Name: generation of mesenchymal stem cells from human umbilical cord tissue and their differentiation into the skeletal muscle lineage
Uploaded: 2022-08-31T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Generation of Mesenchymal Stem Cells from Human Umbilical Cord Tissue and their Differentiation into the Skeletal Muscle Lineage at JoVE.com

Sayın Ojas Tikoo'ya film çekimi ve video prodüksiyonu konusundaki yardımları için teşekkür ederiz. Ayrıca, Gurugram Sivil Hastanesi'ndeki GARBH-Ini (İleri Araştırma ve Doğum Sonuçları Disiplinlerarası Grup-DBT Hindistan) personelinden, hemşirelerinden ve kıdemli araştırma görevlilerinden ve Dr. Pallavi Kshetrapal'dan lojistik konusunda yardım için alınan yardımı da kabul ediyoruz. Bu çalışma, Hindistan Biyoteknoloji Bölümü'nden Suchitra Gopinath'a verilen hibelerle desteklenmiştir (BT/09/IYBA/2015; BT/PR29599/PFN/20/1393/2018).

Bu çalışmada göbek kordonu dokusunun kullanımı Kök Hücre Araştırmaları Kurumsal Komitesi (IC-SCR), Kurumsal Etik Komitesi, Translasyonel Sağlık Bilim ve Teknoloji Enstitüsü (IEC-THSTI), Sivil Hastane Kurumsal Etik Komitesi, Gurugram, Haryana ve Kurumsal Biyogüvenlik Komitesi, THSTI tarafından onaylanmıştır. İnsan kordon dokusu örnekleri, doğum sırasında term doğumlardan toplandı. Deneklerden bilgilendirilmiş yazılı onam alınmıştır. Tüm yöntemler ilgili kılavuz ve yönetmeliklere uygun...

<ol>
	<li>Kuroda, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unique+multipotent+cells+in+adult+human+mesenchymal+cell+populations.">Unique multipotent cells in adult human mesenchymal cell populations.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (19), 8639-8643 (2010).</li><li>Troyer, D. L., Weiss, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wharton's+jelly-derived+cells+are+a+primitive+stromal+cell+population.">Wharton's jelly-derived cells are a primitive stromal cell population.</a> Stem Cells. 26 (3), 591-599 (2008).</li><li>Karahuseyinoglu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biology+of+stem+cells+in+human+umbilical+cord+stroma:+In+situ+and+in+vitro+surveys.">Biology of stem cells in human umbilical cord stroma: In situ and in vitro surveys.</a> Stem Cells. 25 (2), 319-331 (2007).</li><li>Kita, K., Gauglitz, G. G., Phan, T. T., Herndon, D. N., Jeschke, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+mesenchymal+stem+cells+from+the+sub-amniotic+human+umbilical+cord+lining+membrane.">Isolation and characterization of mesenchymal stem cells from the sub-amniotic human umbilical cord lining membrane.</a> Stem Cells and Development. 19 (4), 491-502 (2010).</li><li>Sarugaser, R., Lickorish, D., Baksh, D., Hosseini, M. M., Davies, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+umbilical+cord+perivascular+(HUCPV)+cells:+A+source+of+mesenchymal+progenitors.">Human umbilical cord perivascular (HUCPV) cells: A source of mesenchymal progenitors.</a> Stem Cells. 23 (2), 220-229 (2005).</li><li>Mishra, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Umbilical+cord+tissue+is+a+robust+source+for+mesenchymal+stem+cells+with+enhanced+myogenic+differentiation+potential+compared+to+cord+blood.">Umbilical cord tissue is a robust source for mesenchymal stem cells with enhanced myogenic differentiation potential compared to cord blood.</a> Scientific Reports. 10 (1), 18978 (2020).</li><li>Lu, L. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+human+umbilical+cord+mesenchymal+stem+cells+with+hematopoiesis-supportive+function+and+other+potentials.">Isolation and characterization of human umbilical cord mesenchymal stem cells with hematopoiesis-supportive function and other potentials.</a> Haematologica. 91 (8), 1017-1026 (2006).</li><li>Seshareddy, K., Troyer, D., Weiss, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Method+to+isolate+mesenchymal-like+cells+from+Wharton's+Jelly+of+umbilical+cord.">Method to isolate mesenchymal-like cells from Wharton's Jelly of umbilical cord.</a> Methods in Cell Biology. 86, 101-119 (2008).</li><li>Sotiropoulou, P. A., Perez, S. A., Salagianni, M., Baxevanis, C. N., Papamichail, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+the+optimal+culture+conditions+for+clinical+scale+production+of+human+mesenchymal+stem+cells.">Characterization of the optimal culture conditions for clinical scale production of human mesenchymal stem cells.</a> Stem Cells. 24 (2), 462-471 (2006).</li><li>Yoon, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+explant-derived+and+enzymatic+digestion-derived+MSCs+and+the+growth+factors+from+Wharton's+jelly.">Comparison of explant-derived and enzymatic digestion-derived MSCs and the growth factors from Wharton's jelly.</a> BioMed Research International. 2013, 428726 (2013).</li><li>Ishige, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+mesenchymal+stem+cells+derived+from+arterial,+venous,+and+Wharton's+jelly+explants+of+human+umbilical+cord.">Comparison of mesenchymal stem cells derived from arterial, venous, and Wharton's jelly explants of human umbilical cord.</a> International Journal of Hematology. 90 (2), 261-269 (2009).</li><li>Chal, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+of+pluripotent+stem+cells+to+muscle+fiber+to+model+Duchenne+muscular+dystrophy.">Differentiation of pluripotent stem cells to muscle fiber to model Duchenne muscular dystrophy.</a> Nature Biotechnology. 33 (9), 962-969 (2015).</li></ol>

