Name: identification of rna fragments resulting from enzymatic degradation using maldi-tof mass spectrometry
Uploaded: 2022-04-11T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Identification of RNA Fragments Resulting from Enzymatic Degradation using MALDI-TOF Mass Spectrometry at JoVE.com

Важно отметить, что эта работа была результатом совместных усилий трех учреждений, двух исследовательских групп и одного основного объекта. Распределение и рабочая нагрузка осуществлялись следующим образом: экспрессия белка (Xrn-1) проводилась в Университете Денвера (Денвер, Штат Колорадо). Синтез, количественная оценка и эксперименты олигонуклеотидов (в основном ферментативная деградация) проводились в Университете Колорадо в Денвере (Денвер, штат Колорадо). Там же проводилась оптимизация. Обнаружение, приобретение и анализ MALDI-TOF проводились в Центре аналитических ресурсов Университета штата Колорадо. (Форт-Коллинз, Колорадо). SS хотела бы отметить гранты UROP Award (CU Denver) и Eureca (CU Denver) за поддержку. E. G.C. подтверждает поддержку со стороны NIGMS через R00GM115757. MJER подтверждает поддержку от NIGMS, через 1R15GM132816. K.B. подтверждает идентификатор ресурса: SCR_021758. Работа также была поддержана премией Teacher-Scholar Award (MJER), TH-21-028, от Фонда Генри Дрейфуса.

Для настоящего исследования использовалась ультрачистая вода без РНКазы (таблица 1).
1. Определение концентрации раствора РНК
<ol><li>Подготовьте образец РНК, выполнив следующие действия.<ol>
<li>Используют микроцентрифужную трубку (0,6 мл) для приготовления ?...

