Ex Vivo | Afgifte van calcitonine-gengerelateerd peptide uit het trigeminovasculaire systeem bij knaagdieren

Deze methode is een hulpmiddel om mechanismen te onderzoeken die betrokken zijn bij het vrijkomen van CGRP uit het trigeminus vasculaire systeem. Het belangrijkste voordeel van deze methode is de mogelijkheid om het trigeminus vasculaire systeem in drie verschillende plaatsen te verdelen en de afgifte van de CGRP binnen elke afzonderlijke site te beoordelen. De procedure wordt gedemonstreerd door mijzelf en Inger Jansen-Olesen, een senior wetenschapper uit onze groep.

Bereid om te beginnen het rattenweefsel voor door de huid en de spier rond het hoofd en de nek met een schaar te verwijderen. Gebruik vervolgens een bottentrimmer en een schaar om de onderkaken van het hoofd te scheiden. Stel nu het ruggenmerg en de hersenstam bloot door een bottrimmer caudaal in het dorsale deel van de wervels in te brengen en te verwijderen.

Snijd vervolgens het caudale deel van de schedel door de randen van de occipitale en interpariëtale botten om deze botstructuren te verwijderen, waardoor het cerebellum wordt blootgesteld. Om de TNC caudally ongeveer 13 tot 16 millimeter van de bregma aan elke kant te isoleren, knipt u het dorsolaterale deel van de hersenstam met een veerschaar. Dat wordt gevolgd door het onderdompelen van de linker- en rechterkant TNC in SIF.

Snijd vervolgens de kop midsaggitally om de schedel in tweeën te verdelen met behulp van een zaag. Verwijder nu voorzichtig de hersenen zonder de dura mater aan te raken die met een spatel aan de schedel is bevestigd. Om de TG te isoleren, snijdt u deze inclusief de takken rond de visuele randen met de mandibulaire tak die de foramen ovale binnengaat en de oogheelkundige en maxillaire takken die de schedel binnendringen.

Dompel vervolgens de schedelhelften en de TG's onder in SIF. Om het muizenweefsel voor te bereiden, verwijdert u de huid en de spier rond het hoofd en de nek met een schaar. Stel nu het ruggenmerg en de hersenstam bloot door een schaar caudaal in het dorsale deel van de wervels in te brengen en te verwijderen.

Snijd vervolgens het caudale deel van de schedel door de randen van de occipitale en interpariëtale botten om deze botstructuren te verwijderen die het cerebellum blootstellen. Snijd het pariëtale bot midsaggitaal en verwijder het bot om het cerebrum bloot te leggen. Verwijder voorzichtig het cerebellum om de hersenstam bloot te leggen met behulp van een spatel.

Isoleer de TNC die een deel van de hersenstam bevat met een veerschaar, gevolgd door het onderdompelen van de hersenstam in SIF. Verwijder nu voorzichtig de hersenen met behulp van een spatel en snijd de trigeminuszenuw af waar deze de hersenstam binnenkomt. Om de TG te isoleren, snijdt u het inclusief de takken rond de visuele randen met de mandibulaire tak waar het de foramen ovale en oogheelkundige en maxillaire takken binnenkomt die de schedel binnendringen.

Dompel vervolgens TG's onder in SIF. Voor eenvoudige uitwisseling van SIF, voeg een toldeksel toe aan de plastic containers en begin met het wassen van het ratten- en muizenweefsel in SIF gedurende 30 minuten door SIF elke vijf minuten te vervangen. Na 30 minuten wassen op kamertemperatuur, breng rat TNC-helften en rat TG's over naar afzonderlijke microcentrifuge buisdoppen met 350 microliter SIF.

Breng de muizenherstam met TNC over naar een microcentrifuge buisdop met 250 microliter SIF. Breng ten slotte de twee muis-TG's over naar een microcentrifugebuisdop met 250 microliter SIF. Plaats de schedelhelften van de rat op een kweekplaat met zes putten en vul de schedel met 400 microliter SIF.

