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May 4th, 2022
DOI :
May 4th, 2022
•0:05
Introduction
1:12
Tissue Cryo-Pulverization, Lysis, Protein Extraction
3:35
Protein Digestion and Desalting
5:36
Dual-Functional Ti(IV) Simultaneous Enrichment
7:19
Results: Dual-Functional Ti(IV)-IMAC Enrichment and Mass Spectrometry Analysis of Protein N-Glycosylation and Phosphorylation in Pancreatic Tissues
8:37
Conclusion
Transcript
दोहरी कार्यात्मक टाइटेनियम स्थिर धातु आत्मीयता क्रोमैटोग्राफी रणनीति एक ही वर्कफ़्लो में एन-ग्लाइकोपेप्टाइड्स और फॉस्फोपेप्टाइड्स दोनों को समृद्ध कर सकती है, जिससे एक ही विश्लेषण से जैव-आणविक जानकारी बढ़ जाती है। इस संवर्धन का मुख्य लाभ दो पृथक्करण तंत्र हैं, जो डाउनस्ट्रीम मास स्पेक्ट्रोमेट्री विश्लेषण के लिए अलग-अलग अंशों में एन-ग्लाइकोपेप्टाइड्स और फॉस्फोपेप्टाइड्स के एक साथ पृथक्करण को सक्षम करते हैं। इस संवर्धन पद्धति का उपयोग मधुमेह और कैंसर जैसे रोग बायोमार्कर खोज की ओर अग्नाशयी ऊतकों जैसे जटिल जैविक नमूनों में ग्लाइकोसिलेशन और फॉस्फोराइलेशन का पता लगाने में सुधार कर सकता है।
क्योंकि यह विधि स्पिन युक्तियों और सेंट्रीफ्यूजेशन पर निर्भर करती है, इसलिए सेंट्रीफ्यूजेशन गति को नियंत्रित करना महत्वपूर्ण है, और सुनिश्चित करें कि नमूने किसी भी क्लॉगिंग को रोकने के लिए कणों से मुक्त हैं। शुरू करने के लिए, ऊतक पल्वराइज़र के कुछ हिस्सों को पूर्व-ठंडा करें जो अग्नाशयी ऊतकों के संपर्क में आएंगे, अर्थात् कक्ष, पल्वराइज़र और रिकवरी चम्मच, किसी भी स्पैटुला के साथ, पॉलीस्टाइनिन कंटेनर में। अगला, ऊतक के टुकड़ों को पूर्व-ठंडा नमूना धारक में स्थानांतरित करें, और ऊतक में एक तरल नाइट्रोजन जोड़ें जब तक कि वे जमे हुए न हों।
पल्वराइज़र को कक्ष में रखने के बाद, नमूने को कुचलने के लिए पांच से दस बार मैलेट का उपयोग करके इसे हड़ताल करें, फिर कक्ष से पल्वराइज़र को हटा दें और अनुयायी ऊतक पाउडर और टुकड़ों को खुरचें। अगला, कक्ष में एक चम्मच तरल नाइट्रोजन जोड़ें यदि ऊतक पिघलना शुरू हो जाते हैं, और चूर्णीकरण प्रक्रिया को दोहराएं जब तक कि एक ठीक पाउडर प्राप्त न हो जाए और नमूनों को लगभग 100-मिलीग्राम विभाज्य में पूर्व-ठंडा ट्यूबों में विभाजित करें। लाइसिस बफर तैयार करने के बाद, वांछित अंतिम एकाग्रता के 20 गुना के स्टॉक के लिए, 500 माइक्रोलीटर पानी में प्रोटीज और फॉस्फेट अवरोधक में से प्रत्येक की एक गोली को भंग करें, और अंतिम अवरोधक सांद्रता प्राप्त करने के लिए लाइसिस बफर में प्रत्येक अवरोधक के स्टॉक की आवश्यक मात्रा जोड़ें।
ट्यूब में लाइसिस बफर के 600 माइक्रोलीटर जोड़ने के बाद, 800 आरपीएम पर मिलाते हुए 10 मिनट के लिए हीटिंग ब्लॉक में 95 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं, फिर हीटिंग ब्लॉक से नमूनों को हटा दें और उन्हें कमरे के तापमान पर ठंडा होने दें। अगला, 45 सेकंड के लिए 60-वाट ऊर्जा पर नमूनों को सोनीकेट करें, बीच में 30 सेकंड के आराम के साथ 15 सेकंड दालों का उपयोग करें, और चार डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए 3000 गुना जी पर नमूनों को गोली दें। सतह पर तैरनेवाला को वर्षा विलायक की मात्रा के पांच गुना तक जोड़ें।