Kritik adımlar Bu protokoldeki kritik bir adım, tüm yayılma süresi boyunca, doğum anından steril kültürlerin bakımına kadar aseptik koşullar altında dokunun toplanmasıdır. Kordon toplama sırasında, kordonun sterilize edilmemiş herhangi bir yüzeye temas etmemesi ve antibiyotik takviyeli PBS içeren tüplerde toplanmadan önce% 70 etanol ile harici olarak temizlenmesi esastır. uMSC izolasyonu için kordon toplanması ve dokunun işlenmesi arasındaki süreyi sınırlamak önemlidir. ...

İnsan göbek kordonunun, sağlam proliferasyon ve farklılaşma oranları, immünomodülatör özellikleri ve üç germ katmanının hepsinden hücre üretme yetenekleri nedeniyle şu anda rejeneratif tedaviler için araştırılmakta olan sağlam bir mezenkimal kök hücre rezervuarına sahip olduğu düşünülmektedir1. Göbek kordonu dokusu, göbek kordonu kanı, göbek damarı subendoteli ve Wharton'un jölesi (WJ) gibi kendi içinde üç belirsiz bölgeyi kapsayan çoklu bölmelerden oluşur - perivasküler bölge, intervasküler bölge ve alt amniyon veya kordon astarı (CL)2. uMSC'ler tüm bu farklı bölgelerden izole edilebilse ve anahtar MSC belirteçlerini geniş çapta ifade edebilse de, bu bölmelerin aynı uMSC popülasyonunu içerip içermediği veya farklılaşma potansiyellerinde farklılıklar gösterip göstermediği konusunda netlik yoktur3. Bu nedenle, uMSC'lerin izolasyonu için protokoller, izolasyon modlarında ve bölgelerinde daha büyük bir hassasiyet, farklılaşma potansiyellerinin sağlam karakterizasyonu ve son olarak, kablonun farklı bölmelerinden karşılaştırmalı bir analiz gerektirir. 
Bu bağlamda, az sayıda çalışma, kordonun farklı kısımları arasındaki uMSC proliferatif ve farklılaştırıcı potansiyellerinde farklılıklar göstermiştir. Bunlardan CL ve WJ bölgelerinden izole edilen uMSC'ler arasındaki karşılaştırmalı analizler, CL kaynaklı uMSC'lerde daha büyük bir proliferatif potansiyel ortaya koymuştur 3,4. Ayrı bir çalışmada, WJ kaynaklı uMSC'ler, proliferasyon tahlillerinde perivasküler hücrelere (HUCPV) kıyasla daha iyi performans göstermiştir5. Kordon kanı kaynaklı uMSC'ler ile vasküler kontaminasyondan yoksun kordon dokusu kaynaklı uMSC'ler arasındaki farkların incelenmesinde, iki bölme arasında anahtar MSC belirteçlerinin diferansiyel ekspresyonunun yanı sıra kordon dokusundan türetilmiş uMSC'lerde proliferasyon oranlarının arttığı bildirilmiştir6.
uMSC'lerin öncelikle osteojenik, adipojenik ve kondrojenik soylar gibi mezoderm soyunun dokularına farklılaşma potansiyellerini inceleyen çeşitli çalışmalardan çok azı, miyojenik farklılaşma ve müteakip karakterizasyon için ayrıntılı protokollerin yanı sıra çeşitli kordon bölmeleri arasındaki karşılaştırmalı analizler sağlamıştır. Bu bağlamda sağlam bir kas farklılaşma protokolü geliştirdik ve kordon dokusu kaynaklı uMSC'lerin kordon kanı6'ya kıyasla daha üstün miyojenik farklılaşma yetenekleri gösterdiğini gözlemledik. Burada, uMSC'lerin vaskülatür ile ilişkili hücrelerden yoksun tüm kordon dokusundan izolasyonu, karakterizasyonu ve miyojenik soya farklılaşması için kademeli bir protokol detaylandırılmıştır.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>4&#39;,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>D1306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amphotericin B</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A2411</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic solution 100x Liquid, endotoxin tested (10,000 U Penicillin and 10 mg Streptomycin/mL in 0.9% normal saline)</td>
			<td>HiMedia</td>
			<td>A001A-50mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-GAPDH antibody</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G8795</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-MyHC antibody (My32)</td>
			<td>Novus Biologicals</td>
			<td>NBP2-50401AF647</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-MyoD antibody (5.8A)</td>
			<td>Novus Biologicals</td>
			<td>NB100-56511</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Myogenin antibody (Clone F5D)</td>
			<td>Novus Biologicals</td>
			<td>NBP2-34616AF594</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Pax7 antibody</td>
