Name: generation of mesenchymal stem cells from human umbilical cord tissue and their differentiation into the skeletal muscle lineage
Uploaded: 2022-08-31T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Generation of Mesenchymal Stem Cells from Human Umbilical Cord Tissue and their Differentiation into the Skeletal Muscle Lineage at JoVE.com

Wir danken Herrn Ojas Tikoo für ihre Hilfe bei den Dreharbeiten und der Videoproduktion. Wir danken auch für die Hilfe der Mitarbeiter von GARBH-Ini (Interdisciplinary Group on Advanced Research and Birth Outcome-DBT India), Krankenschwestern und leitenden Forschungsbeamten am Gurugram Civil Hospital und Dr. Pallavi Kshetrapal für Hilfe bei der Logistik. Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse unterstützt, die Suchitra Gopinath vom Department of Biotechnology, Indien, gewährt wurden (BT/09/IYBA/2015; BT/PR29599/PFN/20/1393/2018).

Die Verwendung von Nabelschnurgewebe in dieser Studie wurde vom Institutional Committee for Stem Cell Research (IC-SCR), dem Institutional Ethics Committee, dem Translational Health Science and Technology Institute (IEC-THSTI), dem Institutional Ethics Committee of Civil Hospital, Gurugram, Haryana, und dem Institutional Biosafety Committee, THSTI, genehmigt. Menschliche Nabelschnurgewebeproben wurden aus Terminlieferungen zum Zeitpunkt der Geburt entnommen. Von den Probanden wurde eine informierte schriftliche Zustimmun...

<ol>
	<li>Kuroda, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unique+multipotent+cells+in+adult+human+mesenchymal+cell+populations.">Unique multipotent cells in adult human mesenchymal cell populations.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (19), 8639-8643 (2010).</li><li>Troyer, D. L., Weiss, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wharton's+jelly-derived+cells+are+a+primitive+stromal+cell+population.">Wharton's jelly-derived cells are a primitive stromal cell population.</a> Stem Cells. 26 (3), 591-599 (2008).</li><li>Karahuseyinoglu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biology+of+stem+cells+in+human+umbilical+cord+stroma:+In+situ+and+in+vitro+surveys.">Biology of stem cells in human umbilical cord stroma: In situ and in vitro surveys.</a> Stem Cells. 25 (2), 319-331 (2007).</li><li>Kita, K., Gauglitz, G. G., Phan, T. T., Herndon, D. N., Jeschke, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+mesenchymal+stem+cells+from+the+sub-amniotic+human+umbilical+cord+lining+membrane.">Isolation and characterization of mesenchymal stem cells from the sub-amniotic human umbilical cord lining membrane.</a> Stem Cells and Development. 19 (4), 491-502 (2010).</li><li>Sarugaser, R., Lickorish, D., Baksh, D., Hosseini, M. M., Davies, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+umbilical+cord+perivascular+(HUCPV)+cells:+A+source+of+mesenchymal+progenitors.">Human umbilical cord perivascular (HUCPV) cells: A source of mesenchymal progenitors.</a> Stem Cells. 23 (2), 220-229 (2005).</li><li>Mishra, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Umbilical+cord+tissue+is+a+robust+source+for+mesenchymal+stem+cells+with+enhanced+myogenic+differentiation+potential+compared+to+cord+blood.">Umbilical cord tissue is a robust source for mesenchymal stem cells with enhanced myogenic differentiation potential compared to cord blood.</a> Scientific Reports. 10 (1), 18978 (2020).</li><li>Lu, L. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+human+umbilical+cord+mesenchymal+stem+cells+with+hematopoiesis-supportive+function+and+other+potentials.">Isolation and characterization of human umbilical cord mesenchymal stem cells with hematopoiesis-supportive function and other potentials.</a> Haematologica. 91 (8), 1017-1026 (2006).</li><li>Seshareddy, K., Troyer, D., Weiss, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Method+to+isolate+mesenchymal-like+cells+from+Wharton's+Jelly+of+umbilical+cord.">Method to isolate mesenchymal-like cells from Wharton's Jelly of umbilical cord.</a> Methods in Cell Biology. 86, 101-119 (2008).</li><li>Sotiropoulou, P. A., Perez, S. A., Salagianni, M., Baxevanis, C. N., Papamichail, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+the+optimal+culture+conditions+for+clinical+scale+production+of+human+mesenchymal+stem+cells.">Characterization of the optimal culture conditions for clinical scale production of human mesenchymal stem cells.</a> Stem Cells. 24 (2), 462-471 (2006).</li><li>Yoon, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+explant-derived+and+enzymatic+digestion-derived+MSCs+and+the+growth+factors+from+Wharton's+jelly.">Comparison of explant-derived and enzymatic digestion-derived MSCs and the growth factors from Wharton's jelly.</a> BioMed Research International. 2013, 428726 (2013).</li><li>Ishige, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+mesenchymal+stem+cells+derived+from+arterial,+venous,+and+Wharton's+jelly+explants+of+human+umbilical+cord.">Comparison of mesenchymal stem cells derived from arterial, venous, and Wharton's jelly explants of human umbilical cord.</a> International Journal of Hematology. 90 (2), 261-269 (2009).</li><li>Chal, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+of+pluripotent+stem+cells+to+muscle+fiber+to+model+Duchenne+muscular+dystrophy.">Differentiation of pluripotent stem cells to muscle fiber to model Duchenne muscular dystrophy.</a> Nature Biotechnology. 33 (9), 962-969 (2015).</li></ol>

