Name: mass-rearing and molecular studies in tortricidae pest insects
Uploaded: 2022-03-25T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Mass-Rearing and Molecular Studies in Tortricidae Pest Insects at JoVE.com

Авторы хотели бы отметить поддержку со стороны Исследовательских стипендий японского общества содействия развитию науки (JSPS) для молодых ученых [номер гранта 19J13123 и 21J00895].

1. Сбор насекомых и массовое выращивание
<ol><li>Собирайте тортрицидных насекомых с полей в соответствии с ранее опубликованными ссылками 8,12. ПРИМЕЧАНИЕ: Личинки H. magnanima и A. honmai собирают из поврежденных чайных листьев (рисуно...

<ol>
	<li>Gaston, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+magnitude+of+global+insect+species+richness.">The magnitude of global insect species richness.</a> Conservation Biology. 5 (3), 283-296 (1991).</li><li>Pogue, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+world+revision+of+the+genus+Spodoptera+Guen&#233;e+(Lepidoptera:+Noctuidae).">A world revision of the genus Spodoptera Guen&#233;e (Lepidoptera: Noctuidae).</a> Memoirs of the American Entomological Society. 43, 1 (2002).</li><li>Matsuura, H., Naito, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+on+the+cold-hardiness+and+overwintering+of+Spodoptera+litura+F.+(Lepidoptera:+Noctuidae):+VI.+Possible+overwintering+areas+predicted+from+meteorological+data+in+Japan.">Studies on the cold-hardiness and overwintering of Spodoptera litura F. (Lepidoptera: Noctuidae): VI. Possible overwintering areas predicted from meteorological data in Japan.</a> Applied Entomology and Zoology. 32 (1), 167-177 (1997).</li><li>Mita, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+construction+of+an+EST+database+for+Bombyx+mori+and+its+application.">The construction of an EST database for Bombyx mori and its application.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (24), 14121-14126 (2003).</li><li>Kawamoto, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-quality+genome+assembly+of+the+silkworm,+Bombyx+mori.">High-quality genome assembly of the silkworm, Bombyx mori.</a> Insect Biochemistry and Molecular Biology. 107, 53-62 (2019).</li><li>Fukui, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+masculinizing+function+of+the+Ostrinia+furnacalis+Masculinizer+gene.">In vivo masculinizing function of the Ostrinia furnacalis Masculinizer gene.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 503 (3), 1768-1772 (2018).</li><li>Arai, H., Ishitsubo, Y., Nakai, M., Inoue, M. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+method+to+disperse+eggs+from+lepidopteran+scale-like+egg+masses+and+to+observe+embryogenesis.">A simple method to disperse eggs from lepidopteran scale-like egg masses and to observe embryogenesis.</a> Entomological Science. 25 (1), 12497 (2022).</li><li>vander Geest, L. P., Evenhuis, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Tortricid pests: their biology, natural enemies and control. , (1991).</li><li>Kiuchi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+single+female-specific+piRNA+is+the+primary+determiner+of+sex+in+the+silkworm.">A single female-specific piRNA is the primary determiner of sex in the silkworm.</a> Nature. 509 (7502), 633-636 (2014).</li><li>Rand, M. D., Kearney, A. L., Dao, J., Clason, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Permeabilization+of+Drosophila+embryos+for+introduction+of+small+molecules.">Permeabilization of Drosophila embryos for introduction of small molecules.</a> Insect Biochemistry and Molecular Biology. 40 (11), 792-804 (2010).</li><li>Kageyama, D., Traut, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Opposite+sex-specific+effects+of+Wolbachia+and+interference+with+the+sex+determination+of+its+host+Ostrinia+scapulalis.">Opposite sex-specific effects of Wolbachia and interference with the sex determination of its host Ostrinia scapulalis.</a> Proceedings of the Royal Society B. 271 (1536), 251-258 (2004).</li><li>Arai, H., Lin, S. R., Nakai, M., Kunimi, Y., Inoue, M. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Closely+related+male-killing+and+nonmale-killing+Wolbachia+strains+in+the+oriental+tea+tortrix+Homona+magnanima.">Closely related male-killing and nonmale-killing Wolbachia strains in the oriental tea tortrix Homona magnanima.</a> Microbial Ecology. 79 (4), 1011-1020 (2020).</li><li>Schalamun, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Harnessing+the+MinION:+An+example+of+how+to+establish+long-read+sequencing+in+a+laboratory+using+challenging+plant+tissue+from+Eucalyptus+pauciflora.">Harnessing the MinION: An example of how to establish long-read sequencing in a laboratory using challenging plant tissue from Eucalyptus pauciflora.</a> Molecular Ecology Resources. 19 (1), 77-89 (2019).</li><li>Winnebeck, E. C., Millar, C. D., Warman, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Why+does+insect+RNA+look+degraded.">Why does insect RNA look degraded.</a> Journal of Insect Science. 10 (1), 159 (2010).</li><li>Ivey, C. T., Carr, D. E., Eubanks, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+inbreeding+in+Mimulus+guttatus+on+tolerance+to+herbivory+in+natural+environments.">Effects of inbreeding in Mimulus guttatus on tolerance to herbivory in natural environments.</a> Ecology. 85 (2), 567-574 (2004).</li><li>Saccheri, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inbreeding+and+extinction+in+a+butterfly+metapopulation.">Inbreeding and extinction in a butterfly metapopulation.</a> Nature. 392 (6675), 491-494 (1998).</li><li>Crnokrak, P., Roff, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inbreeding+depression+in+the+wild.">Inbreeding depression in the wild.</a> Heredity. 83 (3), 260-270 (1999).</li><li>Keller, L. F., Waller, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inbreeding+effects+in+wild+populations.">Inbreeding effects in wild populations.</a> Trends in Ecology &amp; Evolution. 17 (5), 230-241 (2002).</li><li>Margaritis, L. H., Kafatos, F. C., Petri, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+eggshell+of+Drosophila+melanogaster.+I.+Fine+structure+of+the+layers+and+regions+of+the+wild-type+eggshell.">The eggshell of Drosophila melanogaster. I. Fine structure of the layers and regions of the wild-type eggshell.</a> Journal of Cell Science. 43 (1), 1-35 (1980).</li><li>Sugimoto, T. N., Ishikawa, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+male-killing+Wolbachia+carries+a+feminizing+factor+and+is+associated+with+degradation+of+the+sex-determining+system+of+its+host.">A male-killing Wolbachia carries a feminizing factor and is associated with degradation of the sex-determining system of its host.</a> Biology Letters. 8 (3), 412-415 (2012).</li></ol>