<ol>
	<li>Tanaka, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+and+polymer+analyses+up+to+m/z+100+000+by+laser+ionization+time-of-flight+mass+spectrometry.">Protein and polymer analyses up to m/z 100 000 by laser ionization time-of-flight mass spectrometry.</a> Rapid Communications in Mass Spectrometry. 2 (8), 151-153 (1988).</li><li>Karas, M., Hillenkamp, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+desorption+ionization+of+proteins+with+molecular+masses+exceeding+10,000+daltons.">Laser desorption ionization of proteins with molecular masses exceeding 10,000 daltons.</a> Analytical Chemistry. 60 (20), 2299-2301 (1988).</li><li>Zenobi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemistry+nobel+prize+2002+goes+to+analytical+chemistry.">Chemistry nobel prize 2002 goes to analytical chemistry.</a> Chimia. 57, 73 (2003).</li><li>Aristri, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bio-based+polyurethane+resins+derived+from+tannin:+Source,+synthesis,+characterization,+and+application.">Bio-based polyurethane resins derived from tannin: Source, synthesis, characterization, and application.</a> Forests. 12 (11), 1516 (2021).</li><li>Pedrazzani, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=5-n-Alkylresorcinol+profiles+in+different+cultivars+of+einkorn,+emmer+spelt,+common+wheat,+and+tritordeum.">5-n-Alkylresorcinol profiles in different cultivars of einkorn, emmer spelt, common wheat, and tritordeum.</a> Journal of Agricultural and Food Chemistry. 69 (47), 14092-14102 (2021).</li><li>Unger, M. S., Blank, M., Enzlein, T., Hopf, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Label-free+cell+assays+to+determine+compound+uptake+or+drug+action+using+MALDI-TOF+mass+spectrometry.">Label-free cell assays to determine compound uptake or drug action using MALDI-TOF mass spectrometry.</a> Nature Protocols. 16 (12), 5533-5558 (2021).</li><li>Croxatto, A., Prod'hom, G., Greub, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Applications+of+MALDI-TOF+mass+spectrometry+in+clinical+diagnostic+microbiology.">Applications of MALDI-TOF mass spectrometry in clinical diagnostic microbiology.</a> FEMS Microbiology Reviews. 36 (2), 380-407 (2012).</li><li>Kaufmann, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Marrix-assisted+laser+desorption+ionization+(MALDI)+mass+spectrometry:+a+novel+analytical+tool+in+molecular+biology+and+biotechnology.">Marrix-assisted laser desorption ionization (MALDI) mass spectrometry: a novel analytical tool in molecular biology and biotechnology.</a> Journal of Biotechnology. 41 (2-3), 155-175 (1995).</li><li>Kiggins, C., Skinner, A., Resendiz, M. J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=8-Oxo-7,8-dihydroguanosine+inhibits+or+changes+the+selectivity+of+the+theophylline+aptamer.">8-Oxo-7,8-dihydroguanosine inhibits or changes the selectivity of the theophylline aptamer.</a> ChemBioChem. 21 (9), 1347-1355 (2020).</li><li>Chapman, E. G., DeRose, V. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzymatic+processing+of+platinated+RNAs.">Enzymatic processing of platinated RNAs.</a> Journal of the American Chemical Society. 132 (6), 1946-1952 (2010).</li><li>Resendiz, M. J. E., Pottiboyina, V., Sevilla, M. D., Greengerg, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+strand+scission+in+double+stranded+RNA+via+a+C5-pyrimidine+radical.">Direct strand scission in double stranded RNA via a C5-pyrimidine radical.</a> Journal of the American Chemical Society. 134 (8), 3917-3924 (2012).</li><li>Joyner, J. C., Keuper, K. D., Cowan, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+RNA+cleavage+by+MALDI-TOF+mass+spectrometry.">Analysis of RNA cleavage by MALDI-TOF mass spectrometry.</a> Nucleic Acids Research. 41 (1), 2 (2013).</li><li>Ghodke, P. P., Guengerich, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+polymerases+&#951;+and+&#954;+bypass+N2-guanine-O6-alkylguanine+DNA+alkyltransferase+cross-linked+DNA+peptides.">DNA polymerases &#951; and &#954; bypass N2-guanine-O6-alkylguanine DNA alkyltransferase cross-linked DNA peptides.</a> Journal of Biological Chemistry. 297 (4), 101124 (2021).</li><li>JoVE. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=JoVE+Science+Education+Database.+Biochemistry.+MALDI-TOF+Mass+Spectrometry.">JoVE Science Education Database. Biochemistry. MALDI-TOF Mass Spectrometry.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2021).</li><li>Schr&#246;tner, P., Gunzer, F., Sch&#252;ppel, J., Rudolph, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+rare+bacterial+pathogens+by+16S+rRNA+gene+sequencing+and+MALDI-TOF+MS.">Identification of rare bacterial pathogens by 16S rRNA gene sequencing and MALDI-TOF MS.