Kritische Schritte Ein kritischer Schritt in diesem Protokoll ist die Sammlung von Gewebe unter aseptischen Bedingungen, vom Zeitpunkt der Lieferung bis zur Aufrechterhaltung steriler Kulturen, für die gesamte Dauer der Vermehrung. Während der Schnursammlung ist es wichtig, dass die Schnur keine nicht sterilisierte Oberfläche berührt und extern mit 70% Ethanol abgewischt wird, bevor sie in mit Antibiotika ergänzten Röhrchen, die PBS enthalten, gesammelt wird. Es ist wichtig, die Zeit zwischen de...

Der menschlichen Nabelschnur wird ein robustes Reservoir mesenchymaler Stammzellen zugeschrieben, die derzeit aufgrund ihrer robusten Proliferations- und Differenzierungsraten, immunmodulatorischen Eigenschaften und ihrer Fähigkeit, Zellen aus allen drei Keimschichten 1 zu erzeugen, für regenerative Therapien erforschtwerden. Das Nabelschnurgewebe besteht aus mehreren Kompartimenten wie dem Nabelschnurblut, dem Nabelvenensubendothel und dem Wharton-Gelee (WJ), das an sich drei ununterschiedliche Regionen umfasst - die perivaskuläre Zone, die intervaskuläre Zone und das Subamnion oder die Nabelschnurauskleidung (CL)2. Während uMSCs aus all diesen verschiedenen Regionen isoliert werden können und wichtige MSC-Marker weitgehend ausdrücken, gibt es keine Klarheit darüber, ob diese Kompartimente die gleiche Population von uMSCs enthalten oder Unterschiede in ihren Differenzierungspotenzenaufweisen 3. Daher erfordern Protokolle für die Isolierung von uMSCs eine größere Präzision in ihrem Modus und Bereich der Isolation, die robuste Charakterisierung von Differenzierungspotentialen und schließlich eine vergleichende Analyse aus verschiedenen Kompartimenten der Schnur. 
In diesem Zusammenhang haben nur wenige Studien Unterschiede in den proliferativen und differenzativen Potentialen von uMSC zwischen verschiedenen Teilen der Schnur gezeigt. Von diesen ergaben vergleichende Analysen zwischen uMSCs, die aus den CL- und WJ-Regionen isoliert wurden, ein größeres Proliferationspotenzial in CL-abgeleiteten uMSCs 3,4. In einer separaten Studie schnitten WJ-abgeleitete uMSCs in Proliferationsassays im Vergleich zu perivaskulären Zellen (HUCPV) besser ab.5. Bei der Untersuchung von Unterschieden zwischen aus Nabelschnurblut gewonnenen uMSCs und aus Nabelschnurgewebe gewonnenen uMSCs, die keine vaskuläre Kontamination aufweisen, wurde eine differentielle Expression der wichtigsten MSC-Marker zwischen den beiden Kompartimenten sowie erhöhte Proliferationsraten in Nabelschnurgewebe-abgeleiteten uMSCsberichtet 6.
Von den verschiedenen Studien, die die Differenzierungspotenziale von uMSCs hauptsächlich in Gewebe der Mesoderm-Linie wie osteogene, adipogene und chondrogene Linien untersuchen, haben nur sehr wenige detaillierte Protokolle für die myogene Differenzierung und anschließende Charakterisierung sowie vergleichende Analysen zwischen verschiedenen Nabelschnurkompartimenten geliefert. In diesem Zusammenhang haben wir ein robustes Muskeldifferenzierungsprotokoll entwickelt und beobachtet, dass aus Nabelschnurgewebe gewonnene uMSCs im Vergleich zu Nabelschnurblut überlegene myogene Differenzierungsfähigkeitenaufweisen 6. Hier wird ein schrittweises Protokoll für die Isolierung von uMSCs aus dem gesamten Nabelschnurgewebe ohne Zellen, die mit dem Gefäßsystem assoziiert sind, ihre Charakterisierung und ihre Differenzierung in die myogene Linie detailliert beschrieben.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>4&#39;,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>D1306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amphotericin B</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A2411</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic solution 100x Liquid, endotoxin tested (10,000 U Penicillin and 10 mg Streptomycin/mL in 0.9% normal saline)</td>
			<td>HiMedia</td>
			<td>A001A-50mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-GAPDH antibody</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G8795</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-MyHC antibody (My32)</td>
			<td>Novus Biologicals</td>
			<td>NBP2-50401AF647</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-MyoD antibody (5.8A)</td>
			<td>Novus Biologicals</td>
			<td>NB100-56511</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Myogenin antibody (Clone F5D)</td>