Tortricid включает в себя несколько сельскохозяйственных и лесных вредителей; в настоящем исследовании представлены методы выращивания черепахи на протяжении поколений, наблюдения за эмбриогенезом и полом насекомых и проведения молекулярного анализа с использованием зрелых эмбрионов.</...

Чешуекрылые насекомые составляют более 10% всех описанных живых видов1, а некоторые виды таксонов наносят серьезный ущерб растениям и серьезные сельскохозяйственные потери 2,3. Хотя молекулярные и генетические исследования были разработаны с использованием модельных насекомых, таких как шелкопряд Bombyx mori 4,5, насекомые-вредители остаются неисследованными, отчасти из-за трудностей с выращиванием и обработкой 6,7. Поэтому необходимы фундаментальные исследования и методы, чтобы понять биологию таких немодельных насекомых-вредителей.
Tortricidae (Lepidoptera), широко известные как tortrix или листовертки, включают в себя множество сельскохозяйственных и лесных вредителей8. Из таксонов насекомых восточный чайный тортрикс Homona magnanima Diakonoff и летний фруктовый тортрикс Adoxophyes honmai Yasuda являются серьезными полифаговыми вредителями, которые, как известно, повреждают чайные деревья в Восточной Азии7. Два вида откладывают плоские и овальные чешуйчатые скопления яиц (или яичные массы), состоящие из тонких, мягких и хрупких яиц, покрытых материнскими выделениями. Хотя стадии эмбриогенеза имеют решающее значение для развития насекомых и определения пола9, структуры яиц препятствуют дальнейшему анализу понимания биологии насекомых. Важно преодолеть трудности для дальнейшего изучения вредителей, яйцекладущих такую сложную яичную массу.
Здесь, чтобы понять биологию тортрицидов, методы массового выращивания, наблюдения и молекулярные исследования были разработаны с использованием A. honmai и H. magnanima. Во-первых, методы массового выращивания поддерживают обоих рубцов более 100 поколений инбредными. Отделение яиц от сцепленной чешуйчатой яичной массы облегчило наблюдение за эмбриогенезом рубцов с использованием щелочных и органических растворителей, ранее разработанных на основе методов, используемых у мух10. Кроме того, в настоящем исследовании установлена дискриминация по признаку пола мелких эмбрионов путем разработки методов окрашивания полового хроматина самок чешуекрылых с использованием молочно-уксусного орцеина11. Комбинируя эти методы, высокое качество и количество нуклеиновых кислот извлекали из эмбрионов, определяемых полом, что в противном случае было трудно установить6. Извлеченная РНК использовалась для секвенирования следующего поколения. В совокупности методы, представленные здесь, применимы к другим чешуекрылым насекомым и другим таксонам насекомых.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1/2 ounce cup</td>
			<td>FP CHUPA</td>
			<td>CP070009</td>
			<td>insect rearing; https://www.askul.co.jp/p/6010417/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1/2 ounce cup lid</td>
			<td>FP CHUPA</td>
			<td>CP070011</td>
			<td>insect rearing; https://www.askul.co.jp/p/6010434/?int_id=recom_DtTogether</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>99.7% acetic acid</td>
			<td>FUJIFILM Wako Chemicals Co., Osaka, Japan</td>
			<td>36289</td>
			<td>fixation; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01ALF036289.html</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent 2100 Bioanalyzer</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>not shown</td>
			<td>Nucleic acids quantification; https://www.agilent.com/en/product/automated-electrophoresis/bioanalyzer-systems/bioanalyzer-instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent RNA6000 nano kit</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>5067-1511</td>
			<td>Nucleic acids quantification; https://www.agilent.com/cs/library/usermanuals/Public/G2938-90034_RNA6000Nano_KG 
			.pdf</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>benzalkonium chloride solution</td>
			<td>Nihon Pharmaceutical Co., Ltd</td>
			<td>No.4987123116046</td>
			<td>Sterilization; https://www.nihon-pharm.co.jp/consumer/products/disinfection.html</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cotton</td>
			<td>AOUME</td>
			<td>8-1611-02</td>
			<td>insect rearing; https://item.rakuten.co.jp/athlete-med/10006937/?scid=af_pc_etc&#38;sc2id=af_113_0_1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI solution</td>
			<td>Dojindo, Tokyo, Japan</td>
