Name: identification of rna fragments resulting from enzymatic degradation using maldi-tof mass spectrometry
Uploaded: 2022-04-11T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Identification of RNA Fragments Resulting from Enzymatic Degradation using MALDI-TOF Mass Spectrometry at JoVE.com

Bu çalışmanın üç kurum, iki araştırma grubu ve bir çekirdek tesis arasında işbirliğine dayalı bir çaba olduğunu belirtmek önemlidir. Dağılım ve iş yükü şu şekilde gerçekleştirildi: Protein (Xrn-1) ekspresyonu Denver Üniversitesi'nde (Denver, CO) gerçekleştirildi. Oligonükleotid sentezi, nicelleştirme ve deney (esas olarak enzimatik bozunma) Colorado Denver Üniversitesi'nde (Denver, CO) gerçekleştirildi. Optimizasyon da orada gerçekleştirildi. MALDI-TOF tespiti, satın alma ve analizi, Colorado Eyalet Üniversitesi'ndeki Analitik Kaynaklar Çekirdek Tesisi'nde gerçekleştirildi. (Fort Collins, CO). SS, destek için bir UROP Ödülü (CU Denver) ve Eureca hibelerini (CU Denver) kabul etmek istiyor. E. G.C., R00GM115757 aracılığıyla NIGMS'nin desteğini kabul eder. MJER, 1R15GM132816 aracılığıyla NIGMS'nin desteğini kabul eder. K.B. kaynak kimliğini kabul eder: SCR_021758. Çalışma ayrıca Henry Dreyfus Vakfı'ndan TH-21-028 Öğretmen-Bilim İnsanı Ödülü (MJER) tarafından da desteklendi.

Bu çalışmada RNaz içermeyen ultra saf su (Tablo 1) kullanılmıştır.
1. RNA çözeltisinin konsantrasyon tayini
<ol><li>Aşağıdaki adımları izleyerek RNA örneğini hazırlayın.<ol>
<li>1 μL stok çözeltisini (katı faz sentezi yoluyla elde edilen) 19 μL RNaz içermeyenH2O'ya seyrelterek bir RNA çözeltisi hazırlamak için bir mikrosantrifüj tüpü (0.6 mL) kullanın. NOT: Çok çeşitli küvetl...