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (113), e53176 (2016).</li><li>Su, K. -. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proofreading+and+DNA+repair+assay+using+single+nucleotide+extension+and+MALDI-TOF+mass+spectrometry+analysis.">Proofreading and DNA repair assay using single nucleotide extension and MALDI-TOF mass spectrometry analysis.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (136), e57862 (2018).</li><li>Fagerquist, C. K., Rojas, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+antibacterial+immunity+proteins+in+Escherichia+coli+using+MALDI-TOF-TOF-MS/MS+and+Top-Down+proteomic+analysis.">Identification of antibacterial immunity proteins in Escherichia coli using MALDI-TOF-TOF-MS/MS and Top-Down proteomic analysis.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (171), e62577 (2021).</li><li>Phillips, C. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Processing+of+RNA+containing+8-Oxo-7,8-dihydroguanosine+(8-oxoG)+by+the+exoribonuclease+Xrn-1.">Processing of RNA containing 8-Oxo-7,8-dihydroguanosine (8-oxoG) by the exoribonuclease Xrn-1.</a> Frontiers in Molecular Biosciences. 8, 780315 (2021).</li><li>Francis, A. J., Resendiz, M. J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protocol+for+the+solid-phase+synthesis+of+oligomers+of+RNA+containing+a+2'-O-thiophenylmethyl+modification+and+characterization+via+circular+dichroism.">Protocol for the solid-phase synthesis of oligomers of RNA containing a 2'-O-thiophenylmethyl modification and characterization via circular dichroism.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (125), e56189 (2017).</li><li>Langeberg, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biochemical+characterization+of+yeast+Xrn1.">Biochemical characterization of yeast Xrn1.</a> Biochemistry. 59 (15), 1493-1507 (2020).</li><li>Stevens, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+and+characterization+of+a+Saccharomyces+cerevisiae+exoribonuclease+which+yields+5'-mononucleotides+by+a+5'+leads+to+3'+mode+of+hydrolysis.">Purification and characterization of a Saccharomyces cerevisiae exoribonuclease which yields 5'-mononucleotides by a 5' leads to 3' mode of hydrolysis.</a> Journal of Biological Chemistry. 255 (7), 3080-3085 (1980).</li><li>Yan, L. L., Simms, C. L., McLoughlin, F., Vierstra, R. D., Zaher, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxidation+and+alkylation+stresses+activate+ribosome-quality+control.">Oxidation and alkylation stresses activate ribosome-quality control.</a> Nature Communications. 10 (1), 5611 (2019).</li><li>Fasnacht, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+23S+rRNA+modification+ho5C2501+benefits+Escherichia+coli+under+oxidative+stress.">Dynamic 23S rRNA modification ho5C2501 benefits Escherichia coli under oxidative stress.</a> Nucleic Acids Research. 50 (1), 473-489 (2022).</li><li>Estevez, M., Valesyan, S., Jora, M., Limbach, P. A., Addepalli, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxidative+damage+to+RNA+is+altered+by+the+presence+of+interacting+proteins+or+modified+nucleosides.">Oxidative damage to RNA is altered by the presence of interacting proteins or modified nucleosides.</a> Frontiers in Molecular Biosciences. 8, 697149 (2021).</li><li>Tomar, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+sequence+modulates+the+efficiency+of+NEIL1-catalyzed+excision+of+the+aflatoxin+B1-induced+formamidopyrimidine+guanine+adduct.">DNA sequence modulates the efficiency of NEIL1-catalyzed excision of the aflatoxin B1-induced formamidopyrimidine guanine adduct.</a> Journal of the American Chemical Society. 34 (3), 901-911 (2021).</li><li>Gaffney, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV-1+env-dependent+cell+killing+by+bifunctional+small-molecule/peptide+conjugates.">HIV-1 env-dependent cell killing by bifunctional small-molecule/peptide conjugates.</a> ACS Chemical Biology. 16 (1), 193-204 (2021).</li><li>Sikorski, E. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+display+of+a+chemoattractant+agonist+on+cancer+cells+activates+the+formyl+peptide+receptor+1+on+immune+cells.">Selective display of a chemoattractant agonist on cancer cells activates the formyl peptide receptor 1 on immune cells.</a> ChemBioChem. , 202100521 (2022).</li><li>Kubo, T., Nishimura, Y., Sato, Y., Yanagihara, K., Seyama, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sixteen+different+types+of+lipid-conjugated+siRNAs+containing+saturated+and+unsaturated+fatty+Acids+and+exhibiting+enhanced+RNAi+potency.">Sixteen different types of lipid-conjugated siRNAs containing saturated and unsaturated fatty Acids and exhibiting enhanced RNAi potency.</a> ACS Chemical Biology. 16 (1), 150-164 (2021).</li></ol>