			<td>Novus Biologicals</td>
			<td>NBP2-34616AF594</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Pax7 antibody</td>
			<td>DSHB</td>
			<td>DSHB-C1-576</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC Mouse anti-human CD90 clone 5E10</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>559869</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen Type 1</td>
			<td>Merck</td>
			<td>C8919</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D (+) Glucose</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G7021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dexamethasone</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>D4902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACSCanto II or FACSAria III</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum, qualified Brazil</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>10270106</td>
			<td>not to be heat-inactivated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC Mouse anti-human CD106 clone 51-10C9</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>551146</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC Mouse anti-human CD14 clone M5E2</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>557153</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC Mouse anti-human CD31 clone WM59</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>557508</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC Mouse anti-human CD34 clone 581</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>555821</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC Mouse anti-human CD45 clone HI30</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>555482</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC Mouse anti-human CD49D clone 9F10</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>560840</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC Mouse anti-human CD90 clone 5E10</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>555595</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC Mouse anti-human HLA-A,B,C clone G46-2.6</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>557348</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC Mouse anti-human IgG clone G18-145</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>555786</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FlowJo software</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamicin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G1264</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horse serum</td>
			<td>HiMedia</td>
			<td>RM1239</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrocortisone</td>
			<td>Merck</td>
			<td>H4001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminin</td>
			<td>Merck</td>
			<td>L2020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM Alpha Modification without L-glutamine, ribo- and deoxyribonucleosides</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30568.FS</td>
			<td>Basal medium for uMSCs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE Mouse anti-human CD105 clone 266</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>560839</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE Mouse anti-human CD44 clone 515</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>550989</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE Mouse anti-human CD49E clone llA1</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>555617</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE Mouse anti-human IgG clone G18-145</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>555787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE-Cy7 Mouse anti-human CD73 CLONE AD2</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>561258</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline (PBS), pH=7.4</td>
			<td>HiMedia</td>
			<td>M1866</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin/EDTA solution (1x 0.25% Trypsin and 0.02% EDTA in Hanks Balanced Salt Solution (HBSS)</td>
			<td>HiMedia</td>
			<td>TCL049-100mL</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation of mesenchymal stem cells from human umbilical cord tissue and their differentiation into the skeletal muscle lineage