<ol>
	<li>Tanaka, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+and+polymer+analyses+up+to+m/z+100+000+by+laser+ionization+time-of-flight+mass+spectrometry.">Protein and polymer analyses up to m/z 100 000 by laser ionization time-of-flight mass spectrometry.</a> Rapid Communications in Mass Spectrometry. 2 (8), 151-153 (1988).</li><li>Karas, M., Hillenkamp, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+desorption+ionization+of+proteins+with+molecular+masses+exceeding+10,000+daltons.">Laser desorption ionization of proteins with molecular masses exceeding 10,000 daltons.</a> Analytical Chemistry. 60 (20), 2299-2301 (1988).</li><li>Zenobi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemistry+nobel+prize+2002+goes+to+analytical+chemistry.">Chemistry nobel prize 2002 goes to analytical chemistry.</a> Chimia. 57, 73 (2003).</li><li>Aristri, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bio-based+polyurethane+resins+derived+from+tannin:+Source,+synthesis,+characterization,+and+application.">Bio-based polyurethane resins derived from tannin: Source, synthesis, characterization, and application.</a> Forests. 12 (11), 1516 (2021).</li><li>Pedrazzani, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=5-n-Alkylresorcinol+profiles+in+different+cultivars+of+einkorn,+emmer+spelt,+common+wheat,+and+tritordeum.">5-n-Alkylresorcinol profiles in different cultivars of einkorn, emmer spelt, common wheat, and tritordeum.</a> Journal of Agricultural and Food Chemistry. 69 (47), 14092-14102 (2021).</li><li>Unger, M. S., Blank, M., Enzlein, T., Hopf, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Label-free+cell+assays+to+determine+compound+uptake+or+drug+action+using+MALDI-TOF+mass+spectrometry.">Label-free cell assays to determine compound uptake or drug action using MALDI-TOF mass spectrometry.</a> Nature Protocols. 16 (12), 5533-5558 (2021).</li><li>Croxatto, A., Prod'hom, G., Greub, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Applications+of+MALDI-TOF+mass+spectrometry+in+clinical+diagnostic+microbiology.">Applications of MALDI-TOF mass spectrometry in clinical diagnostic microbiology.</a> FEMS Microbiology Reviews. 36 (2), 380-407 (2012).</li><li>Kaufmann, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Marrix-assisted+laser+desorption+ionization+(MALDI)+mass+spectrometry:+a+novel+analytical+tool+in+molecular+biology+and+biotechnology.">Marrix-assisted laser desorption ionization (MALDI) mass spectrometry: a novel analytical tool in molecular biology and biotechnology.</a> Journal of Biotechnology. 41 (2-3), 155-175 (1995).</li><li>Kiggins, C., Skinner, A., Resendiz, M. J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=8-Oxo-7,8-dihydroguanosine+inhibits+or+changes+the+selectivity+of+the+theophylline+aptamer.">8-Oxo-7,8-dihydroguanosine inhibits or changes the selectivity of the theophylline aptamer.</a> ChemBioChem. 21 (9), 1347-1355 (2020).</li><li>Chapman, E. G., DeRose, V. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzymatic+processing+of+platinated+RNAs.">Enzymatic processing of platinated RNAs.</a> Journal of the American Chemical Society. 132 (6), 1946-1952 (2010).</li><li>Resendiz, M. J. E., Pottiboyina, V., Sevilla, M. D., Greengerg, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+strand+scission+in+double+stranded+RNA+via+a+C5-pyrimidine+radical.">Direct strand scission in double stranded RNA via a C5-pyrimidine radical.</a> Journal of the American Chemical Society. 134 (8), 3917-3924 (2012).</li><li>Joyner, J. C., Keuper, K. D., Cowan, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+RNA+cleavage+by+MALDI-TOF+mass+spectrometry.">Analysis of RNA cleavage by MALDI-TOF mass spectrometry.</a> Nucleic Acids Research. 41 (1), 2 (2013).</li><li>Ghodke, P. P., Guengerich, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+polymerases+&#951;+and+&#954;+bypass+N2-guanine-O6-alkylguanine+DNA+alkyltransferase+cross-linked+DNA+peptides.">DNA polymerases &#951; and &#954; bypass N2-guanine-O6-alkylguanine DNA alkyltransferase cross-linked DNA peptides.</a> Journal of Biological Chemistry. 297 (4), 101124 (2021).</li><li>JoVE. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=JoVE+Science+Education+Database.+Biochemistry.+MALDI-TOF+Mass+Spectrometry.">JoVE Science Education Database. Biochemistry. MALDI-TOF Mass Spectrometry.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2021).</li><li>Schr&#246;tner, P., Gunzer, F., Sch&#252;ppel, J., Rudolph, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+rare+bacterial+pathogens+by+16S+rRNA+gene+sequencing+and+MALDI-TOF+MS.">Identification of rare bacterial pathogens by 16S rRNA gene sequencing and MALDI-TOF MS.