Основная проблема в этом рабочем процессе возникла между завершением экспериментов и проведением масс-спектрометрического анализа. Эксперименты были проведены и завершены в Университете Колорадо в Денвере и отправлены (ночью) на объекты Университета штата Колорадо. Сбор данных осущ?...

MALDI-TOF 1,2,3 является широко используемым методом для характеристики и/или обнаружения молекул различных размеров и характеристик. Некоторые из его применений включают различные приложения, такие как обнаружение танинов из природных ресурсов4, визуализация метаболитов в пище5, обнаружение или мониторинг клеточных лекарственных мишеней или маркеров6 и клиническая диагностика7, чтобы назвать несколько. Для настоящей работы имеет отношение использование MALDI-TOF с ДНК или РНК, с его использованием на олигонуклеотидах, датируемых более чем тремя десятилетиями8, где было отмечено несколько ограничений. Этот метод в настоящее время превратился в надежное, широко используемое средство для характеристики как биополимеров9, так и идентификации/понимания химических и биохимических реакций, например, характеристики платинированных участков в РНК10, идентификации фрагментов РНК после расщепления нитей 11,12 или образования поперечных связей белок-ДНК 13 . Таким образом, полезно проиллюстрировать и выделить важные аспекты использования этой техники. Основы MALDI-TOF были описаны в видеоформате, а также14 и не будут более подробно рассмотрены в настоящем документе. Кроме того, его применение в контексте ДНК или белка было ранее описано и проиллюстрировано в указанном формате 15,16,17.
Протокол обнаружения фрагментов РНК, образующихся после ферментативного гидролиза, приведен в настоящем документе. Экспериментальная модель была выбрана на основе недавнего открытия, опубликованного нашей группой18, где MALDI-TOF был использован для определения уникальной реакционной способности между экзорибонуклеазой Xrn-1 и олигонуклеотидами РНК, содержащими окислительное поражение 8-oxoG. 20-нуклеотидные длинные нити получали путем твердофазного синтеза19, [5'-CAU GAA ACA A(8-oxoG)G CUA AAA GU] и [5'-CAU GAA ACA ACA A(8-oxoG)(8-oxoG) CUA AAA GU], в то время как Xrn-1 экспрессировали и очищали в соответствии с ранее описанным отчетом20. Короче говоря, Xrn-121 представляет собой экзорибонуклеазу 5'-3' с различными ключевыми биологическими ролями, которые разлагают несколько типов РНК, включая окисленную РНК22. Было установлено, что процессичность фермента останавливается при столкновении с 8-оксоG, что приводило к фрагментам РНК, содержащим 5'-фосфорилированные концы [5'-H2PO4-(8-oxoG)G CUA AAA GU], [5'-H2PO4-(8-oxoG)(8-oxoG) CUA AAA GU] и [5'-H2PO4-(8-oxoG) CUA AAA GU]18.
Наконец, важно отметить, что масс-спектрометрия является мощным методом, который с помощью различных методологий может быть адаптирован к другим целям23,24; таким образом, выбор правильного метода ионизации, а также других экспериментальных установок имеет первостепенное значение.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.6 mL MCT Graduated Violet</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>05-408-127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6&#8217;-Trihydroxyacetophenone monohydrate 98%</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>480-66-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile 99.9%, HPLC grade</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>75-05-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adenosine triphosphate, 10 mM</td>
			<td>New Englang Bioscience</td>
			<td>P0756S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium citrate, dibasic 98%</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>3012-65-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium Fluoride 98.0%, ACS grade</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>12125-01-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bruker bacterial test standard</td>
			<td>Bruker Daltonics</td>
			<td>8255343</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Commercial source of Xrn-1</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>M0338S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diethyl pyrocarbonate, 97%</td>
			<td>ACROS Organics</td>
			<td>A0368487</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flex analysis software</td>
			<td>Bruker daltonics</td>
			<td></td>
			<td>FlexAnalysis software version 3.4, Bruker Daltonics</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lambda 365 UV-vis spectrophotometer</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MALDI plate: MSP 96 ground steel target</td>
			<td>Bruker Daltonics</td>
			<td>280799</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mass Spectrometer</td>
			<td>Bruker</td>
			<td></td>
			<td>Microflex LRFTOF mass spectrometer (Bruker Daltonics, Billerica, MA)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mili-Q IQ 7000</td>
			<td>Milipore Sigma</td>
			<td></td>
			<td>A Mili-Q system was used to purify all water used in this work</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanosep Centrifugal Devices with OmegaTM Membrane 10 K, blue (24/pkg)</td>
			<td>Pall Corporation</td>
			<td>OD010C33</td>
			<td>filter media, Omega (modified polyethersulfone) 10 K pore size</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEBuffer 3</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>B7003S</td>
			<td>This is solution B</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oligo Analyzer tool</td>
			<td>IDT-DNA</td>
			<td></td>
			<td>https://www.idtdna.com/calc/analyzer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tips P10</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02-707-441</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tips P200</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02-707-419</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase Away</td>
			<td>Molecular BioProducts</td>
			<td>7005-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 Polynucleotide Kinase</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>M0201S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 Polynucleotide Kinase Reaction Buffer</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>B0201S</td>
			<td>This is solution A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triflouroacetic Acid</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>76-05-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xrn-1 exoribonuclease</td>
			<td>Expressed in house</td>
			<td>See ref. 20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZipTip Pipette Tips for Sample preparation</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>ZTC 18S 096</td>
			<td>10 &#181;L pipette tips loaded with a C18 standard 0.6 &#181;L bed</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