			<td>DSHB</td>
			<td>DSHB-C1-576</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC Mouse anti-human CD90 clone 5E10</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>559869</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen Type 1</td>
			<td>Merck</td>
			<td>C8919</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D (+) Glucose</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G7021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dexamethasone</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>D4902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACSCanto II or FACSAria III</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum, qualified Brazil</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>10270106</td>
			<td>not to be heat-inactivated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC Mouse anti-human CD106 clone 51-10C9</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>551146</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC Mouse anti-human CD14 clone M5E2</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>557153</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC Mouse anti-human CD31 clone WM59</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>557508</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC Mouse anti-human CD34 clone 581</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>555821</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC Mouse anti-human CD45 clone HI30</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>555482</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC Mouse anti-human CD49D clone 9F10</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>560840</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC Mouse anti-human CD90 clone 5E10</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>555595</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC Mouse anti-human HLA-A,B,C clone G46-2.6</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>557348</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC Mouse anti-human IgG clone G18-145</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>555786</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FlowJo software</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamicin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G1264</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horse serum</td>
			<td>HiMedia</td>
			<td>RM1239</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrocortisone</td>
			<td>Merck</td>
			<td>H4001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminin</td>
			<td>Merck</td>
			<td>L2020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM Alpha Modification without L-glutamine, ribo- and deoxyribonucleosides</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30568.FS</td>
			<td>Basal medium for uMSCs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE Mouse anti-human CD105 clone 266</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>560839</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE Mouse anti-human CD44 clone 515</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>550989</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE Mouse anti-human CD49E clone llA1</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>555617</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE Mouse anti-human IgG clone G18-145</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>555787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE-Cy7 Mouse anti-human CD73 CLONE AD2</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>561258</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline (PBS), pH=7.4</td>
			<td>HiMedia</td>
			<td>M1866</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin/EDTA solution (1x 0.25% Trypsin and 0.02% EDTA in Hanks Balanced Salt Solution (HBSS)</td>
			<td>HiMedia</td>
			<td>TCL049-100mL</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation of mesenchymal stem cells from human umbilical cord tissue and their differentiation into the skeletal muscle lineage