			<td>340-07971</td>
			<td>stainings; https://www.dojindo.co.jp/products/D523/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disodium Hydrogenphosphate</td>
			<td>FUJIFILM Wako Chemicals Co.</td>
			<td>4.98748E+12</td>
			<td>Na2HPO4; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0119-0286.html</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dsDNA HS quantification kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>Q33231</td>
			<td>Nucleic acids quantification; https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/Q33230?SID=srch-srp-Q33230</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Econospin RNA II column</td>
			<td>Epoch Life Science Inc.</td>
			<td>EP-11201</td>
			<td>RNA extraction; http://www.epochlifescience.com/Product/SpinColumn/minispin.aspx</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>FUJIFILM Wako Chemicals Co., Osaka, Japan</td>
			<td>4.98748E+12</td>
			<td>fixation; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0105-0045.html</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediamine-N,N,N&#39;,N&#39;-tetraacetic Acid Tetrasodium Salt Tetrahydrate (4NA)</td>
			<td>FUJIFILM Wako Chemicals Co.</td>
			<td>4.98748E+12</td>
			<td>Cell lysis buffer (EDTA); https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01T02N003.html</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glassine paper</td>
			<td>HEIKO</td>
			<td>2100010</td>
			<td>insect rearing; https://www.monotaro.com/p/8927/0964/?utm_id=g_pla&#38; 
			utm_medium=cpc&#38;utm_source= 
			Adw</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>heat block WSC-2620 PowerBLOCK</td>
			<td>ATTO, Tokyo, Japan</td>
			<td>4002620</td>
			<td>incubation; https://www.attoeng.site/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>heptane</td>
			<td>FUJIFILM Wako Chemicals Co., Osaka, Japan</td>
			<td>4.98748E+12</td>
			<td>fixation; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0108-0015.html</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>INSECTA LF</td>
			<td>Nosan Co., Ltd</td>
			<td>not shown</td>
			<td>Artificial diet; https://www.nosan.co.jp/business/fodder/ist.htm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ISOGENII</td>
			<td>Nippon Gene</td>
			<td>311-07361</td>
			<td>RNA extraction; https://www.nippongene.com/siyaku/product/extraction/isogen2/isogen2.html</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>isopropanol</td>
			<td>FUJIFILM Wako Chemicals Co.</td>
			<td>4.98748E+12</td>
			<td>nucleic acids extraction; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0232-0004.html</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lactic acid</td>
			<td>FUJIFILM Wako Chemicals Co.</td>
			<td>4.98748E+12</td>
			<td>Stainings; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0112-0005.html</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>methanol</td>
			<td>FUJIFILM Wako Chemicals Co., Osaka, Japan</td>
			<td>4.98748E+12</td>
			<td>fixation; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0113-0182.html</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MSV-3500 vortex</td>
			<td>Biosan</td>
			<td>BS-010210-TAK</td>
			<td>Voltex mixer; https://biosan.lv/products/-msv-3500-multi-speed-vortex/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nano Photometer NP 80</td>
			<td>Implen</td>
			<td>not shown</td>
			<td>Nucleic acids quantification; https://www.implen.de/product-page/implen-nanophotometer-np80-microvolume-cuvette-spectrophotometer/tech-specs/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Natural pack wide</td>
			<td>Inomata chemical</td>
			<td>1859</td>
			<td>insect rearing; https://www.monotaro.com/g/03035766/?t.q=%E3%83%8A%E3%83%81%E3%83%A5%E3% 
			83%A9%E3%83%AB%E3%83%91% 
			E3%83%83%E3%82%AF%E3%83% 
			AF%E3%82%A4%E3%83%89</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEBNext Ultra II RNA Library Prep Kit for Illumina</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>E7770S</td>
			<td>Library preparation; https://www.nebj.jp/products/detail/2039</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>orcein</td>
			<td>FUJIFILM Wako Chemicals Co.</td>
			<td>4.98748E+12</td>
			<td>Stainings; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0115-0094.html</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>FUJIFILM Wako Chemicals Co.</td>
			<td>160-16061</td>