identification of rna fragments resulting from enzymatic degradation using maldi-tof mass spectrometry

РНК является биополимером, присутствующим во всех областях жизни, и его взаимодействия с другими молекулами и / или реактивными видами, например, ДНК, белками, ионами, лекарствами и свободными радикалами, распространены повсеместно. В результате РНК подвергается различным реакциям, которые включают ее расщепление, деградацию или модификацию, что приводит к биологически значимым видам с различными функциями и последствиями. Одним из примеров является окисление гуанина до 7,8-дигидро-8-оксогуанина (8-оксоG), которое может происходить в присутствии активных форм кислорода (АФК). В целом, процедуры, которые характеризуют такие продукты и преобразования, в значительной степени ценны для научного сообщества. С этой целью масс-спектрометрия времени пролета с матричной лазерной десорбцией ионизации (MALDI-TOF) является широко используемым методом. Настоящий протокол описывает, как охарактеризовать фрагменты РНК, образующиеся после ферментативной обработки. В выбранной модели используется реакция между РНК и экзорибонуклеазой Xrn-1, где ферментативное сбраживание останавливается на окисленных участках. Две 20-нуклеотидные длинные последовательности РНК [5'-CAU GAA ACA ACA A(8-oxoG)G CUA AAA GU] и [5'-CAU GAA ACA ACA A(8-oxoG)(8-oxoG) CUA AAA GU] были получены путем твердофазного синтеза, количественно оценены С помощью спектроскопии UV-vis и охарактеризованы с помощью MALDI-TOF. Полученные нити затем (1) 5'-фосфорилировали и характеризовали с помощью MALDI-TOF; (2) обработанные Xrn-1; (3) отфильтрованные и обессоленные; (4) проанализировано с помощью MALDI-TOF. Эта экспериментальная установка привела к однозначной идентификации фрагментов, связанных с остановкой Xrn-1: [5'-H2PO4-(8-oxoG)G CUA AAA GU], [5'-H2PO4-(8-oxoG)(8-oxoG) CUA AAA GU] и [5'-H2PO4-(8-oxoG) CUA AAA GU]. Описанные эксперименты проводились с 200 пикомолью РНК (20 пмоль, используемых для анализа MALDI); однако более низкие количества могут привести к обнаруживаемым пикам с помощью спектрометров, использующих лазерные источники с большей мощностью, чем тот, который используется в этой работе. Важно отметить, что описанная методология может быть обобщена и потенциально расширена до идентификации продукта для других процессов, включающих РНК и ДНК, и может помочь в характеристике/выяснении других биохимических путей.