Mezenkimal kök hücrelerin terapötik potansiyelini araştırmak, izolasyonun kolaylığına, farklılaşmaya yönelik potansiyele ve kaynağın güvenilirliğine ve sağlamlığına bağlıdır. Burada, mezenkimal kök hücrelerin insan göbek kordonu dokusundan (uMSC'ler) izolasyonu, immünofenotiplenmesi ve bu kültürlerin birkaç pasaj üzerinde yayılması için kademeli bir protokol tarif ediyoruz. Bu prosedürde, enzimatik sindirim olmadığı için uMSC'lerin yaşayabilirliği yüksektir. Ayrıca, göbek kordonu arterleri ve damar dahil olmak üzere kan damarlarının çıkarılması, endotel kökenli hücrelerin kirlenmemesini sağlar. Akış sitometrisi kullanılarak, izolasyon üzerine uMSC'ler CD45-CD34-'dür ve hematopoetik soydan hücrelerin yokluğunu gösterir. Önemli olarak, anahtar yüzey işaretleyicilerini, CD105, CD90 ve CD73'ü ifade ederler. Kültürlerin kurulmasından sonra, bu yazıda bu uMSC'lerde iskelet kası soyuna farklılaşmayı indüklemek için etkili bir yöntem açıklanmaktadır. Diferansiye uMSC'lerde miyojenik progresyonun ayrıntılı bir analizi, uMSC'lerin farklılaşmanın ilk aşamalarında miyojenik progenitörler için bir belirteç olan Pax7'yi, ardından MyoD ve Myf5'in ekspresyonunu ve son olarak bir terminal farklılaşma belirteci olan miyozin ağır zincirini (MyHC) ekspresyonunu ifade ettiğini ortaya koymaktadır.

uMSC'lerin kordon dokusundan izole edilmesinin başarısı, tam kordon kanından elde edilen zayıf başarı oranlarının aksine% >95'tir. uMSC'lerin başarılı bir şekilde izole edilmesi üzerine, FACS analizi tüm hücrelerin CD34-CD45-CD105 + CD90 + olduğunu ortaya koymaktadır. Bununla birlikte, karşılaştırmalı analizde, kordon kanından izole edilen uMSC'ler, hücrelerin bir kısmının CD34 + CD45 + CD105 + (~% 15) gösterdiği heterojen pop...

Watch this Scientific Journal Video about Generation of Mesenchymal Stem Cells from Human Umbilical Cord Tissue and their Differentiation into the Skeletal Muscle Lineage at JoVE.com

Generation of Mesenchymal Stem Cells from Human Umbilical Cord Tissue and their Differentiation into the Skeletal Muscle Lineage

Mezenkimal kök hücrelerin insan göbek kordonu dokusundan izolasyonu ve iskelet kası soyuna farklılaşması için bir protokol tanımladık.

İnsan Göbek Kordonu Dokusundan Mezenkimal Kök Hücrelerin Üretimi ve İskelet Kas Soyuna Farklılaşması

Exploring the therapeutic potential of mesenchymal stem cells is contingent upon the ease of isolation, potency toward differentiation, and the ...