Die Erforschung des therapeutischen Potenzials mesenchymaler Stammzellen hängt von der Leichtigkeit der Isolierung, der Potenz zur Differenzierung und der Zuverlässigkeit und Robustheit der Quelle ab. Wir beschreiben hier ein schrittweises Protokoll für die Isolierung mesenchymaler Stammzellen aus menschlichem Nabelschnurgewebe (uMSCs), deren Immunphänotypisierung und die Ausbreitung solcher Kulturen über mehrere Passagen. Bei diesem Verfahren ist die Lebensfähigkeit der uMSCs hoch, da keine enzymatische Verdauung stattfindet. Darüber hinaus stellt die Entfernung von Blutgefäßen, einschließlich der Nabelschnurarterien und der Vene, sicher, dass es keine Kontamination von Zellen endothelialen Ursprungs gibt. Unter Verwendung der Durchflusszytometrie sind uMSCs bei der Isolierung CD45−CD34−, was auf eine Abwesenheit von Zellen aus der hämatopoetischen Linie hinweist. Wichtig ist, dass sie die Tastenoberflächenmarkierungen CD105, CD90 und CD73 ausdrücken. Nach der Etablierung von Kulturen beschreibt dieses Papier eine effiziente Methode, um die Differenzierung dieser uMSCs in die Skelettmuskellinie zu induzieren. Eine detaillierte Analyse der myogenen Progression in differenzierten uMSCs zeigt, dass uMSCs Pax7 exprimieren, einen Marker für myogene Vorläufer in den Anfangsstadien der Differenzierung, gefolgt von der Expression von MyoD und Myf5 und schließlich einem terminalen Differenzierungsmarker, Myosin Heavy Chain (MyHC).

Der Erfolg der Isolierung von uMSCs aus Nabelschnurgewebe beträgt >95%, im Gegensatz zu den schlechten Erfolgsraten von Nabelschnurblut. Nach erfolgreicher Isolierung von uMSCs zeigt die FACS-Analyse, dass alle Zellen CD34−CD45−CD105+CD90+ sind. In der vergleichenden Analyse zeigen uMSCs, die aus Nabelschnurblut isoliert wurden, jedoch heterogene Populationen, wobei ein Teil der Zellen CD34 + CD45 + CD105 + (~ 15%) aufweist. Darüber hinaus...

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Generation of Mesenchymal Stem Cells from Human Umbilical Cord Tissue and their Differentiation into the Skeletal Muscle Lineage

Wir beschreiben ein Protokoll zur Isolierung mesenchymaler Stammzellen aus menschlichem Nabelschnurgewebe und deren Differenzierung in die Skelettmuskellinie.

Gewinnung mesenchymaler Stammzellen aus menschlichem Nabelschnurgewebe und deren Differenzierung in die Skelettmuskellinie

Exploring the therapeutic potential of mesenchymal stem cells is contingent upon the ease of isolation, potency toward differentiation, and the ...