Олигонуклеотиды, используемые в этой работе, были синтезированы, охарактеризованы и количественно определены перед использованием. Концентрацию всех олигонуклеотидов определяли с помощью УФ-вис-спектроскопии, зарегистрированной при 90 °C, чтобы избежать ошибочных показаний, воз?...

Watch this Scientific Journal Video about Identification of RNA Fragments Resulting from Enzymatic Degradation using MALDI-TOF Mass Spectrometry at JoVE.com

Identification of RNA Fragments Resulting from Enzymatic Degradation using MALDI-TOF Mass Spectrometry

MALDI-TOF был использован для характеристики фрагментов, полученных из реактивности между окисленной РНК и экзорибонуклеазой Xrn-1. Настоящий протокол описывает методологию, которая может быть применена к другим процессам, включающим РНК и/или ДНК.

Идентификация фрагментов РНК в результате ферментативной деградации с помощью масс-спектрометрии MALDI-TOF

RNA is a biopolymer present in all domains of life, and its interactions with other molecules and/or reactive species, e.g., DNA, proteins, ions, drugs, ...

Масс-спектрометрия широко используется для различных применений. Методика в данной статье обеспечивает однозначную характеристику фрагментов РНК, полученных в результате ферментативного процесса in vitro. Преимущества этого метода включают в себя то, что достигается пик молекулы железа, что эксперименты могут быть проведены с небольшими количествами материала для применения in vitro, и что протокол может быть выполнен с минимальной подготовкой.Описанная методика может быть широко применена для изучения процессов с участием ДНК, РНК или белков. Примеры включают биохимические превращения, такие как перекрестная информация, идентификация химических модификаций или другие взаимодействия биополимеров и реакционная способность. Одна из трудностей может возникнуть из-за доступности спектрометра MALDI или основных объектов, которые предлагают эту услугу.Другим аспектом является установление предела обнаружения, который может быть выше или ниже в зависимости от прибора. Для начала включите спектрофотометр UV-Vis, затем нажмите на значок PerkinElmer UV WinLab, чтобы открыть окно управления работой прибора. Включите спектрофотометр контроллера температуры Пельтье с помощью переключателя, расположенного справа от прибора, и нажмите на Scan-Lambda 365, представленную в разделе «Базовые методы».Откроется другой экран и пользователю будет предложено убедиться, что держатели ячеек пусты. Нажмите OK и позвольте инструменту проводить системные проверки. Теперь настройте параметры сканирования, выбрав Сбор данных.В новом окне в разделе Настройки сканирования измените начало на 350 нанометров и конец на 215 нанометров. Активируйте Пельтье, выбрав плюс слева от аксессуара. Затем нажмите на Multiple Cell Peltier, измените температурные градусы Цельсия на 25 и нажмите на Peltier On.Перейдите на вкладку информации о образце и введите желаемое количество образцов, имена и положение ячейки.Нажмите на Autozero и вставьте кювету, содержащую фоновое решение. Нажмите кнопку Пуск и вставьте кювету в нужную ячейку и убедитесь, что окно кюветы ориентировано параллельно передней грани инструмента. Теперь нажмите кнопку ОК, чтобы начать первое сканирование при температуре 25 градусов по Цельсию.Для измерений при более высоких температурах нажмите на Multiple Cell Peltier, измените температуру до желаемой температуры образца и повторите сканирование. Нажмите «Файл», «Экспорт», выберите нужное расположение файла и выберите XY Data для получения текстового файла. Для выполнения 5'фосфорилирования РНК готовят раствор в микроцентрифужной трубке объемом 0,6 микролитра, добавляя 33,5 микролитра воды без РНКазы, пять микролитров раствора А, шесть микролитов 10-миллимолярного аденозинтрифосфата, один микролит из 200 микромолярного водного раствора РНК и 4,5 микролитра полинуклеотидкиназы и аккуратно перемешивают раствор.