Plaats rattenschedels in microcentrifuge buisdoppen met ratten- en muizenweefsel in een bevochtigde incubator bij 37 graden Celsius. Vervang SIF met een pipet om de vijf minuten gedurende 20 minuten zonder het weefsel aan te raken. Bereid microcentrifugebuizen voor op monsterverzameling door middel van de juiste etikettering.

Voeg vervolgens 50 microliter 10 sterkte EIA-buffer toe aan elke microcentrifugebuis. Bereid vervolgens de oplossing van de teststof en de voertuigoplossing door in SIF voor alle concentraties te verdunnen. Voeg na de laatste wasbeurt 250 microliter SIF toe aan muis-TG en TNC, 350 microliter SIF aan rat-TG en TNC en 400 microliter SIF aan elke rattenschedel.

Verzamel na 10 minuten incubatie 200 microliter van het monster in een vooraf gelabelde microcentrifugebuis met 50 microliter EIA-buffer met 10 sterktes om meting van de basale CGRP-afgifte mogelijk te maken. Gooi de resterende vloeistof weg en bewaar de monsters onmiddellijk bij min 20 graden Celsius. Voeg de teststof in toenemende concentraties toe aan het overeenkomstige medium, te beginnen met de laagste concentratie, en incubeer gedurende 10 minuten.

Verzamel na 10 minuten incubatie 200 microliter van het monster in een vooraf gelabelde microcentrifugebuis met 50 microliter EIA-buffer met 10 sterktes. Gooi de resterende vloeistof weg en voeg de op een na laagste concentratie toe aan het weefsel. Bewaar de monsters onmiddellijk bij min 20 graden Celsius en herhaal deze procedure met de resterende concentratie.

Om een positieve controle voor het experiment uit te voeren, voegt u de positieve controle toe aan het weefsel aan het einde van het protocol. Verzamel na een incubatietijd van 10 minuten een monster van 200 microliter in een microcentrifugebuis met 50 microliter EIA-buffer met 10 sterktes. De concentraties CGRP die vrijkomen in de verzamelde monsters worden gemeten met behulp van een EIA-kit, terwijl de instructies van de fabrikant bij de EIA-kit worden gevolgd.

Bij de rat veroorzaakte blootstelling aan capsaïcine een significante CGRP-afgifte van dura mater en TG in vergelijking met het medium. In de dura mater werd de maximale afgifte van CGRP gevonden bij één micromolaire capsaïcine. En in TG werd de maximale CGRP-afgifte gevonden bij 10 micromolaire capsaïcine.

Bij analyse met een eenrichtings-ANOVA vertoont glibenclamide geen effect op de basale CGRP-afgifte van dura mater en TG. Glibenclamide verminderde de door capsaïcine geïnduceerde CGRP-afgifte in dura mater aanzienlijk met 40% en TG met 39% in vergelijking met capsaïcine met het medium wanneer geanalyseerd met een eenrichtings-ANOVA. Het transiënte receptorpotentieel Ankyrin-1-agonist super cinnamaldehyde bleek CGRP op een concentratieafhankelijke manier vrij te geven van de TG met respectievelijk 1, 10 en 100 micromolair super cinnamaldehyde, wat resulteert in 9% 52% en 69% verhoogde afgifte van CGRP in vergelijking met respectievelijk het voertuig wanneer geanalyseerd met tweeweg ANOVA. De verhoogde afgifte van CGRP was afwezig in TG van de transiënte receptor potentiële Ankyrin-1 knock-out muizen waar blootstelling aan 1, 10 en 100 micromolaire super cinnamaldehyde resulterend in 11% minus 13% en 9% verandering in de afgifte van CGRP in vergelijking met voertuig respectievelijk wanneer geanalyseerd met twee-weg ANOVA.

Het is belangrijk om voorzichtig te zijn om het weefsel niet aan te raken tijdens het verzamelen van monsters en om precies te zijn bij het timen van de incubatietijd voor alle monsters. Als er adequate ELISA-kits beschikbaar zijn, is het mogelijk om deze procedure toe te passen om de afgifte van andere peptiden in het trigeminus vasculaire systeem te meten.