Wir beschreiben unser Protokoll zur Isolierung mesenchymaler Stammzellen aus menschlichem Nabelschnurgewebe und eine robuste Methode, um sie in die Skelettmuskellinie zu differenzieren. Diese Technik ermöglicht es uns, mesenchymale Stammzellen mit hoher Lebensfähigkeit und Wärme zu isolieren, mit wenig bis gar keiner Kontamination von Zellen endothelialen Ursprungs und die myogene Differenzierung bei diesen Krankheiten effizient zu induzieren. Kordeltorsion und Schleimhautkonsistenz erschweren die Handhabung der Schnur.Wir zeigen, wie man die Schnur verarbeitet, um das Wharton-Gelee nicht abzukratzen und Endothelzellen aus der Population auszuschließen. Nachdem Sie das Nabelschnurgewebe zur Lieferzeit gesammelt haben, geben Sie das Nabelschnurgewebestück aus dem Entnahmeröhrchen in eine 10 Quadratzentimeter große mit Gewebekultur behandelte Schale und waschen Sie das Gewebe gründlich mit frischem PBS. Um die Nabelschnurtorsion und die Schleimhautoberfläche zu pflegen, stecken Sie das Gewebe mit einer Pinzette in einer Hand fest.Schneiden Sie das Nabelschnurgewebe mit einem Skalpell vertikal entlang seines Längszugangs, um zwei halbzylindrische Stücke zu erhalten. Beobachten Sie an dieser Stelle die Nabelschnurarterien und Venen. Entfernen Sie mit einem Skalpell die Blutgefäße, indem Sie sie in eine Richtung von der Oberfläche abkratzen und das Nabelschnurgewebe in PBS spülen, um das gesamte mit dem Gewebe verbundene Restblut zu entfernen.Zerkleinern Sie jede Hälfte des Nabelschnurgewebes in 0,5 Kubikzentimeter große Fragmente. Legen Sie die Fragmente mit der leuchtenden Oberfläche nach unten auf die Schale und inkubieren Sie die Schale kurz für 10 Minuten. Am Ende der Inkubation fügen Sie 20 Milliliter Medium mit MEM Alpha-Modifikation sanft an den Seiten der Schale hinzu, die das Nabelschnurgewebe enthält.Stellen Sie sicher, dass die Explantate nicht aus ihrer Ausrichtung entfernt werden, und fügen Sie überschüssiges Medium hinzu, um einen Bruchteil zu berücksichtigen, den die Gewebeexplantationen während der Inkubation aufsaugen. Dann legen Sie das Gericht für drei Tage in den Inkubator. Fügen Sie nach dem Ende der Inkubation frisches Medium in die Kultur ein und stellen Sie sicher, dass die Kulturen vor Stößen und Bewegungen der Explantate geschützt sind, während Sie mit dem Geschirr umgehen.Entfernen Sie nach einer Woche mit sterilen Pinzetten die Gewebefragmente einzeln und entsorgen Sie sie mit geeigneten Biohazard-Beuteln zur Entsorgung. Behalten Sie das vorhandene Medium bei und fügen Sie 10 Milliliter frisches Wachstumsmedium hinzu. Ersetzen Sie das Wachstumsmedium alle vier Tage, bis einzelne Kolonien einen Zusammenfluss von 70% erreichenNachdem Sie die Zellen wie im Manuskript beschrieben gefärbt haben, analysieren Sie die markierten Zellen mittels Durchflusszytometrie und bestimmen Sie den Prozentsatz der CD105 CD90-positiven und CD105-CD73-positiven Zellen.Analysieren Sie CD105-positive und CD34-CD45-negative Zellen separat. Beschichten Sie die Gewebekulturplatte mit 0,01% Kollagen und 20 Mikrogramm pro Milliliter Laminin in PBS und legen Sie sie für mindestens vier Stunden bei Raumtemperatur auf die Wippe. Entfernen Sie nach der Inkubation das Kollagen und waschen Sie die Platte mit PBS, dann die uMSCs mit einer Dichte von 10.000 Zellen pro Quadratzentimeter im Wachstumsmedium.Sobald die Zellen eine Konfluenz von 70% erreicht haben, saugen Sie das Wachstumsmedium ab und spülen Sie die Kulturplatte zweimal mit PBS ab. Um die Kinetik der myogenen Progression zu bestimmen, fügen Sie den Kulturen jeden zweiten Tag M1-Medium hinzu und analysieren Sie uMSCs auf die Expression von pax7, MyoD, Myogenin und myosin heavy chain an zwei Tagen, vier bis fünf Tagen, sechs bis sieben Tagen bzw. zehn bis vierzehn Tagen. uMSCs zeigen den Ausdruck CD105 und CD90 an und exprimieren keine hämatopoetischen Marker CD34 und CD45.Die uMSCs waren auch positiv für die Expression des uMSCs-Markers CD73, was darauf hindeutet, dass die uMSCs mehrere Schlüsselmarker exprimierten. uMSCs zeigten eine Expression von pax7 innerhalb der ersten zwei Tage nach der Zugabe von M1, gefolgt von einer MyoD-Expression innerhalb der ersten vier Tage nach der M1-Addition. Die Zellen exprimieren das Myogeninprotein nach sechs Tagen der Differenzierung, gefolgt von der Expression der Myosin-schweren Kette zwischen 10 Tagen und 14 Tagen nach der Induktion der Differenzierung.970 Gene wurden als Reaktion auf die Induktion der myogenen Differenzierung im Vergleich zu den undifferenzierten uMSCs hochreguliert. Mehr myogene Gene wurden in aus Nabelschnurgewebe gewonnenen uMSCs im Vergleich zu aus Nabelschnurblut gewonnenen uMSCs hochreguliert. Sowohl das Nabelschnurgewebe als auch das Nabelschnurblut zeigten eine Regulierung von Genen, die mit zytoskelettalen Proteinen verwandt sind, die mit der Aktinbindung und Sarkomerassemblierung assoziiert sind, Transporter, die mit kontraktiler Funktion, Muskelmasseerhaltung, Kalziumsignalisierung und enzymatischer Funktion assoziiert sind.Sammeln Sie das Gewebe unter aseptischem Zustand und pflegen Sie eine sterile Kultur. Die Schnur sollte extern mit 70% Ethanol gefegt und so schnell wie möglich verarbeitet werden. Viele regenerative Therapien erfordern eine große Anzahl von Zellen aus frühen Passagen.Es kann auch als Modell verwendet werden, um die gesamte trockene Umgebung nachzuahmen und den postnatalen Stoffwechsel widerzuspiegeln.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Isolation of Human Mesenchymal Stem Cells and their Cultivation on the Porous Bone Matrix