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (113), e53176 (2016).</li><li>Su, K. -. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proofreading+and+DNA+repair+assay+using+single+nucleotide+extension+and+MALDI-TOF+mass+spectrometry+analysis.">Proofreading and DNA repair assay using single nucleotide extension and MALDI-TOF mass spectrometry analysis.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (136), e57862 (2018).</li><li>Fagerquist, C. K., Rojas, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+antibacterial+immunity+proteins+in+Escherichia+coli+using+MALDI-TOF-TOF-MS/MS+and+Top-Down+proteomic+analysis.">Identification of antibacterial immunity proteins in Escherichia coli using MALDI-TOF-TOF-MS/MS and Top-Down proteomic analysis.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (171), e62577 (2021).</li><li>Phillips, C. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Processing+of+RNA+containing+8-Oxo-7,8-dihydroguanosine+(8-oxoG)+by+the+exoribonuclease+Xrn-1.">Processing of RNA containing 8-Oxo-7,8-dihydroguanosine (8-oxoG) by the exoribonuclease Xrn-1.</a> Frontiers in Molecular Biosciences. 8, 780315 (2021).</li><li>Francis, A. J., Resendiz, M. J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protocol+for+the+solid-phase+synthesis+of+oligomers+of+RNA+containing+a+2'-O-thiophenylmethyl+modification+and+characterization+via+circular+dichroism.">Protocol for the solid-phase synthesis of oligomers of RNA containing a 2'-O-thiophenylmethyl modification and characterization via circular dichroism.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (125), e56189 (2017).</li><li>Langeberg, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biochemical+characterization+of+yeast+Xrn1.">Biochemical characterization of yeast Xrn1.</a> Biochemistry. 59 (15), 1493-1507 (2020).</li><li>Stevens, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+and+characterization+of+a+Saccharomyces+cerevisiae+exoribonuclease+which+yields+5'-mononucleotides+by+a+5'+leads+to+3'+mode+of+hydrolysis.">Purification and characterization of a Saccharomyces cerevisiae exoribonuclease which yields 5'-mononucleotides by a 5' leads to 3' mode of hydrolysis.</a> Journal of Biological Chemistry. 255 (7), 3080-3085 (1980).</li><li>Yan, L. L., Simms, C. L., McLoughlin, F., Vierstra, R. D., Zaher, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxidation+and+alkylation+stresses+activate+ribosome-quality+control.">Oxidation and alkylation stresses activate ribosome-quality control.</a> Nature Communications. 10 (1), 5611 (2019).</li><li>Fasnacht, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+23S+rRNA+modification+ho5C2501+benefits+Escherichia+coli+under+oxidative+stress.">Dynamic 23S rRNA modification ho5C2501 benefits Escherichia coli under oxidative stress.</a> Nucleic Acids Research. 50 (1), 473-489 (2022).</li><li>Estevez, M., Valesyan, S., Jora, M., Limbach, P. A., Addepalli, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxidative+damage+to+RNA+is+altered+by+the+presence+of+interacting+proteins+or+modified+nucleosides.">Oxidative damage to RNA is altered by the presence of interacting proteins or modified nucleosides.</a> Frontiers in Molecular Biosciences. 8, 697149 (2021).</li><li>Tomar, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+sequence+modulates+the+efficiency+of+NEIL1-catalyzed+excision+of+the+aflatoxin+B1-induced+formamidopyrimidine+guanine+adduct.">DNA sequence modulates the efficiency of NEIL1-catalyzed excision of the aflatoxin B1-induced formamidopyrimidine guanine adduct.</a> Journal of the American Chemical Society. 34 (3), 901-911 (2021).</li><li>Gaffney, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV-1+env-dependent+cell+killing+by+bifunctional+small-molecule/peptide+conjugates.">HIV-1 env-dependent cell killing by bifunctional small-molecule/peptide conjugates.</a> ACS Chemical Biology. 16 (1), 193-204 (2021).</li><li>Sikorski, E. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+display+of+a+chemoattractant+agonist+on+cancer+cells+activates+the+formyl+peptide+receptor+1+on+immune+cells.">Selective display of a chemoattractant agonist on cancer cells activates the formyl peptide receptor 1 on immune cells.</a> ChemBioChem. , 202100521 (2022).</li><li>Kubo, T., Nishimura, Y., Sato, Y., Yanagihara, K., Seyama, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sixteen+different+types+of+lipid-conjugated+siRNAs+containing+saturated+and+unsaturated+fatty+Acids+and+exhibiting+enhanced+RNAi+potency.">Sixteen different types of lipid-conjugated siRNAs containing saturated and unsaturated fatty Acids and exhibiting enhanced RNAi potency.</a> ACS Chemical Biology. 16 (1), 150-164 (2021).</li></ol>