Инкубируйте реакционную смесь при температуре 37 градусов Цельсия в течение 45 минут, поместив ее на водяную баню. Затем инактивируют фермент путем помещения реакционной трубки в тепловой блок, предварительно нагретый при 65 градусах Цельсия в течение 10 минут. Дайте раствору остыть до комнатной температуры, чтобы получить окончательный 5'фосфорилированный раствор РНК.После инкубации используют 50-микролитр этого раствора, добавляют пять микролитров раствора В и пять микролитров 1-фемтомольного раствора Xrn-1 для выполнения гидролиза РНК. Инкубируют реакционную трубку при комнатной температуре в течение двух часов. Переложите эту реакционную смесь на центробежное устройство размером с пору с 10 килодалтонами и фильтруйте ферменты центрифугированием в течение 10 минут при 700кратном G. Перенесите фильтрат в 0,6-миллилитровую центрифужную трубку.Затем добавьте 20 микролитров рваной воды для промывки остаточной РНК на центробежной трубке с последующим центрифугированием. Наконец, соедините этот фильтрат с полученным фильтратом, полученным ранее центрифугированием в центробежном устройстве размером с пору 10 килодалтонов, и заморозьте раствор при нуле градусов Цельсия или сосуде для анализа. Для обессоливания и концентрирования образца используйте коммерчески доступные катионообменные наконечники пипетки C18, загруженные слоем хроматографической среды C18 на его конце.Для этого поместите наконечник пипетки объемом 10 микролитра на 10-микролитровую пипетку и дважды промыть этот наконечник 50%-ным водным раствором ацетилнитрила. Каждый раз выбрасывайте использованные объемы в отдельную пробирку для отходов и уравновешивайте наконечник C18 10 микролитрами 0,1% водного раствора трифторуксусной кислоты два раза. Вручную извлеките наконечник C18 из пипетки и закрепите его на 200-микролитровой пипетке, содержащей наконечник пипетки P200.Затем погружают наконечник С18 в полученный раствор, приготовленный при гидролизе олигонуклеотидов РНК Xrn-1 и аспират высвобождают раствор через наконечник С18 10 раз. Теперь отсоедините наконечник C18 от пипетки P200, поместите его в 10-микролитровую пипетку и промыте наконечник C18, используя водный раствор 0,1% раствора трифторуксусной кислоты дважды. Каждый раз выбрасывайте использованные объемы в отдельную пробирку для отходов.Два раза вымойте наконечник C18 водой без 10 микролитров. Для обнаружения на пластине MALDI элюируют олигонуклеотид РНК из наконечника C18, погружая образец в нужную матрицу и дозируя раствор обратно в пробирку 10 раз. Выложите этот раствор на два отдельных пятна по одному микролитру каждое на пластине и дайте пятнам высохнуть на воздухе.Концентрация РНК, использованная в этой работе, была определена с помощью УФ-видимой спектроскопии, зарегистрированной при 90 градусах Цельсия, чтобы избежать ошибочных показаний, возникающих в результате потенциального образования вторичных структур. Общая последовательность событий состояла из двух частей. Во-первых, эффективное 5'фосфорилирование РНК, о чем свидетельствует появление только одного пика, соответствующего ожидаемому продукту.И второе, фрагмент сваливания, возникающий при обработке образца смеси Xrn-1. Те же результаты были получены с использованием другой последовательности, которая содержала два окислительных поражения. Потенциальные изменения, которые следует рассмотреть, включают отказ от использования фильтрующего устройства или рассмотрение различных матриц для обнаружения MALDI.Например, синапиновая кислота или пиколиновая кислота. Фрагменты РНК были получены в результате ферментативного процесса. Этот процесс был установлен путем соединения MALDI, электрофоретического анализа, твердофазного синтеза и кругового дихроизма.Описанный протокол имеет потенциал для использования в различных областях, от исследований в области химических наук до приложений в биомедицинской области.