			<td>fixation; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0116-1606.html</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyoxyethylene(20) Sorbitan Monolaurate</td>
			<td>FUJIFILM Wako Chemicals Co.</td>
			<td>4.98748E+12</td>
			<td>Tween-20; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0116-2121.html</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Portable UV Black Light (4W, 365nm wavelength)</td>
			<td>Southwalker Co., Ltd., Kanagawa, Japan</td>
			<td>not shown</td>
			<td>Insect collection; http://www.southwalker.com/shopping/?pid=1364614057-467328</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride</td>
			<td>FUJIFILM Wako Chemicals Co.</td>
			<td>4.98748E+12</td>
			<td>KCl; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0116-0354.html</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Dihydrogen Phosphate</td>
			<td>FUJIFILM Wako Chemicals Co.</td>
			<td>4.98748E+12</td>
			<td>KH2PO4; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0116-0424.html</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProLong Diamond Antifade Mountant</td>
			<td>Invitrogen, MA, USA</td>
			<td>P36965</td>
			<td>antifade; https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/P36965</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K Solution</td>
			<td>Merck</td>
			<td>71049-4CN</td>
			<td>DNA extraction; https://www.merckmillipore.com/JP/ja/product/Proteinase-K-Solution-600-mAU-ml,EMD_BIO-71049</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>protein precipitation solution</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>158912</td>
			<td>DNA extraction; https://www.qiagen.com/us/products/discovery-and-translational-research/lab-essentials/buffers-reagents/puregene-accessories/?cmpid=PC_DA_NON_ 
			BIOCOMPARE_ProductListing_ 
			0121_RD_MarketPlace_ProductC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit V4</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>Q33238</td>
			<td>Nucleic acids quantification; https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/Q33238</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rifampicin</td>
			<td>FUJIFILM Wako Chemicals Co., Osaka, Japan</td>
			<td>4.98748E+12</td>
			<td>Sterilization; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0118-0100.html</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA HS quantification kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>Q32855</td>
			<td>Nucleic acids quantification; https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/Q32852</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase solution</td>
			<td>Nippon Gene</td>
			<td>313-01461</td>
			<td>RNA extraction; https://www.nippongene.com/siyaku/product/modifying-enzymes/rnase-a/rnase-s.html</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silk Mate 2S</td>
			<td>Nosan Co., Ltd</td>
			<td>not shown</td>
			<td>Artificial diet; https://www.nosan.co.jp/business/fodder/ist.htm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>FUJIFILM Wako Chemicals Co.</td>
			<td>4.98748E+12</td>
			<td>NaCl; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0119-0166.html</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Dodecyl Sulfate</td>
			<td>FUJIFILM Wako Chemicals Co.</td>
			<td>4.98748E+12</td>
			<td>Cell lysis buffer (SDS); https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0119-1398.html</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium hypochlorite aqueous solution</td>
			<td>FUJIFILM Wako Chemicals Co., Osaka, Japan</td>
			<td>4.98748E+12</td>
			<td>egg separation; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0119-0220.html</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetracycline Hydrochloride</td>
			<td>FUJIFILM Wako Chemicals Co., Osaka, Japan</td>
			<td>4.98748E+12</td>
			<td>Sterilization; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0120-1656.html</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-HCl</td>
			<td>FUJIFILM Wako Chemicals Co.</td>
			<td>4.98748E+12</td>
			<td>Cell lysis buffer; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0120-1536.html</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ultra-pure distilled water</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10977023</td>
			<td>RNA extraction; https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/10977015</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