Bu iş akışındaki ana zorluk, deneylerin sonuçlandırılması ve kütle spektrometrik analizlerinin yapılması arasında ortaya çıktı. Deneyler Colorado Denver Üniversitesi'nde gerçekleştirildi ve tamamlandı ve Colorado Eyalet Üniversitesi tesislerine (bir gecede) gönderildi. Veri toplama, kolaylık sağlamak amacıyla alındıktan sonra gerçekleştirilmiştir. Birkaç beklenmedik durum süreçte zaman gecikmelerine neden oldu. Bir durumda, beklenmeyen cihaz arızaları, numunelerin tespit edilmeden ve eld...

MALDI-TOF 1,2,3, farklı boyut ve özelliklerdeki moleküllerin karakterizasyonu ve / veya tespiti için yaygın olarak kullanılan bir tekniktir. Kullanımlarından bazıları, doğal kaynaklardan tanenlerin tespit edilmesi4, gıda5'teki metabolitlerin görüntülenmesi, hücresel ilaç hedeflerinin veya belirteçlerinin keşfi veya izlenmesi6 ve klinik teşhis7 gibi çeşitli uygulamaları içerir. Bu çalışmayla ilgili olarak, MALDI-TOF'un DNA veya RNA ile birlikte kullanılması, oligonükleotidler üzerindeki kullanımı otuz yıldan fazla bir süredirdevam etmektedir 8, burada çeşitli sınırlamalar belirtilmiştir. Bu teknik şimdi hem biyopolimerleri9 karakterize etmek hem de kimyasal ve biyokimyasal reaksiyonları tanımlamak / anlamak için güvenilir, yaygın olarak kullanılan bir araca dönüşmüştür, örneğin, RNA 10'daki platinlenmiş bölgelerin karakterizasyonu, iplik bölünmesi 11,12'yi takiben RNA fragmanlarının tanımlanması veya protein-DNA çapraz bağlantılarının oluşumu 13 . Bu nedenle, bu tekniği kullanmanın önemli yönlerini göstermek ve vurgulamak değerlidir. MALDI-TOF'un temelleri video formatında da açıklanmıştır14 ve burada daha fazla ayrıntılandırılmayacaktır. Ayrıca, DNA veya protein bağlamında uygulanması daha önce tarif edilmiş ve söz konusu formatta 15,16,17 olarak gösterilmiştir.
Enzimatik hidroliz sonrası oluşan RNA fragmanlarının tespiti için protokol burada bildirilmiştir. Deneysel model, eksoribonükleaz Xrn-1 ile oksidatif lezyon 8-oksoG içeren RNA'nın oligonükleotidleri arasındaki benzersiz reaktiviteyi belirlemek için MALDI-TOF kullanıldığı grup 18 tarafından yayınlanan yeni bir bulguya dayanarak seçildi. 20-nükleotid uzun iplikçikler katı faz sentezi19, [5'-CAU GAA ACA A(8-oxoG)G CUA AAA GU] ve [5'-CAU GAA ACA A(8-oxoG)(8-oxoG) CUA AAA GU] ile elde edilirken, Xrn-1 daha önce açıklanan rapor20'yi takiben eksprese edildi ve saflaştırıldı. Kısacası, Xrn-121, oksitlenmiş RNA22 de dahil olmak üzere birden fazla RNA tipini bozan çeşitli anahtar biyolojik rollere sahip bir 5'-3' eksoribonükleazdır. Enzimin işlenebilirliğinin, 5'-fosforile uçlar [5'-H 2 PO 4-(8-oxoG)G CUA AAA GU], [5'-H 2 PO 4-(8-oxoG)(8-oxoG) CUA AAA GU] ve [5'-H2PO 4-(8-oxoG) CUA AAA GU]18 içeren RNA fragmanlarına yol açan 8-oksoG ile karşılaşıldığında durduğu bulunmuştur.
Son olarak, kütle spektrometresinin, çeşitli metodolojiler aracılığıyla, diğer amaçlara uyarlanabilecek güçlü bir yöntem olduğunu belirtmek önemlidir23,24; Bu nedenle, doğru iyonizasyon yönteminin yanı sıra diğer deney düzeneğinin seçilmesi de son derece önemlidir.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.6 mL MCT Graduated Violet</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>05-408-127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6&#8217;-Trihydroxyacetophenone monohydrate 98%</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>480-66-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile 99.9%, HPLC grade</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>75-05-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adenosine triphosphate, 10 mM</td>
			<td>New Englang Bioscience</td>
			<td>P0756S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium citrate, dibasic 98%</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>3012-65-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium Fluoride 98.0%, ACS grade</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>12125-01-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bruker bacterial test standard</td>
			<td>Bruker Daltonics</td>
			<td>8255343</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Commercial source of Xrn-1</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>M0338S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diethyl pyrocarbonate, 97%</td>
			<td>ACROS Organics</td>
			<td>A0368487</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flex analysis software</td>
			<td>Bruker daltonics</td>
			<td></td>
			<td>FlexAnalysis software version 3.4, Bruker Daltonics</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lambda 365 UV-vis spectrophotometer</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MALDI plate: MSP 96 ground steel target</td>
			<td>Bruker Daltonics</td>
			<td>280799</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mass Spectrometer</td>
			<td>Bruker</td>
			<td></td>
			<td>Microflex LRFTOF mass spectrometer (Bruker Daltonics, Billerica, MA)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mili-Q IQ 7000</td>
			<td>Milipore Sigma</td>
			<td></td>
			<td>A Mili-Q system was used to purify all water used in this work</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanosep Centrifugal Devices with OmegaTM Membrane 10 K, blue (24/pkg)</td>
			<td>Pall Corporation</td>
			<td>OD010C33</td>
			<td>filter media, Omega (modified polyethersulfone) 10 K pore size</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEBuffer 3</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>B7003S</td>
			<td>This is solution B</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oligo Analyzer tool</td>
			<td>IDT-DNA</td>
			<td></td>
			<td>https://www.idtdna.com/calc/analyzer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tips P10</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02-707-441</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tips P200</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02-707-419</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase Away</td>
			<td>Molecular BioProducts</td>
			<td>7005-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 Polynucleotide Kinase</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>M0201S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 Polynucleotide Kinase Reaction Buffer</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>B0201S</td>
			<td>This is solution A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triflouroacetic Acid</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>76-05-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xrn-1 exoribonuclease</td>
			<td>Expressed in house</td>
			<td>See ref. 20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZipTip Pipette Tips for Sample preparation</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>ZTC 18S 096</td>
			<td>10 &#181;L pipette tips loaded with a C18 standard 0.6 &#181;L bed</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