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Cell Biology

Biochemistry

Unit 1

Analyzing Cells and Proteins

SCIENTISTS IN ACTION

Time-resolved ElectroSpray Ionization Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry for Studying Protein Structure and Dynamics

Времяразрешенная ионизацией электрораспылением водорода дейтерий Обмен масс-спектрометрии для изучения белка структуры и динамики

Intrinsically disordered proteins (IDPs) have long been a challenge to structural biologists due to their lack of stable secondary structure elements. ...

Resolving Affinity Purified Protein Complexes by Blue Native PAGE and Protein Correlation Profiling

Разрешающая Affinity Очищенная Белковые комплексы от Синей Native ПААГ и белка корреляции профилирование

Most proteins act in association with others; hence, it is crucial to characterize these functional units in order to fully understand biological ...

Lipid Droplet Isolation for Quantitative Mass Spectrometry Analysis

Липидное Выделение капельного для количественной анализа масс-спектрометрии

Lipid droplets are vital to the replication of a variety of different pathogens, most prominently the Hepatitis C Virus (HCV), as the putative site of ...

Sample Preparation for Mass Spectrometry-based Identification of RNA-binding Regions

Пробоподготовка для массы на основе спектрометрии идентификации RNA-связывая регионов

Noncoding RNAs play important roles in several nuclear processes, including regulating gene expression, chromatin structure, and DNA repair. In most ...

The Determination of Protease Specificity in Mouse Tissue Extracts by MALDI-TOF Mass Spectrometry: Manipulating PH to Cause Specificity Changes

Определение специфики протеазы в ткани мыши извлекает, масс-спектрометрия MALDI-TOF: манипулирования PH вызвать специфики изменения

Proteases have several biological functions, including protein activation/inactivation and food digestion. Identifying protease specificity is important ...

Proofreading and DNA Repair Assay Using Single Nucleotide Extension and MALDI-TOF Mass Spectrometry Analysis

Корректура и ДНК ремонт пробирного анализа единичных нуклеотидных расширение и MALDI-TOF масс-спектрометрии с помощью

The maintenance of the genome and its faithful replication is paramount for conserving genetic information. To assess high fidelity replication, we have ...

Analyzing Dynamic Protein Complexes Assembled On and Released From Biolayer Interferometry Biosensor Using Mass Spectrometry and Electron Microscopy

Анализ динамических белковых комплексов монтируется на и освобождены от Biolayer интерферометрии биосенсора с использованием масс-спектрометрии и электронной микроскопии

In vivo, proteins are often part of large macromolecular complexes where binding specificity and dynamics ultimately dictate functional outputs. In this ...

Capture and Identification of RNA-binding Proteins by Using Click Chemistry-assisted RNA-interactome Capture (CARIC) Strategy

Capture and Identification of RNA-binding Proteins by Using Click Chemistry-assisted RNA-interactome Capture CARIC Strategy

Захват и идентификации RNA-связывая протеинов с помощью щелчка при содействии химия РНК interactome захвата (ЦАРСКОЕ) стратегии

A comprehensive identification of RNA-binding proteins (RBPs) is key to understanding the posttranscriptional regulatory network in cells. A widely used ...

Using the Open-Source MALDI TOF-MS IDBac Pipeline for Analysis of Microbial Protein and Specialized Metabolite Data

Использование трубопровода MALDI TOF-MS IDBac с открытым исходным кодом для анализа микробного белка и специализированных метаболитных данных

In order to visualize the relationship between bacterial phylogeny and specialized metabolite production of bacterial colonies growing on nutrient agar, ...

Nitropeptide Profiling and Identification Illustrated by Angiotensin II

НитропептидНое профилирование и идентификация Иллюстрировано Ангиотензином II

Protein nitration is one of the most important post-translational modifications (PTM) on tyrosine residues and it can be induced by chemical actions of ...