mass-rearing and molecular studies in tortricidae pest insects

Tortricidae (Lepidoptera), широко известные как tortrix или листовертки, включают в себя множество сельскохозяйственных и лесных вредителей, которые вызывают серьезные сельскохозяйственные потери. Чтобы понять биологию таких мотыльков-вредителей, фундаментальные методы были очень востребованы. Здесь методы массового выращивания, наблюдений и молекулярных исследований разрабатываются с использованием двух чайных тортриксов, Homona magnanima и Adoxophyes honmai (Чешуекрылые: Tortricidae). Насекомые массово выращивались с помощью нарезанной искусственной диеты и поддерживались путем инбридинга в течение более 100 поколений, учитывая их биологические особенности. Насекомые имеют различные половые диморфизмы; следовательно, трудно различить пол на развивающихся стадиях, что помешало последующим анализам. В настоящей работе подчеркивается, что пол личинок тортрицидов может быть определен путем наблюдения за яичками или молочно-уксусным окрашиванием орцеина для визуализации женско-специфической W-хромосомы. Кроме того, используя методы определения пола, настоящее исследование позволило экстрагировать нуклеиновые кислоты из эмбрионов, определенных полом, и применять их для секвенирования с высокой пропускной способностью. Эти советы применимы для других насекомых-вредителей и облегчат дальнейшие морфологические и генетические исследования.

Создание хост-линий и их обслуживание Жизнеспособность собранных в полевых условиях личинок по-разному объясняется расположением поля, сезонами и условиями выращивания (например, 90% жизнеспособности на Тайване, Таоюань, как показано в Arai et al.12). Примерно 30%-50% пар ...

Watch this Scientific Journal Video about Mass-Rearing and Molecular Studies in Tortricidae Pest Insects at JoVE.com

Mass-Rearing and Molecular Studies in Tortricidae Pest Insects

Настоящий протокол описывает метод выращивания насекомых-вредителей в лабораториях. Процедуры различения пола насекомых и извлечения нуклеиновых кислот для высокопроизводительного секвенирования установлены с использованием двух вредителей тортрицидов.

Массовое выращивание и молекулярные исследования насекомых-вредителей Tortricidae

Tortricidae (Lepidoptera), commonly known as tortrix or leafroller moths, comprises many agricultural and forestry pests, which cause serious agricultural ...