identification of rna fragments resulting from enzymatic degradation using maldi-tof mass spectrometry

RNA, yaşamın tüm alanlarında bulunan bir biyopolimerdir ve DNA, proteinler, iyonlar, ilaçlar ve serbest radikaller gibi diğer moleküller ve / veya reaktif türlerle etkileşimleri her yerde bulunur. Sonuç olarak, RNA, bölünmesini, bozulmasını veya modifikasyonunu içeren çeşitli reaksiyonlara uğrar ve bu da farklı işlevlere ve etkilere sahip biyolojik olarak ilgili türlere yol açar. Bir örnek, guaninin reaktif oksijen türlerinin (ROS) varlığında ortaya çıkabilecek 7,8-dihidro-8-oksoguanine (8-oksoG) oksidasyonudur. Genel olarak, bu tür ürünleri ve dönüşümleri karakterize eden prosedürler bilimsel topluluk için büyük ölçüde değerlidir. Bu amaçla, matris yardımlı lazer desorpsiyon iyonizasyon uçuş süresi (MALDI-TOF) kütle spektrometresi yaygın olarak kullanılan bir yöntemdir. Mevcut protokol, enzimatik tedaviden sonra oluşan RNA fragmanlarının nasıl karakterize edileceğini açıklamaktadır. Seçilen model, RNA ile okside bölgelerde enzimatik sindirimin durdurulduğu eksoribonükleaz Xrn-1 arasında bir reaksiyon kullanır. İki adet 20-nükleotid uzunluğunda RNA dizisi [5'-CAU GAA ACA A (8-oxoG)G CUA AAA GU] ve [5'-CAU GAA ACA A (8-oxoG)(8-oxoG) CUA AAA GU] katı faz sentezi yoluyla elde edildi, UV-vis spektroskopisi ile ölçüldü ve MALDI-TOF ile karakterize edildi. Elde edilen iplikçikler daha sonra (1) 5'-fosforile edildi ve MALDI-TOF ile karakterize edildi; (2) Xrn-1 ile tedavi edilir; (3) filtrelenmiş ve tuzdan arındırılmış; (4) MALDI-TOF ile analiz edilmiştir. Bu deneysel düzenek, Xrn-1'in durmasıyla ilişkili parçaların kesin olarak tanımlanmasına yol açtı: [5'-H 2 PO 4-(8-oxoG)G CUA AAA GU], [5'-H 2 PO 4-(8-oxoG)(8-oxoG) CUA AAA GU] ve [5'-H2PO 4-(8-oxoG) CUA AAA GU]. Tarif edilen deneyler 200 pikomol RNA (MALDI analizleri için kullanılan 20 pmol) ile gerçekleştirildi; Bununla birlikte, daha düşük miktarlar, bu çalışmada kullanılandan daha fazla güce sahip lazer kaynakları kullanan spektrometrelerle tespit edilebilir zirvelere neden olabilir. Önemli olarak, tarif edilen metodoloji genelleştirilebilir ve potansiyel olarak RNA ve DNA'yı içeren diğer süreçler için ürün tanımlamaya genişletilebilir ve diğer biyokimyasal yolların karakterizasyonuna / aydınlatılmasına yardımcı olabilir.

Bu çalışmada kullanılan oligonükleotidler kullanımdan önce sentezlenmiş, karakterize edilmiş ve nicelleştirilmiştir. Tüm oligonükleotidlerin konsantrasyonu, ikincil yapıların potansiyel oluşumundan kaynaklanan hatalı okumaları önlemek için 90 ° C'de kaydedilen UV-vis spektroskopisi ile belirlendi. Şekil 3 , bu çalışmada kullanılan RNA'nın model oligonükleotidlerinin spektrumlarını, oda sıcaklığında ve ısı uygulandıktan sonra alındığını göst...

