td>Pall Corporation</td>
			<td>OD010C33</td>
			<td>filter media, Omega (modified polyethersulfone) 10 K pore size</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEBuffer 3</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>B7003S</td>
			<td>This is solution B</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oligo Analyzer tool</td>
			<td>IDT-DNA</td>
			<td></td>
			<td>https://www.idtdna.com/calc/analyzer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tips P10</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02-707-441</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tips P200</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02-707-419</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase Away</td>
			<td>Molecular BioProducts</td>
			<td>7005-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 Polynucleotide Kinase</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>M0201S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 Polynucleotide Kinase Reaction Buffer</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>B0201S</td>
			<td>This is solution A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triflouroacetic Acid</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>76-05-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xrn-1 exoribonuclease</td>
			<td>Expressed in house</td>
			<td>See ref. 20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZipTip Pipette Tips for Sample preparation</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>ZTC 18S 096</td>
			<td>10 &#181;L pipette tips loaded with a C18 standard 0.6 &#181;L bed</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

identification of rna fragments resulting from enzymatic degradation using maldi-tof mass spectrometry

O RNA é um biopolímero presente em todos os domínios da vida, e suas interações com outras moléculas e/ou espécies reativas, por exemplo, DNA, proteínas, íons, drogas e radicais livres, são onipresentes. Como resultado, o RNA sofre várias reações que incluem seu decote, degradação ou modificação, levando a espécies biologicamente relevantes com funções e implicações distintas. Um exemplo é a oxidação da guanina para 7,8-dihidro-8-oxoguanina (8-oxoG), que pode ocorrer na presença de espécies reativas de oxigênio (ROS). No geral, procedimentos que caracterizam tais produtos e transformações são em grande parte valiosos para a comunidade científica. Para isso, a espectrometria de massa de desorpização a laser assistida por matriz (MALDI-TOF) é um método amplamente utilizado. O presente protocolo descreve como caracterizar fragmentos de RNA formados após o tratamento enzimático. O modelo escolhido usa uma reação entre o RNA e o exoribonuclease Xrn-1, onde a digestão enzimática é interrompida em locais oxidados. Duas sequências de RNA longa de 20 nucleotídeos [5'-CAU GAA ACA A(8-oxoG)G CUA AAA GU] e [5'-CAU GAA ACA A(8-oxoG)(8-oxoG) CUA AAA GU] foram obtidas através de síntese de fase sólida, quantificado por espectroscopia UV-vis, e caracterizado via MALDI-TOF. Os fios obtidos foram então (1) 5'-fosforilados e caracterizados via MALDI-TOF; (2) tratado com Xrn-1; (3) filtrado e desálhado; (4) analisado via MALDI-TOF. Esta configuração experimental levou à identificação inequívoca dos fragmentos associados à paralisação de Xrn-1: [5'-H2PO4-(8-oxoG)G CUA AAA GU], [5'-H2PO4-(8-oxoG)(8-oxoG) CUA AAA GU], e [5'-H2PO4-(8-oxoG) CUA AAA GU]. Os experimentos descritos foram realizados com 200 picomols de RNA (20 pmol utilizados para análises MALDI); no entanto, quantidades mais baixas podem resultar em picos detectáveis com espectrômetros usando fontes laser com mais potência do que a usada neste trabalho. É importante ressaltar que a metodologia descrita pode ser generalizada e potencialmente estendida à identificação do produto para outros processos envolvendo RNA e DNA, podendo auxiliar na caracterização/elucidação de outras vias bioquímicas.

Os oligonucleotídeos utilizados neste trabalho foram sintetizados, caracterizados e quantificados antes do uso. A concentração de todos os oligonucleotídeos foi determinada através de espectroscopia UV-vis registrada a 90 °C para evitar leituras errôneas decorrentes da formação potencial das estruturas secundárias. A Figura 3 exibe os espectros do modelo oligonucleotídeos de RNA utilizados neste trabalho, tomados à temperatura ambiente e após a aplicação do calor....

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Identification of RNA Fragments Resulting from Enzymatic Degradation using MALDI-TOF Mass Spectrometry

MALDI-TOF foi utilizado para caracterizar fragmentos obtidos a partir da reatividade entre o RNA oxidado e o exoribonuclease Xrn-1. O presente protocolo descreve uma metodologia que pode ser aplicada a outros processos envolvendo RNA e/ou DNA.

Identificação de fragmentos de RNA resultantes da degradação enzimática usando espectrometria de massa MALDI-TOF

RNA is a biopolymer present in all domains of life, and its interactions with other molecules and/or reactive species, e.g., DNA, proteins, ions, drugs, ...