Мы представляем фундаментальные, но весьма востребованные массы для массового выращивания, наблюдений и молекулярных исследований с использованием серьезных масс вредителей Тортрикса, для изучения их биологии. До сих пор структура яиц насекомых препятствовала дальнейшему анализу. Примечательно, что мы позволили изучить тонкие, мягкие и хрупкие яйцеклетки, покрытые материнской секрецией.Ожидается, что существуют простые методы, которые будут применимы для дальнейших исследований тортрикса, пробования других насекомых и других таксонов. Начните с того, что поместите самку и двух самцов в пластиковый стаканчик объемом 120 миллилитров с листом парафиновой бумаги, чтобы установить линию Matra. Нарежьте примерно 60 граммов искусственных диет с помощью терки для массового выращивания.Поместите яичную массу, наполненную созревшими эмбрионами, на нарезанную искусственную диету в пластиковый контейнер. Поместите парафиновую бумагу на яичную массу с нарезанными диетами. Поместите 15 самцов и 10 самок в пластиковую коробку для спаривания при температуре 25 градусов цельсия.Собирайте яйца каждые пять-семь дней и повторяйте массовые этапы выращивания для каждого поколения. Замочите яичную массу в 1000 микролитрах 1,2% водного раствора гипохлорита натрия в течение 10 минут или в 1000 микролитрах пяти молярных водных растворов гидроксида калия в течение 30 минут для отделения яиц. Вымойте отделенные яйца в 1000 микролитров PBSt.Замочите яйца в массе объемной смеси 500 микролитров 100%гептана и 500 микролитров 4%-ного раствора параформальдегида PBSt. Перемешивайте в течение 10 минут со скоростью 1500 оборотов в минуту с помощью вихревого смесителя. Замочите яйца в смеси из 500 микролитров 100% гептана и 500 микролитров 100% метанола.Перемешивать в течение 10 минут со скоростью 1500 оборотов в минуту. Дважды вымойте яйца 1000 микролитрами 100% метанола и храните их при четырех градусах Цельсия в 100% метаноле. Замочите яйца последовательно в 99% 70% и 50% этаноле и PBSt в течение пяти минут каждый для гидрофилизации.Вымойте яйца PBSt. Погрузите яйца в один микрограмм на миллилитр раствора DAPI в течение пяти минут, а затем дважды вымойте яйца PBS. Замочите яйца в 20 микролитрах 1,25% молочного, уксусного или CN раствора, чтобы визуализировать гетерохроматин до тех пор, пока ядра не проявят ярко-красный цвет.Переложите витражи с помощью пипетки на стеклянную горку, затем заключите их анти-выцветающим реагентом и покровным стеклом. Экстракт личинок Феррата, Амонамагнетама и Adoxophyes honmai из яичных масс с помощью щипцов. Рассекните личинок на стеклянной горке.Зафиксируйте ткани смесью от одного до трех 99,7% аскетической кислоты в 100% метаноле в течение пяти минут. Окрашивайте те, которые имеют вес 1,25% по весу молочным, аскетическим или CN раствором до тех пор, пока ядра не будут окрашены. Определите пол каждого образца, наблюдая за наличием гетерохроматина у самок или отсутствием у самцов под микроскопом.Чтобы извлечь ДНК и РНК из личинок феррата, определяемых полом, объедините 12 личинок феррата мужского или женского пола и добавьте либо буфер лизиса клеток, либо реагенты экстракции РНК в одну трубку размером 1,5 миллилитра. Этапы фиксации, пермеабилизации и окрашивания позволяют визуализировать ядра с помощью раствора DAPI. Молочное, аскетическое или CN окрашивание с использованием рассеченных личинок феррата показало, что самки проявляют гетерохроматин в виде точки, но у самцов отсутствует гетерохроматин.Модифицированные протоколы, использующие спиновую колонку, улучшили качество РНК, производящей от 900 до 1500 нанограммов продукта с соотношением 260 к 200 от 1,9 до 2,1 и соотношением 260 к 280 от 1,9 до 2,3. Коэффициент концентрации РНК для модифицированного протокола был ниже 1,2, что соответствовало требованиям качества для секвенирования следующего поколения. Неповрежденность РНК, извлеченной из половых определяемых личинок феррата с помощью модифицированного протокола, была подтверждена с помощью микрочипового электрофореза.Было подтверждено, что подготовленные библиотеки дают высокую оценку Q 30. Наше послание вносит свой вклад в фундаментальные исследования насекомых и инструменты для борьбы с вредителями. Кроме того, наши протоколы могут быть использованы для оценки эффективных химических пестицидов или межклеточных микробов во время эмбриогенеза.