Watch this Scientific Journal Video about Identification of RNA Fragments Resulting from Enzymatic Degradation using MALDI-TOF Mass Spectrometry at JoVE.com

Identification of RNA Fragments Resulting from Enzymatic Degradation using MALDI-TOF Mass Spectrometry

MALDI-TOF, oksitlenmiş RNA ve eksoribonükleaz Xrn-1 arasındaki reaktiviteden elde edilen fragmanları karakterize etmek için kullanıldı. Mevcut protokol, RNA ve / veya DNA içeren diğer işlemlere uygulanabilecek bir metodolojiyi açıklamaktadır.

MALDI-TOF Kütle Spektrometrisi Kullanılarak Enzimatik Bozunmadan Kaynaklanan RNA Fragmanlarının Tanımlanması

RNA is a biopolymer present in all domains of life, and its interactions with other molecules and/or reactive species, e.g., DNA, proteins, ions, drugs, ...

Kütle spektrometresi çeşitli uygulamalar için yaygın olarak benimsenmiştir. Bu makaledeki metodoloji, in vitro enzimatik bir süreçten elde edilen RNA fragmanlarının kesin karakterizasyonunu sunmaktadır. Bu tekniğin avantajları, molekül demir zirvesinin elde edilmesi, deneylerin in vitro uygulamalar için az miktarda malzeme ile gerçekleştirilebilmesi ve protokolün minimum eğitimle gerçekleştirilebilmesidir.Açıklanan metodoloji, DNA, RNA veya proteinleri içeren çalışma süreçlerine yaygın olarak uygulanabilir. Örnekler arasında çapraz bilgi, kimyasal modifikasyonların tanımlanması veya diğer biyopolimer etkileşimleri ve reaktivitesi gibi biyokimyasal dönüşümler sayılabilir. Bir MALDI spektrometresine veya bu hizmeti sunan temel tesislere erişilebilirlikten bir zorluk ortaya çıkabilir.Diğer bir husus, cihaza bağlı olarak daha yüksek veya daha düşük olabilecek algılama sınırının belirlenmesidir. Başlamak için UV-Vis spektrofotometresini açın, ardından PerkinElmer UV WinLab simgesine tıklayarak cihazın çalışma kontrol penceresini açın. Cihazın sağında bulunan anahtarı kullanarak Peltier sıcaklık kontrolörü spektrofotometresini açın ve Temel Yöntemler altında bulunan Scan-Lambda 365'e tıklayın.Başka bir ekran açılır ve kullanıcıdan hücre tutucuların boş olduğundan emin olmasını ister. Tamam'a tıklayın ve cihazın sistem kontrollerini yapmasına izin verin. Şimdi, Veri Toplama'yı seçerek tarama parametrelerini ayarlayın.Tarama Ayarları altındaki yeni pencerede, başlangıcı 350 nanometre ve bitişi 215 nanometre olarak değiştirin. Aksesuarın solundaki artıyı seçerek Peltier'i etkinleştirin. Ardından Çoklu Hücre Peltier'e tıklayın, sıcaklık derecelerini 25 olarak değiştirin ve Peltier On.Örnek bilgi sekmesine gidin ve istenen örneklerin, adların ve hücre konumunun sayısını girin.Autozero'ya tıklayın ve arka plan çözümünü içeren küveti yerleştirin. Başlat'a tıklayın ve küveti istediğiniz hücreye yerleştirin ve küvet penceresinin cihazın ön yüzüne paralel olarak yönlendirildiğinden emin olun. Şimdi, tıklayın OK ilk taramaya 25 santigrat derecede başlamak için.Daha yüksek sıcaklıklardaki ölçümler için, Çoklu Hücreli Peltier'e tıklayın, sıcaklığı istenen numune sıcaklığına değiştirin ve taramayı tekrarlayın. Dosya, Dışa Aktar'a tıklayın ve istediğiniz dosya konumunu seçin ve bir metin dosyası elde etmek için XY Verisi'ni seçin. RNA'nın 5'fosforilasyonunu gerçekleştirmek için, 33.5 mikrolitre RNaz içermeyen su, beş mikrolitre çözelti A, altı mikrolit 10 milimolar adenozin trifosfat, 200 mikromolar RNA sulu çözeltisinin bir mikroliti ve 4.5 mikrolitre polinükleotid kinaz ekleyerek 0.6 mikrolitrelik bir mikro santrifüj tüpünde bir çözelti hazırlayın ve çözeltiyi nazikçe karıştırın.Reaksiyon karışımını bir su banyosuna yerleştirerek 45 