उदाहरण के लिए, 50% एसीटोन, 49.9% इथेनॉल और 0.1% एसिटिक एसिड युक्त वर्षा विलायक के 1.5 मिलीलीटर के लिए लिसिस बफर के 300 माइक्रोलीटर, फिर 80 डिग्री सेल्सियस पर रात भर ठंडा करें। चार डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए 3000 बार जी पर फिर से नमूने गोली, और सतह पर तैरनेवाला को हटा दें, फिर एक स्पैटुला के साथ तोड़कर गोली धो लें और वर्षा विलायक की समान मात्रा के साथ मिलाएं। सेंट्रीफ्यूजिंग के बाद, हवा 15 मिनट के लिए एक धूआं हुड में नमूना गोली को सूखा देती है, और आगे बढ़ने के लिए तैयार होने तक 80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करती है।
सबसे पहले, 50 मिलीमोलर ट्राइथाइलमोनियम बाइकार्बोनेट बफर और आठ दाढ़ यूरिया युक्त ताजा निर्मित पाचन बफर के 300 माइक्रोलीटर में प्रोटीन गोली को फिर से निलंबित करें। समाधान में प्रोटीन के लिए, पांच मिलीमोलर की अंतिम एकाग्रता में डाइथियोथ्रिटॉल जोड़ें, मिश्रण करें, और एक घंटे के लिए कमरे के तापमान पर कम करें, फिर 15 मिलीमोलर पर अंतिम एकाग्रता में आयोडोसेटामाइड जोड़ें। अंधेरे में 30 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर मिलाएं, और अल्काइलेट करें।
ट्रिप्सिन को 1 से 100 एंजाइम-टू-प्रोटीन अनुपात में जोड़ें, और चार घंटे के लिए इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं, फिर एक दाढ़ से कम के लिए उपयोग किए जाने वाले आठ दाढ़ यूरिया को पतला करने के लिए 50 मिलीमोलर ट्राइथाइलमोनियम बाइकार्बोनेट बफर जोड़ें। 1 से 100 एंजाइम-टू-प्रोटीन अनुपात में ट्रिप्सिन जोड़ने के बाद, रात भर इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं, बाद में ट्राइफ्लोरोएसेटिक एसिड के अलावा पाचन को बुझाते हैं। प्रोटीन शुरू करने के प्रत्येक एक मिलीग्राम के लिए, एसिटोनाइट्राइल के एक मिलीलीटर के साथ एक डीसाल्टिंग कारतूस की स्थिति, और 0.1% ट्राइफ्लोरोएसेटिक एसिड के एक मिलीलीटर के साथ तीन बार, फिर पचे हुए मिश्रण को डीसाल्टिंग कारतूस पर लोड करें, और 0.1% ट्राइफ्लोरोएसेटिक एसिड के एक मिलीलीटर का उपयोग करके मिश्रण को तीन बार धो लें।
अगला, एल्यूट पेप्टाइड्स 60% एसिटोनाइट्राइल और 0.1% फॉर्मिक एसिड समाधान के एक मिलीलीटर का उपयोग करके, फिर केन्द्रापसारक वैक्यूम कंसंट्रेटर का उपयोग करके लगभग 35 डिग्री सेल्सियस पर एल्यूटेड पेप्टाइड्स को सूखा दें जब तक कि विलायक पूरी तरह से वाष्पित न हो जाए। पानी में पेप्टाइड्स को फिर से निलंबित करने के बाद, निर्माता के प्रोटोकॉल के अनुसार पेप्टाइड परख का उपयोग करके पेप्टाइड सांद्रता का अनुमान लगाएं, फिर पेप्टाइड्स को 500-माइक्रोग्राम विभाज्य में विभाजित करें, और पूरी तरह से सूख जाएं। लगभग तीन मिलीग्राम कपास ऊन का वजन करें और इसे एक खाली स्पिन टिप में पैक करें।
टाइटेनियम स्थिर धातु आत्मीयता क्रोमैटोग्राफी सामग्री के एक ग्राम को एक ट्यूब में स्थानांतरित करने के बाद, सामग्री की ज्ञात एकाग्रता में 0.1% ट्राइफ्लोरोएसेटिक एसिड जोड़ें। 20 मिलीग्राम सामग्री को स्थानांतरित करने के लिए एक स्पिन टिप में पर्याप्त घोल जोड़ने के बाद, 0.1% ट्राइफ्लोरोएसेटिक एसिड के 200 माइक्रोलीटर के साथ सेंट्रीफ्यूजिंग करके स्पिन टिप को धो लें। धोने विलायक के 200 माइक्रोलीटर में नमूनों को फिर से निलंबित करें, और स्पिन टिप के माध्यम से प्रवाह करें।