Research

JoVE Journal

Environment

Application of Two-spotted Spider Mite Tetranychus urticae for Plant-pest Interaction Studies

Application of Two-spotted Spider Mite Tetranychus urticae for Plant-pest Interaction Studies

Применение Два выставления паутинный клещ<em&gt; Tetranychus Urticae</em&gt; Для растений-вредителей взаимодействию исследований

The two-spotted spider mite, Tetranychus urticae, is a ubiquitous polyphagous arthropod herbivore that feeds on a remarkably broad array of species, with ...

Physical, Chemical and Biological Characterization of Six Biochars Produced for the Remediation of Contaminated Sites

Физические, химические и биологических характеристик Шести Biochars Производимые для очистки загрязненных участков

The physical and chemical properties of biochar vary based on feedstock sources and production conditions, making it possible to engineer biochars with ...

Vegetated Treatment Systems for Removing Contaminants Associated with Surface Water Toxicity in Agriculture and Urban Runoff

Системы растительного обогащения для удаления загрязнителей, связанных с токсичностью поверхностных вод в сельском хозяйстве и городском стоке

Urban stormwater and agriculture irrigation runoff contain a complex mixture of contaminants that are often toxic to adjacent receiving waters. Runoff may ...

Methodology for Developing Life Tables for Sessile Insects in the Field Using the Whitefly, Bemisia tabaci, in Cotton As a Model System

Methodology for Developing Life Tables for Sessile Insects in the Field Using the Whitefly, Bemisia tabaci, in Cotton As a Model System

Методология для разработки таблиц продолжительности жизни для скального насекомых в поле с помощью белокрылки, Bemisia tabaci, хлопок как модель системы

Life tables provide a means of measuring the schedules of birth and death from populations over time. They also can be used to quantify the sources and ...

Procedures of Laboratory Fumigation for Pest Control with Nitric Oxide Gas

Процедуры лабораторных фумигации вредителями с газом окиси азота

Nitric oxide (NO) is a newly discovered fumigant for postharvest pest control. This paper provides detailed protocols for conducting NO fumigation on ...

Double-stranded RNA Oral Delivery Methods to Induce RNA Interference in Phloem and Plant-sap-feeding Hemipteran Insects

Методы доставки двуцепочечной РНК Оральный побудить РНК-интерференции в флоэма и членистохоботные насекомых, растений sap питание

Phloem and plant sap feeding insects invade the integrity of crops and fruits to retrieve nutrients, in the process damaging food crops. Hemipteran ...

The Plant Infection Test: Spray and Wound-Mediated Inoculation with the Plant Pathogen Magnaporthe Grisea

The Plant Infection Test: Spray and Wound-Mediated Inoculation with the Plant Pathogen Magnaporthe Grisea

Завод инфекции тест: Спрей и Рана опосредованной прививка с завода возбудителя Magnaporthe мурены

Plants possess a powerful system to defend themselves against potential threats by pathogenic fungi. For agriculturally important plants, however, current ...

Harvesting Venom Toxins from Assassin Bugs and Other Heteropteran Insects

Заготовка Venom токсины от убийца ошибок и других насекомых, Heteropteran

Heteropteran insects such as assassin bugs (Reduviidae) and giant water bugs (Belostomatidae) descended from a common predaceous and venomous ancestor, ...

Experimental Protocol for Examining Behavioral Response Profiles in Larval Fish: Application to the Neuro-stimulant Caffeine

Экспериментальный протокол для изучения поведенческих реакции профили в личинок рыб: Приложение к кофеину нейро стимулятор

Fish models and behaviors are increasingly used in the biomedical sciences; however, fish have long been the subject of ecological, physiological and ...

Generating Homo- and Heterografts Between Watermelon and Bottle Gourd for the Study of Cold-responsive MicroRNAs

Создание гомо - и Heterografts между арбуз и бутылка тыквы для изучения холодной отзывчивым микроРНК

MicroRNAs (miRNAs) are endogenous small non-coding RNAs of about 20 - 24 nt, known to play important roles in plant development and adaptation. There is ...