dakika boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin. Daha sonra, reaksiyon tüpünü 10 dakika boyunca 65 santigrat derecede önceden ısıtılmış bir ısı bloğuna yerleştirerek enzimi inaktive etmek. Son 5'fosforile RNA çözeltisini elde etmek için çözeltinin oda sıcaklığına soğumasına izin verin.Kuluçkadan sonra, bu çözeltinin 50 mikrolitresini kullanın, RNA hidrolizini gerçekleştirmek için beş mikrolitre B çözeltisi ve beş mikrolitre 1-femtomol Xrn-1 çözeltisi ekleyin. Reaksiyon tüpünü iki saat boyunca oda sıcaklığında inkübe edin. Bu reaksiyon karışımını 10 kilodalton gözenek büyüklüğünde bir santrifüj cihazına aktarın ve 700 kez 10 dakika boyunca santrifüj yaparak enzimleri filtreleyin G.Filtratın 0,6 mililitrelik bir santrifüj tüpüne aktarın.Daha sonra, santrifüj tüpü üzerindeki artık RNA'yı yıkamak için 20 mikrolitre RNaz içermeyen su ekleyin, ardından santrifüjleme yapın. Son olarak, bu filtratı daha önce 10 kilodalton gözenek büyüklüğünde santrifüjleme ile elde edilen filtrat ile birleştirin ve çözeltiyi sıfır santigrat derecede dondurun veya analiz için gemileyin. Numunenin tuzunu almak ve konsantre etmek için, ucunda C18 kromatografi ortamı yatağı yüklü ticari olarak temin edilebilen katyon değişimli C18 pipet uçlarını kullanın.Bunun için 10 mikrolitrelik pipet ucunu 10 mikrolitrelik bir pipet üzerine yerleştirin ve bu ucu %50 sulu asetil nitril çözeltisi ile iki kez yıkayın. Kullanılan hacimleri her seferinde ayrı bir atık tüpüne atın ve C18 ucunu iki kez 10 mikrolitrelik %0,1 sulu trifloroasetik asit çözeltisi ile dengeleyin. C18 ucunu pipetten manuel olarak çıkarın ve P200 pipet ucu içeren 200 mikrolitrelik bir pipete sabitleyin.Daha sonra C18 ucunu, RNA'nın oligonükleotidlerinin Xrn-1 tarafından hidrolizi sırasında hazırlanan elde edilen çözeltiye daldırın ve aspirat, çözeltiyi C18 ucundan 10 kez serbest bırakın. Şimdi, C18 ucunu P200 pipetten ayırın, 10 mikrolitrelik bir pipete yerleştirin ve C18 ucunu iki kez %0,1 trifloroasetik asit çözeltisinden oluşan sulu bir çözelti kullanarak yıkayın. Kullanılan hacimleri her seferinde ayrı bir atık tüpüne atın.C18 ucunu iki kez 10 mikrolitre RNaz içermeyen suyla yıkayın. MALDI plakasına leke yapmak için, RNA oligonükleotidi, numuneyi istenen matrise batırarak ve çözeltiyi 10 kez tekrar tüpe dağıtarak C18 ucundan süzün. Bu çözeltiyi plakadaki her biri bir mikrolitrelik iki ayrı noktaya pipetleyin ve lekelerin havayla kurumasını sağlayın.Bu çalışmada kullanılan RNA konsantrasyonu, ikincil yapıların potansiyel oluşumundan kaynaklanan hatalı okumaları önlemek için 90 santigrat derecede kaydedilen UV-Visible spektroskopisi ile belirlendi. Olayların genel sırası iki bölümden oluşuyordu. Birincisi, RNA'nın verimli 5'fosforilasyonu, beklenen ürüne karşılık gelen sadece bir zirvenin ortaya çıkmasıyla kanıtlanmıştır.Ve ikincisi, numune karışımının Xrn-1 ile işlenmesinden kaynaklanan durma parçası. Aynı sonuçlar, iki oksidatif lezyon içeren farklı bir dizi kullanılarak elde edildi. Göz önünde bulundurulması gereken potansiyel değişiklikler, filtreleme cihazının kullanımının ortadan kaldırılmasını veya MALDI lekelenmesi için farklı matrislerin dikkate alınmasını içerir.Örneğin, sinapinik asit veya pikolinik asit. RNA fragmanları enzimatik bir süreçten elde edildi. Bu süreç, MALDI, elektroforetik analiz, katı faz sentezi ve dairesel dikroizmin birleştirilmesiyle kurulmuştur.Tanımlanan protokol, kimya bilimlerindeki araştırmalardan biyomedikal alandaki uygulamalara kadar çeşitli alanlarda kullanılma potansiyeline sahiptir.