Mezenkimal kök hücreyi insan göbek kordonu dokusundan izole etmek için protokolümüzü ve bunları iskelet kası soyuna ayırmak için sağlam bir yöntemi tarif ediyoruz. Bu teknik, yüksek canlılığa ve ısıya sahip mezenkimal kök hücreleri, endotel kökenli hücrelerin kontaminasyonu çok az veya hiç kirlenmeden izole etmemizi ve bu hastalıklarda miyojenik farklılaşmayı etkili bir şekilde indüklememizi sağlar. Kordon burulması ve mukoid kıvamı, kablonun tutulmasını zorlaştırır.Kordonun nasıl işleneceğini, Wharton'un jölesini kazımamayı ve endotel hücrelerini popülasyondan dışlamayı gösteriyoruz. Kordon dokusunu teslim zamanında topladıktan sonra, kordon dokusu parçasını toplama tüpünden 10 santimetrekarelik doku kültürü ile işlenmiş bir kaba aktarın ve dokuyu taze PBS ile iyice yıkayın. Kordon burulması ve mukoid yüzeye dikkat etmek için, bir elde tutulan bir çift forseps ile dokuyu sabitleyin.Bir neşter kullanarak, iki yarım silindirik parça elde etmek için kordon dokusunu uzunlamasına erişimi boyunca dikey olarak dilimleyin. Bu noktada, göbek damarlarını ve damarlarını gözlemleyin. Bir neşter kullanarak, kan damarlarını yüzeyden bir yönde kazıyarak çıkarın ve dokuyla ilişkili tüm artık kanı çıkarmak için kordon dokusunu PBS'de durulayın.Kordon dokusunun her yarısını 0,5 santimetreküp büyüklüğünde parçalara ayırın. Parçaları, ışıklı yüzeyi çanağın üzerine bakacak şekilde yerleştirin ve tabağı 10 dakika boyunca kısaca inkübe edin. Kuluçkanın sonunda, kordon dokusunu içeren kabın kenarları boyunca yavaşça MEM Alpha modifikasyonu içeren 20 mililitre ortam ekleyin.Eksplantların oryantasyonlarından ayrılmadığından emin olun ve doku eksplantlarının kuluçka sırasında emeceği bir kısmı hesaba katmak için fazla ortam ekleyin. Sonra tabağı üç gün boyunca inkübatöre yerleştirin. Kuluçkanın bitiminden sonra, kültüre taze ortam ekleyin ve yemeklerle uğraşırken kültürlerin şoklardan ve eksplantların hareketlerinden korunmasını sağlayın.Bir hafta sonra, steril forseps kullanarak, doku parçalarını tek tek çıkarın ve bertaraf için uygun biyolojik tehlike torbaları kullanarak atın. Mevcut ortamı koruyun ve 10 mililitre taze büyüme ortamı ekleyin. Bireysel koloniler %70'lik bir birleşime ulaşana kadar her dört günde bir büyüme ortamını değiştirin Makalede açıklandığı gibi hücreleri boyadıktan sonra, etiketli hücreleri akış sitometrisi ile analiz edin ve CD105 CD90 pozitif ve CD105 CD73 pozitif hücrelerin yüzdesini belirleyin.CD105 pozitif ve CD34 CD45 negatif hücreleri ayrı ayrı analiz edin. Doku kültürü plakasını PBS'de% 0.01 kollajen vemililitre laminin başına 20 mikrogram ile kaplayın ve oda sıcaklığında en az dört saat boyunca rocker'ın üzerine yerleştirin. Kuluçkadan sonra, kollajeni çıkarın ve plakayı PBS ile yıkayın, ardından uMSC'leri büyüme ortamında santimetrekare yoğunluğu başına 10.000 hücrede plakalayın.Hücreler% 70 akıcılığa ulaştığında, büyüme ortamını aspire edin ve kültür plakasını PBS ile iki kez durulayın. Miyojenik progresyonun kinetiğini belirlemek için, kültürlere her gün M1 ortamı ekleyin ve sırasıyla iki gün, dört ila beş gün, altı ila yedi gün ve on ila on dört günde pax7, MyoD, miyogenin ve miyozin ağır zincirinin ekspresyonu için uMSC'leri analiz edin. uMSC'ler CD105 ve CD90 ekspresyonunu görüntüler ve CD34 ve CD45 hematopoetik belirteçlerini eksprese etmez.uMSC'ler, uMSC'lerin CD73 işaretleyicisinin ekspresyonu için de pozitifti, bu da uMSC'lerin birden fazla anahtar belirteci ifade ettiğini gösteriyordu. uMSC'ler, M1 ilavesinin ilk iki günü içinde pax7 ekspresyonunu gösterdi, bunu M1 ilavesinin ilk dört günü içinde MyoD ekspresyonu izledi. Hücreler altı günlük farklılaşmada miyojenin proteinini eksprese eder, bunu takiben farklılaşma indüksiyonunun 10 gün ila 14 günü arasında miyozin ağır zincirinin ekspresyonu gelir.Diferansiye edilmemiş uMSC'lere kıyasla miyojenik farklılaşmanın indüksiyonuna yanıt olarak 970 gen yukarı regüle edildi. Kordon dokusundan türetilmiş uMSC'lerde, kordon kanı kaynaklı uMSC'lere kıyasla daha fazla miyojenik gen yukarı regüle edildi. Hem kordon dokusu hem de kordon kanı, aktin bağlama ve sarkomer montajı ile ilişkili sitoiskelet proteinleri ile ilişkili genlerin regülasyonunu, kontraktil fonksiyonla ilişkili taşıyıcıları, kas kütlesini korumayı, kalsiyum sinyallemesini ve enzimatik fonksiyonu gösterdi.Dokuyu aseptik durumda toplayın ve steril kültürü koruyun. Kordon dışarıdan% 70 etanol ile süpürülmeli ve mümkün olduğunca hızlı işlenmelidir. Birçok rejeneratif tedavi, erken pasajlardan çok sayıda hücre gerektirir.Ayrıca tüm kuru ortamı taklit etmek ve doğum sonrası metabolizmayı yansıtmak için bir model olarak da kullanılabilir.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Isolation of Human Mesenchymal Stem Cells and their Cultivation on the Porous Bone Matrix