A espectrometria de massa tem sido amplamente adotada para várias aplicações. A metodologia deste artigo fornece a caracterização inequívoca dos fragmentos de RNA obtidos a partir de um processo enzimático in vitro. As vantagens dessa técnica incluem que o pico de ferro da molécula é obtido, que os experimentos podem ser realizados com pequenas quantidades de material para aplicações in vitro, e que o protocolo pode ser realizado com treinamento mínimo.A metodologia descrita pode ser amplamente aplicada aos processos de estudo envolvendo DNA, RNA ou proteínas. Exemplos incluem transformações bioquímicas, como informações cruzadas, identificação de modificações químicas ou outras interações biopolímeras e reatividade. Uma dificuldade pode ocorrer desde a acessibilidade até um espectrômetro MALDI ou instalações principais que oferecem este serviço.Outro aspecto é o estabelecimento do limite de detecção que pode ser maior ou menor dependendo do instrumento. Para começar, ligue o espectrofotômetro UV-Vis e clique no ícone Dolhá-winlab perkinelmer UV para abrir a janela de controle de operação do instrumento. Ligue o espectrômetro do controlador de temperatura Peltier usando o interruptor localizado à direita do instrumento e clique em Scan-Lambda 365, presente em Métodos básicos.Outra tela abrirá e solicitará ao usuário que garanta que os suportes de celular estejam vazios. Clique em OK e permita que o instrumento realize suas verificações de sistema. Agora, ajuste os parâmetros de digitalização selecionando a Coleta de Dados.Na nova janela em Configurações de varredura, altere a partida para 350 nanômetros e o final para 215 nanômetros. Ative o Peltier selecionando a vantagem à esquerda do acessório. Em seguida, clique em Multiple Cell Peltier, altere os graus de temperatura Celsius para 25 e clique em Peltier On.Navegue até a guia de informações da amostra e digite o número de amostras, nomes e posição celular desejadas.Clique em Autozero e insira a cuvette contendo a solução de fundo. Clique em Iniciar e inserir o cuvette na célula desejada e certifique-se de que a janela cuvette seja orientada paralelamente à face frontal do instrumento. Agora, clique em OK para começar a primeira varredura a 25 graus Celsius.Para medições a temperaturas mais altas, clique em Multiple Cell Peltier, altere a temperatura para a temperatura da amostra desejada e repita a varredura. Clique em Arquivo, Exporte e escolha o local do arquivo desejado e selecione XY Data para obter um arquivo de texto. Para realizar a fosforilação de 1,80 m de RNA, prepare uma solução em um tubo de microclamação de 0,6 microliters adicionando 33,5 microlitradores de água sem RNase, cinco microliters de solução A, seis microlitos de triphosfato de adenosina mililitro, um microlite de 200 micromolar RNA solução aquosa, e 4,5 microliters de polinucleotídeo quinase e misturar a solução suavemente.Incubar a mistura de reação a 37 graus Celsius por 45 minutos colocando-a em um banho de água. Em seguida, inativando a enzima colocando o tubo de reação em um bloco de calor, pré-aquecido a 65 graus Celsius por 10 minutos. Permita que a solução esfrie até a temperatura ambiente para produzir uma solução final de RNA de 1,80m.Após a incubação, use 50 microliters desta solução, adicione cinco microliters de solução B e cinco microlitres de solução 1-femtomole de Xrn-1 para realizar hidrólise de RNA. Incubar o tubo de reação à temperatura ambiente por duas horas. Transfira essa mistura de reação para um dispositivo centrífugo do tamanho de um poro de 10 kilodalton e filtre as enzimas por centrifugação por 10 minutos a 700 vezes G.Transfira o filtrado em um tubo de centrífuga de 0,6 mililitro.Em seguida, adicione 20 microliters de água livre de RNase para lavar o RNA residual no tubo centrífugo, seguido de centrifugação. Por fim, combine este filtrado com o filtrado resultante obtido anteriormente por centrifugação em 10 kilodaltons pore-size centrífuga dispositivo, e congele a solução a zero graus Celsius ou navio para análise. Para desalar e concentrar a amostra, use dicas de pipeta C18 disponíveis comercialmente carregadas com uma cama de mídia cromatografia C18 no final.Para isso, posicione a ponta de pipeta de 10 microliter em uma pipeta de 10 microliter e lave essa ponta duas vezes com solução de nitrilho acetil aquoso de 50%. Descarte os volumes usados em um tubo de resíduo separado cada vez e equilibre a ponta C18 com 10 microliters de 0,1% de solução de ácido trifluoroacético aquoso duas vezes. Remova manualmente a ponta C18 da pipeta e fixe-a em uma pipeta de 200 microliter contendo uma ponta de pipeta P200.Em seguida, mergulhe a ponta C18 na solução resultante preparada durante a hidrólise de oligonucleotídeos de RNA pela Xrn-1 e aspire solte a solução através da ponta C18 10 vezes. Agora, retire a ponta C18 da pipeta P200, posicione-a até uma pipeta de 10 microliter e lave a ponta C18 usando uma solução aquosa de solução de ácido trifluoroacético de 0,1%. Descarte os volumes usados em um tubo de resíduo separado a cada vez.Lave a ponta C18 com 10 microliters água sem RNase duas vezes. Para detectar na placa MALDI, elute o oligonucleotídeo RNA da ponta C18, imergindo a amostra na matriz desejada e distribuindo a solução de volta para o tubo 10 vezes. Pipeta esta solução em dois pontos separados de um microliter cada um na placa e permitir que as manchas sequem.A concentração de RNA utilizada neste trabalho foi determinada através de espectroscopia UV-Visível registrada a 90 graus Celsius para evitar leituras errôneas decorrentes da formação potencial das estruturas secundárias. A sequência geral de eventos incluiu duas partes. Um, a eficiente fosforilação de 1,80m de RNA, evidenciada pelo aparecimento de apenas um pico correspondente ao produto esperado.E segundo, o fragmento de enrolação decorrente do tratamento da mistura amostral com Xrn-1. Os mesmos resultados foram obtidos por meio de uma sequência diferente que continha duas lesões oxidativas. As possíveis alterações a considerar incluem a eliminação do uso do dispositivo de filtragem ou a consideração de diferentes matrizes para a localização de MALDI.Por exemplo, ácido sinapéico ou ácido picolínico. Os fragmentos de RNA foram obtidos a partir de um processo enzimático. Este processo foi estabelecido por acoplamento MALDI, análise eletroforética, síntese em fase sólida e dicromaísmo circular.O protocolo descrito tem potencial para ser utilizado em diversas áreas, desde pesquisas nas ciências químicas até aplicações no campo biomédico.