Isolierung von humanen mesenchymalen Stammzellen und deren Anbau an der porösen Knochenmatrix

Mesenchymal stem cells (MSCs) have a differentiation potential towards osteoblastic lineage when they are stimulated with soluble factors or specific ...

Forschung

Entwicklungsbiologie

Isolation and Quantitative Immunocytochemical Characterization of Primary Myogenic Cells and Fibroblasts from Human Skeletal Muscle

Isolierung und Charakterisierung von Quantitative Immunzytochemische Primäre myogenen Zellen und Fibroblasten aus menschlichen Skelettmuskel

The repair and regeneration of skeletal muscle requires the action of satellite cells, which are the resident muscle stem cells. These can be isolated ...

Analysis of Zebrafish Larvae Skeletal Muscle Integrity with Evans Blue Dye

Analyse von Zebrafisch-Larven Skelettmuskel Integrität mit Evans Blue Dye

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders.  In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle ...

Isolation and Expansion of Mesenchymal Stem/Stromal Cells Derived from Human Placenta Tissue

Isolierung und Expansion von mesenchymalen Stamm- / Stroma-Zellen aus humanen Placenta Gewebe gewonnen

Mesenchymal stem/stromal cells (MSC) are promising candidates for use in cell-based therapies. In most cases, therapeutic response appears to be cell-dose ...

Isolation and Characterization of Mesenchymal Stromal Cells from Human Umbilical Cord and Fetal Placenta

Isolierung und Charakterisierung von mesenchymalen Stromazellen aus Nabelschnur und Fetal Placenta

The human umbilical cord (UC) and placenta are non-invasive, primitive and abundant sources of mesenchymal stromal cells (MSCs) that have increasingly ...

In Vitro Differentiation of Human Mesenchymal Stem Cells into Functional Cardiomyocyte-like Cells

In Vitro Differentiation of Human Mesenchymal Stem Cells into Functional Cardiomyocyte-like Cells

In-vitro- Differenzierung humaner mesenchymaler Stammzellen in funktionellen Cardiomyocyte-ähnlichen Zellen

Myocardial infarction and the subsequent ischemic cascade result in the extensive loss of cardiomyocytes, leading to congestive heart failure, the leading ...

Isolation of Endothelial Progenitor Cells from Human Umbilical Cord Blood

Isolierung der endothelialen Vorläuferzellen aus menschlichen Nabelschnurblut

The existence of endothelial progenitor cells (EPCs) in peripheral blood and its involvement in vasculogenesis was first reported by Ashara and ...

Identification of Skeletal Muscle Satellite Cells by Immunofluorescence with Pax7 and Laminin Antibodies

Kennung des skelettartigen Muskels Satellitenzellen durch Immunfluoreszenz mit Pax7 und Laminin-Antikörper

Immunofluorescence is an effective method that helps to identify different cell types on tissue sections. In order to study the desired cell population, ...

Derivation and Differentiation of Canine Ovarian Mesenchymal Stem Cells

Ableitung und Differenzierung von Eckzahn Eierstock mesenchymalen Stammzellen

Interest in mesenchymal stem cells (MSCs) has increased over the past decade due to their ease of isolation, expansion, and culture. Recently, studies ...