İnsan Mezenkimal Kök Hücre İzolasyonu ve Gözenekli Kemik Matrix kendi Yetiştirme

Mesenchymal stem cells (MSCs) have a differentiation potential towards osteoblastic lineage when they are stimulated with soluble factors or specific ...

Gelişim Biyolojisi

Isolation and Quantitative Immunocytochemical Characterization of Primary Myogenic Cells and Fibroblasts from Human Skeletal Muscle

İnsan İskelet Kası İlköğretim andMyogenic Hücreleri ve Fibroblast İzolasyon ve Kantitatif İmmünositokimyasal Karakterizasyonu

The repair and regeneration of skeletal muscle requires the action of satellite cells, which are the resident muscle stem cells. These can be isolated ...

Analysis of Zebrafish Larvae Skeletal Muscle Integrity with Evans Blue Dye

Evans Blue Dye ile Zebra balığı Larva İskelet Kası Bütünlüğü Analizi

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders.  In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle ...

Isolation and Expansion of Mesenchymal Stem/Stromal Cells Derived from Human Placenta Tissue

İnsan Plasenta Doku türetilen İzolasyon ve mezenkimal kök Genişleme / Stromal hücreler

Mesenchymal stem/stromal cells (MSC) are promising candidates for use in cell-based therapies. In most cases, therapeutic response appears to be cell-dose ...

Isolation and Characterization of Mesenchymal Stromal Cells from Human Umbilical Cord and Fetal Placenta

İnsan göbek bağı ve fetal plasentadan Mezenkimal Stromal Hücre İzolasyonu ve Vasıflandırılması

The human umbilical cord (UC) and placenta are non-invasive, primitive and abundant sources of mesenchymal stromal cells (MSCs) that have increasingly ...

In Vitro Differentiation of Human Mesenchymal Stem Cells into Functional Cardiomyocyte-like Cells

In Vitro Differentiation of Human Mesenchymal Stem Cells into Functional Cardiomyocyte-like Cells

Vitro İnsan Mezenkimal Kök hücre farklılaşma fonksiyonel Cardiomyocyte benzeri hücre içine

Myocardial infarction and the subsequent ischemic cascade result in the extensive loss of cardiomyocytes, leading to congestive heart failure, the leading ...

Isolation of Endothelial Progenitor Cells from Human Umbilical Cord Blood

Yalıtım endotelyal Progenitor Hücre insan göbek kordon kanı

The existence of endothelial progenitor cells (EPCs) in peripheral blood and its involvement in vasculogenesis was first reported by Ashara and ...

Identification of Skeletal Muscle Satellite Cells by Immunofluorescence with Pax7 and Laminin Antibodies

Kas iskelet uydu hücreleri tarafından Pax7 ve Laminin antikorlar ile ayirt tanımlaması

Immunofluorescence is an effective method that helps to identify different cell types on tissue sections. In order to study the desired cell population, ...

Derivation and Differentiation of Canine Ovarian Mesenchymal Stem Cells

Türetme ve köpek yumurtalık mezenkimal kök hücre farklılaşma

Interest in mesenchymal stem cells (MSCs) has increased over the past decade due to their ease of isolation, expansion, and culture. Recently, studies ...