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Cell Biology

Biochemistry

Unit 1

Analyzing Cells and Proteins

SCIENTISTS IN ACTION

Time-resolved ElectroSpray Ionization Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry for Studying Protein Structure and Dynamics

resolvida no tempo com ionização por electrospray Hidrogénio-deutério troca Espectrometria de Massa para estudar a estrutura e dinâmica das proteínas

Intrinsically disordered proteins (IDPs) have long been a challenge to structural biologists due to their lack of stable secondary structure elements. ...

Bioquímica

Resolving Affinity Purified Protein Complexes by Blue Native PAGE and Protein Correlation Profiling

Resolver purificada por afinidade complexos de proteínas por Azul Native PAGE e Proteína Correlação Profiling

Most proteins act in association with others; hence, it is crucial to characterize these functional units in order to fully understand biological ...

Lipid Droplet Isolation for Quantitative Mass Spectrometry Analysis

Isolamento de gotículas de gordura para análise quantitativa Espectrometria de Massa

Lipid droplets are vital to the replication of a variety of different pathogens, most prominently the Hepatitis C Virus (HCV), as the putative site of ...

Sample Preparation for Mass Spectrometry-based Identification of RNA-binding Regions

Preparação da amostra para identificação de espectrometria de massa-baseada das regiões de ligação de RNA

Noncoding RNAs play important roles in several nuclear processes, including regulating gene expression, chromatin structure, and DNA repair. In most ...

The Determination of Protease Specificity in Mouse Tissue Extracts by MALDI-TOF Mass Spectrometry: Manipulating PH to Cause Specificity Changes

A determinação da especificidade da Protease no Mouse tecido extrai por espectrometria de massa MALDI-TOF: manipulando o PH para causar alterações de especificidade

Proteases have several biological functions, including protein activation/inactivation and food digestion. Identifying protease specificity is important ...

Proofreading and DNA Repair Assay Using Single Nucleotide Extension and MALDI-TOF Mass Spectrometry Analysis

Revisão e ensaio de reparo de DNA usando extensão de nucleotídeo único e análise de espectrometria de massa MALDI-TOF

The maintenance of the genome and its faithful replication is paramount for conserving genetic information. To assess high fidelity replication, we have ...

Analyzing Dynamic Protein Complexes Assembled On and Released From Biolayer Interferometry Biosensor Using Mass Spectrometry and Electron Microscopy

Analisando a dinâmica da proteína montada sobre e libertado da interferometria Biolayer Biosensor usando espectrometria de massa e de microscopia eletrônica

In vivo, proteins are often part of large macromolecular complexes where binding specificity and dynamics ultimately dictate functional outputs. In this ...

Capture and Identification of RNA-binding Proteins by Using Click Chemistry-assisted RNA-interactome Capture (CARIC) Strategy

Capture and Identification of RNA-binding Proteins by Using Click Chemistry-assisted RNA-interactome Capture CARIC Strategy

Captura e identificação de proteínas de ligação de RNA usando clique química assistida RNA-interactome capturam estratégia (CARIC)

A comprehensive identification of RNA-binding proteins (RBPs) is key to understanding the posttranscriptional regulatory network in cells. A widely used ...

Using the Open-Source MALDI TOF-MS IDBac Pipeline for Analysis of Microbial Protein and Specialized Metabolite Data

Usando o pipeline de código aberto MALDI TOF-MS IDBac para análise de proteína microbiana e dados metabólito especializados

In order to visualize the relationship between bacterial phylogeny and specialized metabolite production of bacterial colonies growing on nutrient agar, ...

Nitropeptide Profiling and Identification Illustrated by Angiotensin II

Perfil e identificação de nitropeptídeos ilustrados pela angiotensina II

Protein nitration is one of the most important post-translational modifications (PTM) on tyrosine residues and it can be induced by chemical actions of ...