धोने विलायक के साथ सेंट्रीफ्यूजेशन द्वारा स्पिन टिप धोने के बाद, स्पिन टिप को 80% एसिटोनाइट्राइल 0.1 फॉर्मिक एसिड समाधान के 200 माइक्रोलीटर के साथ धो लें, फिर ई 1 और ई 2 के 200 माइक्रोलीटर के साथ पेप्टाइड्स को हटा दें, और प्रत्येक क्षालन का अलग से विश्लेषण करें। ई 3 और ई 4 सॉल्वैंट्स का उपयोग करके क्षालन प्रक्रिया को दोहराएं, और डाउनस्ट्रीम विश्लेषण से पहले उपयुक्त क्षालन अंशों को संयोजित करें। बुनियादी पीएच पर दिए गए ऋण का प्रदर्शन करने से पहले, 2.5% अमोनियम हाइड्रॉक्साइड में 90% एसिटोनिट्राइल के 200 माइक्रोलीटर का उपयोग करके सामग्री को तीन बार स्थिति दें, फिर ई 5 और ई 6 सॉल्वैंट्स के 200 माइक्रोलीटर के साथ पेप्टाइड्स को हटा दें, और पैक टिप का उपयोग करके डीसाल्टिंग के बाद इन एल्यूशन का अलग से विश्लेषण करें।
इसके बाद, एसिटोनाइट्राइल और अमोनियम हाइड्रॉक्साइड की विभिन्न सांद्रता के 200 माइक्रोलीटर के साथ पेप्टाइड्स को एल्यूट करें। बाद में, इन क्षारों को संयोजित करें, और एक पैक टिप का उपयोग करके डीसाल्टिंग के बाद एक नमूना, ई 7 के रूप में विश्लेषण करें। एन-ग्लाइकोसिलेटेड और फॉस्फोराइलेटेड पेप्टाइड्स से एनोटेट किए गए उच्च आत्मविश्वास वाले एमएस / एमएस स्पेक्ट्रा को अग्रदूतों के समृद्ध विखंडन के साथ प्राप्त किया गया था, जिससे पहचान में विश्वास बढ़ रहा था, जैसा कि डेटाबेस-खोज सॉफ्टवेयर द्वारा सौंपा गया था।
पेप्टाइड पहचान प्रत्येक क्षालन अंश पर दोहरी कार्यात्मक टाइटेनियम स्थिर धातु आत्मीयता क्रोमैटोग्राफी स्पिन टिप विधि का उपयोग करके समृद्ध नमूनों से पाए गए थे। अधिकांश ग्लाइकोपेप्टाइड्स पहले चार अंशों में एल्यूट करते हैं, जबकि अधिकांश फॉस्फोपेप्टाइड्स अंतिम तीन अंशों में एल्यूट करते हैं, आयनीकरण में संभावित हस्तक्षेप को कम करते हैं। दोहरी टाइटेनियम विधि से ग्लाइकोप्रोटिओमिक्स परिणामों की तुलना एर्लिच-ग्लाइकोपेप्टाइड-केवल संवर्धन से की गई थी, यह दर्शाता है कि उनकी रचनाओं के आधार पर छह श्रेणियों में बिनिंग के बाद प्रत्येक प्रकार के ग्लाइकन के अनुपात, दोनों विधियों के बीच समान हैं।
दोहरी टाइटेनियम विधि से फॉस्फोप्रोटिओमिक्स परिणामों की तुलना पारंपरिक स्थिर धातु आत्मीयता क्रोमैटोग्राफी फॉस्फोपेप्टाइड-केवल संवर्धन या दोनों तरीकों का उपयोग करके की गई थी। अधिकांश फॉस्फोराइलेटेड अमीनो एसिड की पहचान सेरीन और थ्रेओनिन के रूप में की गई थी, जिसमें लगभग 1% फॉस्फोराइलेटेड टाइरोसिन थे। चिकनी क्षालन सुनिश्चित करने के लिए स्पिन टिप का ठीक से निर्माण करना महत्वपूर्ण है।
कपास को टिप में दृढ़ता से प्लग करें, ताकि संवर्धन सामग्री को कपास के शीर्ष पर पैक किया जा सके। हमने अधिकांश ऊतकों में ग्लाइकोसिलेशन और फॉस्फोराइलेशन और सार्स-सीओवी-2 स्पाइक प्रोटीन के एक साथ लक्षण वर्णन के लिए दोहरी कार्यात्मक टाइटेनियम आईएमएसी विधि का उपयोग किया है।
पोस्ट-ट्रांसलेशनल संशोधन (पीटीएम) प्रोटीन संरचनाओं और कार्यों को बदलते हैं। कई पीटीएम प्रकारों के एक साथ संवर्धन के तरीके विश्लेषण में कवरेज को अधिकतम कर सकते हैं। हम अग्नाशयी ऊतकों में प्रोटीन एन-ग्लाइकोसिलेशन और फॉस्फोराइलेशन के एक साथ संवर्धन और विश्लेषण के लिए मास स्पेक्ट्रोमेट्री के बाद दोहरी कार्यात्मक टीआई (चतुर्थ) -स्थिर धातु आत्मीयता क्रोमैटोग्राफी का उपयोग करके एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं।
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