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Cell Biology

Biochemistry

Unit 1

Analyzing Cells and Proteins

SCIENTISTS IN ACTION

Time-resolved ElectroSpray Ionization Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry for Studying Protein Structure and Dynamics

Zaman çözülmesi elektro sprey iyonizasyon Hidrojen-döteryum Değişim Kütle Spektrometre Protein Yapısı ve Dinamikleri incelenmesi için

Intrinsically disordered proteins (IDPs) have long been a challenge to structural biologists due to their lack of stable secondary structure elements. ...

Resolving Affinity Purified Protein Complexes by Blue Native PAGE and Protein Correlation Profiling

Mavi Yerli PAGE ve Protein İlişkisi Profil Yöntemi ile Affinity Saf protein Kompleksler çözümleniyor

Most proteins act in association with others; hence, it is crucial to characterize these functional units in order to fully understand biological ...

Lipid Droplet Isolation for Quantitative Mass Spectrometry Analysis

Kantitatif Kütle Spektrometresi Analiz lipid Damlacık izolasyonu

Lipid droplets are vital to the replication of a variety of different pathogens, most prominently the Hepatitis C Virus (HCV), as the putative site of ...

Sample Preparation for Mass Spectrometry-based Identification of RNA-binding Regions

Kütle spektrometresi tabanlı kimlik RNA-bağlama bölgelerinin için numune hazırlama

Noncoding RNAs play important roles in several nuclear processes, including regulating gene expression, chromatin structure, and DNA repair. In most ...

The Determination of Protease Specificity in Mouse Tissue Extracts by MALDI-TOF Mass Spectrometry: Manipulating PH to Cause Specificity Changes

Proteaz özgüllük fare doku belirlenmesi MALDI-TOF Kütle spektrometresi tarafından ayıklar: PH özgüllük değişiklikler neden manipüle

Proteases have several biological functions, including protein activation/inactivation and food digestion. Identifying protease specificity is important ...

Proofreading and DNA Repair Assay Using Single Nucleotide Extension and MALDI-TOF Mass Spectrometry Analysis

Proofreading ve DNA onarım tahlil tek nükleotid uzama ve MALDI-TOF Kütle spektrometresi analizi ile

The maintenance of the genome and its faithful replication is paramount for conserving genetic information. To assess high fidelity replication, we have ...

Analyzing Dynamic Protein Complexes Assembled On and Released From Biolayer Interferometry Biosensor Using Mass Spectrometry and Electron Microscopy

Dinamik Protein kompleksleri analiz monte ve kütle spektrometresi ve Elektron Mikroskopisi kullanılarak Biolayer Interferometry biyoalgılayıcı--dan serbest bırakmak

In vivo, proteins are often part of large macromolecular complexes where binding specificity and dynamics ultimately dictate functional outputs. In this ...

Capture and Identification of RNA-binding Proteins by Using Click Chemistry-assisted RNA-interactome Capture (CARIC) Strategy

Capture and Identification of RNA-binding Proteins by Using Click Chemistry-assisted RNA-interactome Capture CARIC Strategy

Yakalama ve tıklama Kimya destekli RNA-interactome kullanarak RNA bağlanıcı proteinler tanımlaması (CARIC) strateji yakalama

A comprehensive identification of RNA-binding proteins (RBPs) is key to understanding the posttranscriptional regulatory network in cells. A widely used ...

Using the Open-Source MALDI TOF-MS IDBac Pipeline for Analysis of Microbial Protein and Specialized Metabolite Data

Mikrobiyal protein ve özel metabolit verilerinin analizi için açık kaynak MALDı TOF-MS ıdbac Pipeline kullanma

In order to visualize the relationship between bacterial phylogeny and specialized metabolite production of bacterial colonies growing on nutrient agar, ...

Nitropeptide Profiling and Identification Illustrated by Angiotensin II

Anjiyotensin II tarafından gösterilen nitropeptid profil oluşturma ve tanımlama

Protein nitration is one of the most important post-translational modifications (PTM) on tyrosine residues and it can be induced by chemical actions of ...